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Immunology and Infection

माउस वृक्ष के समान सेल सबसेट के अलगाव के लिए एक कुशल और उच्च उपज विधि

Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53824
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Medicine (Rheumatology), Albert Einstein College of Medicine

Abstract

वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) पेशेवर प्रतिजन पेश प्राप्त प्रसंस्करण और प्रतिजन अणुओं पेश टी सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा को आरंभ करने के लिए पर एंटीजन पेश करने के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार कोशिकाओं रहे हैं। वृक्ष के समान कोशिकाओं कई phenotypically और कार्यात्मक विषम सबसेट में विभाजित किया जा सकता है। प्लीहा वृक्ष के समान कोशिकाओं के तीन महत्वपूर्ण सबसेट, plasmacytoid हैं CD8α स्थिति और CD8α Neg कोशिकाओं। plasmacytoid डीसी प्रकार मैं इंटरफेरॉन का प्राकृतिक उत्पादक हैं और विरोधी वायरल टी सेल प्रतिरक्षा के लिए महत्वपूर्ण हैं। CD8α Neg डीसी सबसेट MHC वर्ग द्वितीय प्रतिजन प्रस्तुति के लिए विशेष है और केन्द्र सीडी 4 टी कोशिकाओं भड़काना में शामिल है। CD8α स्थिति डीसी बहिर्जात एंटीजन और CD8 टी सेल भड़काना के पार प्रस्तुति के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार हैं। CD8α स्थिति DCs एक विशेष टी सेल को CD1d अणुओं द्वारा glycolipid एंटीजन की प्रस्तुति पर सबसे कुशल होने के लिए प्रदर्शन किया गया हैएल अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी (iNKT) कोशिकाओं के रूप में जाना जाता आबादी। फ्लाइट 3 ligand के प्रशासन अस्थि मज्जा से वृक्ष के समान सेल progenitors के पलायन की आवृत्ति बढ़ जाती है, अंततः murine मॉडल में परिधीय लसीकावत् अंगों में वृक्ष के समान कोशिकाओं के विस्तार में जिसके परिणामस्वरूप। हम सेल हस्तांतरण प्रयोगों में इस्तेमाल के विभिन्न डीसी सबसेट के vivo प्रवीणता की तुलना करने के लिए कार्यात्मक वृक्ष के समान कोशिकाओं की बड़ी संख्या को शुद्ध करने के लिए इस मॉडल ढाल लिया है।

Introduction

वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) लगभग चालीस साल पहले की खोज 'के रूप में बड़े तारामय (ग्रीक Dendron) सेल "लसीकावत् अंगों 1 में पाए गए। कई अध्ययनों से पता चला है कि डीसी केवल प्रतिजन कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से भोले टी कोशिकाओं 2 को प्रोत्साहित कर सकते हैं। इन कोशिकाओं के एक प्रमुख कार्य तेज और एंटीजन की प्रस्तुति और उनके कुशल प्रसंस्करण और इनमें से लोड हो रहा है प्रतिजन अणुओं पर है। माउस तिल्ली में, डीसी plasmacytoid और पारंपरिक सबसेट में विभाजित किया जा सकता है। plasmacytoid डीसी CD11c की कम अभिव्यक्ति और B220 और जीआर -1 के उच्च स्तर की विशेषता है। उन्होंने यह भी सतह मार्कर mPDCA1 के लिए सकारात्मक रहे हैं और प्रकार मैं रिसेप्टर 9 (TLR9) ligands की तरह टोल के जवाब में इंटरफेरॉन छिपाना। पारंपरिक डीसी CD11c और MHC वर्ग द्वितीय अभिव्यक्ति के लिए उच्च रहे हैं। वे तीन अलग तरह के सीडी 4, CD8α, DEC205, सीडी के रूप में प्ररूपी मार्कर की सतह अभिव्यक्ति के आधार पर सबसेट में विभाजित किया जा सकता है11b और वृक्ष के समान सेल रिसेप्टर निरोधात्मक 2 (DCIR2, 33D1 एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त) प्रोटीन 3,4। CD8α स्थिति DCs भी cDC1 के रूप में जाना जाता है, इस तरह के CD11b और 33D1 के रूप में माइलॉयड मार्करों के लिए DEC205 के लिए सकारात्मक है, लेकिन नकारात्मक हैं। CD8α Neg DCs भी cDC2 कहा जाता है, 33D1, CD11b और सीडी 4 के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन DEC205 की कमी है। डबल नकारात्मक सबसेट (यानी, दोनों सीडी 4 और CD8α के लिए नकारात्मक) अपेक्षाकृत दुर्लभ है, और DEC205 और 33D1 के लिए नकारात्मक है। यह कम से कम विशेषता सबसेट है और CD8α Neg डीसी के एक कम विभेदित रूप हो सकता है।

विभिन्न डीसी सबसेट में प्ररूपी मतभेद भी उनके vivo कार्यों के लिए करता हूं। CD8α Neg डीसी अत्यधिक phagocytic हैं और मुख्य रूप से सीडी 4 टी कोशिकाओं से 3 MHC वर्ग द्वितीय के माध्यम से बहिर्जात प्रतिजन पेश करने के लिए लगा रहे हैं। इसके विपरीत, CD8α स्थिति डीसी MHC वर्ग मैं पर घुलनशील प्रोटीन प्रतिजन की प्रस्तुति के लिए विशेष कर रहे हैंएक तंत्र में पार प्रस्तुति बुलाया। पार प्रस्तुति के परिणाम इन DCs 5 के सक्रियण की स्थिति पर निर्भर करता है, और या तो साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं (CTLs) या नियामक टी कोशिकाओं 6 2,7 के विकास का विस्तार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। , मोटे तौर पर टी कोशिकाओं 8 का विलोपन में विरोधी DEC205-एंटीबॉडी की मध्यस्थता वितरण परिणामों का उपयोग CD8α स्थिति डीसी को प्रतिजन का लक्ष्य निर्धारण जबकि संक्रमित apoptotic कोशिकाओं से व्युत्पन्न एंटीजन की प्रस्तुति एक मजबूत सीटीएल प्रतिक्रिया 9 लाती है।

पेप्टाइड एंटीजन की मान्यता के अलावा, स्तनधारी प्रतिरक्षा प्रणाली लिपिड और glycolipid एंटीजन पहचान करने के लिए विकसित किया गया है। ये एंटीजन CD1 अणु है, जो MHC वर्ग मैं-तरह कोशिका की सतह प्रोटीन है कि विभिन्न स्तनधारियों में कई संबंधित रूपों में मौजूद हैं द्वारा प्रस्तुत कर रहे हैं। चूहों में, अत्यधिक संरक्षित CD1 अणु का एक प्रकार CD1d बुलाया glycolipid एंटीजन 10 की प्रस्तुति के लिए जिम्मेदार है। प्रमुख टी कोशिकाओं है कि पहचान CD1d / glycolipid परिसरों की आबादी अपरिवर्तनीय NKT कोशिकाओं (iNKT कोशिकाओं) कहा जाता है। इन कोशिकाओं को एक अर्द्ध अपरिवर्तनीय टी सेल रिसेप्टर (TCR) एक अपरिवर्तनीय TCRα श्रृंखला है कि TCRβ श्रृंखला है कि विविधता 11 सीमित है के साथ रखा जाता है से बना व्यक्त करते हैं। पारंपरिक टी कोशिकाओं पैदा करना और सक्रिय प्रेरक टी कोशिकाओं बनने के लिए अंतर करने की जरूरत है कि विपरीत, iNKT कोशिकाओं को एक प्रेरक जनसंख्या के रूप में मौजूद हैं और glycolipid प्रशासन 12 के बाद तेजी से जवाब शुरू करते हैं। physiologically प्रासंगिक लिपिड प्रतिजन कोशिकाओं की पहचान अनुसंधान के एक सक्रिय क्षेत्र है, और इस तरह के बी कोशिकाओं, मैक्रोफेज और डीसी के रूप में कई अलग सेल प्रकार इस समारोह में प्रदर्शन करने के लिए सुझाव दिया गया है। हालांकि, यह प्रदर्शन किया गया है कि डीसी के CD8α स्थिति सबसेट प्राथमिक सेल तेज और लिपिड एंटीजन की प्रस्तुति माउस iNKT कोशिकाओं 13 और glycolipid मध्यस्थता सीडी 8 टी कोशिकाओं 14 के पार भड़काना करने के लिए मध्यस्थता है।

ove_content "> विभिन्न प्रतिजन कोशिकाओं द्वारा प्रतिजन प्रस्तुति की क्षमता की तुलना करने के लिए, एक स्पष्ट दृष्टिकोण भोले मेजबान में प्रतिजन के बराबर मात्रा के साथ स्पंदित। शुद्ध APCs इस प्रकार के सेल हस्तांतरण प्रयोगों अक्सर प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं के विभिन्न प्रकार के हस्तांतरण है। हालांकि, पूर्व vivo प्रतिजन इलाज किया डीसी के साथ स्थानांतरण के अध्ययन प्रदर्शन चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि इन कोशिकाओं लसीकावत् अंगों जहां वे कुल 15 कोशिकाओं के कम से कम 2% का गठन में रूप में दुर्लभ आबादी मौजूद है। यह दाता पशुओं में इन कोशिकाओं के विकास को बढ़ाने के लिए इसलिए जरूरी है कि अलगाव प्रोटोकॉल की दक्षता बढ़ाने के लिए।

यह ज्ञात है कि आम लसीकावत् और आम माइलॉयड पूर्वज है, जो पीडीसी, सीडी 8 स्थिति और सीडी 8 Neg डीसी सबसेट, एक्सप्रेस एफएमएस से संबंधित रिसेप्टर tyrosine kinase 3 (फ्लाइट -3) की पीढ़ी के लिए आवश्यक हैं। पर इन विवो फ्लाइट 3 ligand (फ्लाइट 3 एल) प्रशासन, emigratफ्लाइट 3 अस्थि मज्जा से पूर्वज कोशिकाओं को व्यक्त करने के आयन वृद्धि हुई है, परिधीय लसीकावत् अंगों की वृद्धि हुई बोने और उनके परिपक्व डीसी संतान 16 के विस्तार में जिसके परिणामस्वरूप। फ्लाइट -3 की अभिव्यक्ति बी, टी या एन.के. सेल भेदभाव रास्ते के लिए अपनी प्रतिबद्धता के दौरान खो दिया है। इसलिए, केवल न्यूनतम परिवर्तन फ्लाइट 3 एल प्रशासन पर इन कोशिकाओं में मनाया जाता है। डीसी आबादी में इसी प्रकार के विस्तार असर एक B16 मेलेनोमा सेल स्रावित murine फ्लाइट 3L, जो फ्लाइट 3 एल 17,18 के निरंतर प्रणालीगत स्तर प्रदान करने के लिए एक सरल और किफायती तरीका प्रदान करता है लाइन का आरोपण द्वारा उत्पन्न ट्यूमर चूहों में मनाया जाता है। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम फ्लाइट 3 एल स्रावित माउस तिल्ली में सभी सामान्य डीसी सबसेट के विस्तार को प्रोत्साहित करने के लिए, इस प्रकार बहुत इन कोशिकाओं है कि बाद के प्रयोगों के लिए अलग किया जा सकता है की पैदावार बढ़ाने B16-मेलेनोमा कोशिकाओं का प्रत्यारोपण के आधार पर एक प्रोटोकॉल विकसित किया है । 14 दिनों के चमड़े के नीचे आईएम के बाद - हम लगातार कि 10 के भीतर मिलकुल तिल्ली कोशिकाओं के 60% - फ्लाइट 3 स्रावित ट्यूमर का वृक्षारोपण, चूहों का गठन करने के लिए 40 डीसी के रूप में चिह्नित संवर्धन के साथ तिल्ली का बढ़ना विकसित करना। इन spleens से, अलग डीसी सबसेट उच्च शुद्धता मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल शुद्धि किट कि सबसेट विशेष प्ररूपी मार्कर को रोजगार का उपयोग के साथ अलग किया जा सकता है।

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Protocol

पशु प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) से अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाता है। बाँझपन आवश्यकता होती है सभी प्रक्रियाओं एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन कर रहे हैं।

चूहे में B16.Flt3L मेलेनोमा के 1. आरोपण

  1. संस्कृति फ्लाइट -3 व्यक्त B16 मेलेनोमा सेल T25 टिशू कल्चर बोतल में 10% सीओ 2 के साथ पूरा DMEM माध्यम में 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर 37 डिग्री सेल्सियस पर लाइन। 90% संगम (~ 20 घंटा) बढ़ो जब तक कोशिकाओं तक पहुँचने ~।
  2. पाचन trypsin द्वारा कोशिकाओं फसल। महाप्राण सेल संस्कृति मीडिया और पीबीएस के साथ पक्षपाती कोशिकाओं को धो लें। 0.05% trypsin के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। प्रोटीज पाचन बुझाने के लिए ठंडा 20 मिलीलीटर पूरा DMEM मध्यम (4 डिग्री सेल्सियस) भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) युक्त जोड़ें। हल्के से कोशिकाओं से लिफ्ट धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा पीछा किया दोहन।
  3. 300 पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए XG। एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल व्यवहार्यता काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना। पीबीएस में 10 8 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व को Resuspend।
  4. चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा प्रत्यारोपण चूहों (C57BL / 6 या अन्य histocompatible तनाव) ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सेल निलंबन के 100 μl (10 7 कोशिकाओं) के साथ गर्दन के आधार पर Machholz एट अल। 19 से वर्णित है।
  5. फसल कटाई के अंगों के लिए जानवरों को छोड़ने से पहले (12 दिन - - 10, आमतौर पर 7 व्यास में 2 मिमी) ट्यूमर साफ झलक रहा है या दिखाई जब तक विकसित करने के लिए अनुमति दें।

ट्यूमर असर चूहों से प्लीहा एकल कक्ष निलंबन की 2. तैयारी

  1. isoflurane की अधिक मात्रा (> 5% isoflurane के प्रवाह की दर को समायोजित करने और बंद हो जाता है साँस लेने के बाद जारी रखने के लिए जोखिम कम से कम 2 मिनट) के साथ चूहों anesthetize। इच्छामृत्यु के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार ग्रीवा अव्यवस्था से फ्लाइट 3 मेलेनोमा ट्यूमर असर माउस बलिदान।
  2. डिबाँझ कैंची की सहायता से 20 सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर 70% इथेनॉल और फसल तिल्ली के साथ त्वचा sinfect।
  3. तिल्ली जैव सुरक्षा कैबिनेट करने के लिए परिवहन के लिए एक बाँझ पेट्री डिश में रखें। बाँझ शर्तों के तहत यहाँ से सभी चरणों का प्रदर्शन।
  4. एक ताजा पेट्री डिश के लिए तिल्ली स्थानांतरण और RPMI माध्यम से धो लें। छोटे (~ 0.2 सेमी 2) एक छुरी का उपयोग कर टुकड़ों में तिल्ली कट। कोलैजिनेज़ / DNase समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. एक 70 माइक्रोन सेल झरनी पर प्लीहा ऊतक के आंशिक रूप से पच निलंबन डालो। छलनी एक 5 मिलीलीटर सिरिंज सवार का उपयोग कर के जाल के माध्यम से शेष ऊतक टुकड़े सेक।
  6. ताजा माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ जाल फिल्टर धो और फिल्टर त्यागें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र गोली कोशिकाओं।
  7. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और आरबीसी lysis बफर के 2 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend। आर टी एफ पर सेतेया 10 मिनट। पूरा RPMI माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़कर आरबीसी lysis बफर बुझाने।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं। उचित मात्रा में Resuspend सेल छँटाई बफर (जैसे, एमएसीएस) एफसी-ब्लॉक एंटीबॉडी (2.4G2) के 20 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त 10 8 कोशिकाओं / एमएल की सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए।

3. प्लीहा एकल कक्ष निलंबन से Plasmacytoid डीसी, CD8α स्थिति डीसी और CD8α Neg डीसी की शुद्धि

नोट: एकल कक्ष निलंबन से प्लीहा डीसी सबसेट के अलगाव एक बहु कदम प्रक्रिया चित्रा 1 में सचित्र के रूप में है पूर्व ठंडा बफर और एक बर्फ के पानी से स्नान का उपयोग कर 4 में तापमान बनाए रखने के लिए सभी चरणों को पूरा - 8 डिग्री सेल्सियस।। प्रोटोकॉल के निम्नलिखित खंड में सभी अभिकर्मक की मात्रा 10 8 कोशिकाओं / एमएल) पर प्लीहा सेल निलंबन के 200 μl की एक प्रारंभिक निवेश के लिए गणना कर रहे हैं। यह बढ़ाया जा सकता है यानीचे और उसी अनुपात में प्रारंभिक कदम (3.1.1 और 3.2.1) में अन्य अभिकर्मकों (1 एक्स 10 8 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर हमेशा) सेल निलंबन की मात्रा बदलकर अपनी जरूरत के आधार पर। बाद में सभी चरणों को तदनुसार में अभिकर्मक की मात्रा समायोजित करें। उदाहरण के लिए, 1 एक्स 10 8 / मिलीलीटर में प्लीहा सेल निलंबन के 100 μl के साथ शुरू करते हैं, तो सभी चरणों में आधे ने कहा अभिकर्मक की मात्रा का उपयोग करें।

  1. Plasmacytoid डीसी के अलगाव (पीडीसी)
    1. बायोटिन लेबल एंटीबॉडी प्लीहा सेल निलंबन के 200 μl को plasmacytoid डीसी अलगाव किट में प्रदान की कॉकटेल के 300 μl जोड़ें।
    2. अच्छी तरह मिक्स और 15 मिनट के लिए बर्फ के पानी के स्नान में सेते हैं। ट्यूब नल हर 3 मिनट निलंबित कोशिकाओं रखने के लिए, और बाध्यकारी एंटीबॉडी को अधिकतम करने के लिए।
    3. 12 मिलीलीटर सेल बफर छँटाई 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x जी centrifugation द्वारा जोड़ें और गोली कोशिकाओं। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला अपार biotinylated एंटीबॉडी को दूर करने के लिए।
    4. सेल resuspendसेल छँटाई बफर के 500 μl में गोली। विरोधी बायोटिन एंटीबॉडी संयुग्मित मोतियों की 300 μl जोड़ें। दोहराएँ कदम 3.1.2 और 3.1.3।
    5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सेल छँटाई बफर के 2 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend। आरटी पर इस बात पर से सभी चरणों पूर्व ठंडा buffers का उपयोग प्रदर्शन करना।
    6. एक ताजा चुंबकीय सक्रिय सेल चुंबकीय स्टैंड में लोकसभा स्तंभ छँटाई रखें। धो और सेल छँटाई बफर के 5 मिलीलीटर के साथ स्तंभ संतुलित करना।
    7. स्तंभ पर सेल निलंबन पिपेट, स्तंभ बिस्तर की सतह के केंद्र के लिए धीरे इसे लागू करने। के माध्यम से प्रवाह लीजिए।
    8. सेल छँटाई बफर के 10 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो लें। के माध्यम से इस प्रवाह लीजिए और कदम 3.1.7 के माध्यम से प्रवाह के साथ गठबंधन। पीडीसी (FT1) के माध्यम से इस स्तंभ के प्रवाह में समृद्ध कर रहे हैं।
    9. FT1 से कोशिकाओं centrifugation द्वारा 2 मिलीलीटर सेल छँटाई बफर में 4 डिग्री सेल्सियस, resuspend पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर गोली और एक ताजा लोकसभा स्तंभ के माध्यम से कोशिकाओं को पारित3.1.8 - कदम 3.1.6 दोहरा द्वारा। दो अनुक्रमिक स्तंभों का यह प्रयोग अलग कक्षों की पवित्रता बढ़ाया अर्जित करता है।
    10. 2 मिलीलीटर पूरा RPMI के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation, और resuspend द्वारा गोली कोशिकाओं। बर्फ पर रखें जब तक जरूरत है।
  2. CD8α स्थिति और CD8α Neg डीसी के अलगाव
    नोट: इस प्रक्रिया में पहला कदम बी, पीडीसी, टी और एन.के. कोशिकाओं की कमी है।
    1. पूरे तिल्ली सेल निलंबन (2.8 चरण में प्राप्त 10 8 कोशिकाओं / एमएल के 1 मिलीलीटर) के साथ शुरू, बायोटिन संयुग्मित एंटीबॉडी CD8α स्थिति डीसी अलगाव किट में प्रदान की कॉकटेल के 100 μl जोड़ें।
    2. अच्छी तरह मिक्स और 15 मिनट के लिए बर्फ के पानी के स्नान में सेते हैं। अपने लक्ष्य कोशिकाओं को बायोटिन लेबल एंटीबॉडी के बंधन को अधिकतम करने के लिए ट्यूब धीरे हर 3 मिनट टैप करें।
    3. 12 मिलीलीटर सेल बफर छँटाई 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा जोड़ें और गोली कोशिकाओं। महाप्राण सुपरअपार biotinylated एंटीबॉडी को दूर करने के लिए natant।
    4. सेल छँटाई बफर के 150 μl और CD8α स्थिति डीसी अलगाव किट में प्रदान विरोधी बायोटिन मोतियों की 100 μl जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और 15 मिनट के लिए बर्फ के पानी के स्नान में सेते हैं।
    5. 10 मिलीलीटर सेल बफर छँटाई 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा जोड़ें और गोली कोशिकाओं।
    6. 1 मिलीलीटर सेल छँटाई बफर में Resuspend कोशिकाओं और कदम 3.1.6 3.1.8 के माध्यम से प्रक्रिया के अनुसार एक ताजा लोकसभा स्तंभ के ऊपर से गुजरती हैं।
    7. 2 (FT2) के माध्यम से लेबल हटाया गया प्रवाह लीजिए और स्तंभ retentate त्यागें। इस लेबल हटाया गया अंश CD8α स्थिति और CD8α Neg DCS के लिए समृद्ध है।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा FT2 में गोली कोशिकाओं।
    9. 1 मिलीलीटर सेल छँटाई बफर में कोशिकाओं resuspend और CD8α स्थिति डीसी अलगाव किट में प्रदान विरोधी CD8α संयुग्मित चुंबकीय मोतियों की 200 μl जोड़ें।
    10. निरसित3.2.6 के माध्यम से कदम 3.2.2 खाते हैं। स्तंभ के माध्यम से प्रवाह CD8α Neg DCs के लिए समृद्ध और CD8α स्थिति DCS के लिए समाप्त हो गया है। यह 3 (FT3) के माध्यम से प्रवाह लेबल है।
    11. CD8α स्थिति डीसी स्तंभ में बनाए रखा elute करने के लिए, चुंबक से स्तंभ को हटाने सेल छँटाई बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ने और लोकसभा स्तंभ के साथ प्रदान सवार का उपयोग कर स्तंभ मैट्रिक्स शुद्ध करना।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और 1 मिलीलीटर सेल छँटाई बफर में resuspend। शुद्धता बढ़ाने के लिए, eluted कोशिकाओं 3.1.8 के लिए कदम 3.1.6 दोहरा द्वारा एक ताजा लोकसभा स्तंभ के माध्यम से फिर से चलाने के लिए, सिवाय इसके माध्यम से प्रवाह त्यागें और 3.2.11 के रूप में बनाए रखा कोशिकाओं को इकट्ठा।
    13. FT3 निलंबन से CD8α Neg डीसी को शुद्ध करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा FT3 गोली और सेल छँटाई बफर के 300 μl में resuspend।
    14. विरोधी CD11c पत्रिका की 100 μl जोड़ेnetic मोती। अच्छी तरह मिक्स और 15 मिनट के लिए बर्फ के पानी के स्नान में सेते हैं।
    15. 10 मिलीलीटर सेल छँटाई बफर और गोली कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा जोड़े।
    16. दोहराएँ 3.1.8 के माध्यम से 3.1.5 कदम। CD8α Neg डीसी सकारात्मक CD11c मोतियों के साथ चुना जाता है और स्तंभ के लिए बाध्य कर रहे हैं। प्रवाह के माध्यम से खारिज किया जा सकता है।
    17. कदम 3.2.11 शुद्ध CD8α Neg डीसी को इकट्ठा करने में वर्णित के रूप में कोशिकाओं स्तंभ में बनाए रखा Elute।

4. एंटीजन और सेल हस्तांतरण के साथ स्पंदन APCs

  1. शुद्धि trypan नीले बहिष्कार 21 का उपयोग कर रहते हैं और मृत कोशिकाओं को अलग करने के बाद जीवित कोशिकाओं की गणना करें।
  2. पसंद के प्रतिजन के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। 100 एनएम एकाग्रता 13 पर glycolipid प्रतिजन बुलाया अल्फा-galactosyl Ceramide (αGalCer) के अनुरूप प्रयोग करें। आमतौर पर, अल्ट्रा कम attac का उपयोग कर प्लेट 10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं / अच्छी तरह से में पूरा RPMI मध्यमhment यू नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें सेल लगाव कम से कम। 4 घंटा - 1 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 माहौल में कोशिकाओं को सेते हैं।
  3. धीरे कई बार pipetting द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं। कतरनी बलों से सेल नुकसान को कम करने के लिए व्यापक बोर पिपेट युक्तियों का उपयोग करें। पीबीएस के साथ कुओं धो लें और इन washes पूल सेल फसल को अधिकतम करने के लिए।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर गोली कोशिकाओं और पीबीएस में वांछित घनत्व को resuspend। आमतौर पर, प्राप्तकर्ता जानवर प्रति 200 μl में 1 लाख कोशिकाओं इंजेक्षन। मेजबान जानवरों में प्रशासन से पहले व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
  5. नसों के द्वारा चूहों में या तो पार्श्व पूंछ व्यर्थ या रेट्रो कक्षीय शिरापरक जाल 19 के माध्यम से कोशिकाओं इंजेक्षन। 1 मिलीलीटर सिरिंज पर एक 27 जी सुई का प्रयोग करें, और माउस प्रति 0.1 मिलीलीटर की एक अधिकतम मात्रा इंजेक्षन।

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Representative Results

इस प्रक्रिया के परिणाम murine फ्लाइट 3 एल द्वारा डीसी सबसेट के विस्तार प्रत्यारोपित मेलेनोमा कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की पर निर्भर करता है। B16.Flt3L ट्यूमर एक C57BL / 6 माउस से निकाला गया था, और ट्यूमर अस्वीकृति की वजह से स्थापित बनने के लिए विफलता से बचने के क्रम में है कि तनाव की पृष्ठभूमि के साथ जानवरों में प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए। कुछ मामलों में, यह रास्ते या ब्याज की रिसेप्टर्स संकेत में जाना जाता दोष के साथ डीसी प्राप्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग करने के लिए वांछनीय हो सकता है। यह ध्यान रखें कि ट्यूमर इस तरह के जानवरों में अलग कैनेटीक्स के साथ विकास हो सकता है में रखने के लिए महत्वपूर्ण है, तो यह टीका स्थल पर उपस्थिति और टटोलने का कार्य के आधार पर ट्यूमर के विकास पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव में, एक बार ट्यूमर साफ नजर आती है, B16.Flt3L ट्यूमर असर चूहों लगातार प्लीहा कोषमयता कि सभी डीसी सबसेट (2A चित्रा) के विस्तार के साथ संबद्ध में उल्लेखनीय वृद्धि दिखा। हम आम तौर पर एक 2- 3 गुना बढ़ाने देखनाभोले जानवरों की तुलना में B16.Flt3L मेलेनोमा असर चूहों से प्राप्त कुल splenocytes की संख्या में ई। भाग में डीसी की संख्या में वृद्धि हुई है, बी कोशिकाओं की आवृत्ति में स्पष्ट कमी के लिए योगदान देता है, जबकि वहाँ बी कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या में कोई परिवर्तन करने के लिए बहुत कम है। दिलचस्प है, जबकि एक बड़े विस्तार (~ 15 निरपेक्ष संख्या में 20 गुना वृद्धि करने के लिए) इन चूहों में पारंपरिक DCS के लिए मनाया जाता है, वहाँ केवल एक मामूली वृद्धि (लगभग 4 गुना) plasmacytoid डीसी सबसेट में मनाया जाता है।

Gating रणनीति अलग डीसी सबसेट की पहचान करने के लिए चित्रा 2A में दिखाया गया है और सबसेट विशेष प्ररूपी मार्कर (चित्रा 2 बी) के रूप में B220, CD11b, CD11c और CD8α की अभिव्यक्ति पर आधारित है। हम यह भी रूप में चित्रा 2 बी में दिखाया गया है इन कैंपेन्स पर DEC205, CD11b और mPDCA1 अभिव्यक्ति की जांच की। यह केवल पीडीसी सबसेट पर उम्मीद पैटर्न, mPDCA के साथ चलता है, जबकि दिसम्बर 205 CD8α स्थिति DCs पर अत्यधिक व्यक्त किया है और CD11b CD8α Neg DCs पर सबसे प्रमुखता से पता चला है। हम यह भी प्रोटोकॉल के हर कदम पर शुद्ध सबसेट से प्रत्येक के लिए सेल आवृत्तियों में परिवर्तन का विश्लेषण यहाँ वर्णित (चित्रा -2 में संक्षेप में, चित्रा 3 में प्रवाह cytometric डेटा का विस्तृत उदाहरण के साथ)। इस विधि में वर्णित प्लीहा डीसी सबसेट के अलगाव के एक बहु कदम प्रक्रिया (चित्रा 1) है। plasmacytoid डीसी की शुद्धि नकारात्मक चयन पर निर्भर करता है बी, टी, एन.के. कोशिकाओं और पारंपरिक डीसी की तरह सभी अवांछित आबादी की कमी के बाद इन कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए। CD8α स्थिति डीसी, और CD8α Neg डीसी की शुद्धि टी, बी और एन.के. कोशिकाओं की कमी के बाद इन कोशिकाओं के सकारात्मक चयन द्वारा किया जाता है। डीसी सबसेट में से प्रत्येक के उच्च शुद्धता इस प्रक्रिया (आमतौर पर ~ 95%) भी 3 चित्र में सचित्र है का उपयोग कर प्राप्त की।

ve_content। "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> प्रयोगों के आधार पर प्रदर्शन किया जाएगा, इन कोशिकाओं को एक वांछित प्रतिजन के साथ स्पंदित किया जा सकता है और प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए histocompatible murine मेजबान टीम में स्थानांतरित इसके अलावा, इन कोशिकाओं को भी यह कर सकते हैं शारीरिक डीसी कैंपेन्स के उत्तेजक या नियामक गतिविधियों के vivo अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। 2 10 x 7 कुल splenocytes प्रति शुद्ध डीसी सबसेट के लिए सेल की पैदावार लगभग एक लाख पीडीसी, 2 लाख CD8α स्थिति डीसी और 4 लाख CD8α Neg DCs हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. डीसी के अलगाव। डीसी के विभिन्न सबसेट के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों को दर्शाता हुआ एक योजनाबद्ध। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। >

चित्र 2
चित्रा 2. B16.Flt3L ट्यूमर के साथ चूहे में प्लीहा डीसी कैंपेन्स के विश्लेषण। ए) gating रणनीति पीडीसी (आर 1), CD8α स्थिति DCS (R5) और CD8α Neg DCS (R6)। बी) के अलग सबसेट पर mPDCA1, 33D1, DEC205 और CD11b की अभिव्यक्ति के लिए इसी सेल आबादी की पहचान के लिए सचित्र है। कोशिकाओं गेट R4 में निहित (लिम्फोसाइटों के एक सबसेट; B220, CD11c, CD11b के लिए नकारात्मक)। इन मार्करों सी) डीसी के सापेक्ष संवर्धन और लिम्फोसाइट सबसेट दिन में चूहों के spleens से अलग की अभिव्यक्ति की कमी एक नियंत्रण जनसंख्या के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं 14 B16.Flt3L मेलेनोमा कोशिकाओं का टीका के बाद, काली सलाखों के रूप में छोड़ दिया साजिश में दिखाया गया है, जबकि भोले चूहों में इन सेल आबादी की आवृत्ति सफेद सलाखों के रूप में दिखाया गया है। सही साजिश सेल नंबर के रूप में एक ही डेटा प्रदर्शित करता है।https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. संवर्धन प्रोटोकॉल के दौरान प्लीहा डीसी कैंपेन्स के विश्लेषण। ए) असर चूहों B16.Flt3L ट्यूमर से splenocytes की शुरू की आबादी में 10% से plasmacytoid DCS (B220 उच्च और CD11c कम, आर 1) के संवर्धन ~ स्तंभ में 95% शुद्धता के माध्यम से 1. ध्यान दें कि इस स्तंभ से eluted कोशिकाओं retentate प्रवाह करने के लिए के spleens में ~ 33% से इस आबादी। बी) पारंपरिक डीसी के संवर्धन (CD11c उच्च में, CD8α सकारात्मक और नकारात्मक का मिश्रण) से समाप्त हो रहे हैं B16.Flt3L मेलेनोमा असर 10 दिन पर चूहों में ~ 78% करने के ट्यूमर आरोपण के बाद 2 अंश के माध्यम से प्रवाह। स्तंभ retentate 2 भूखंडों में, CD11c सकारात्मक आबादी गड्ड होना दिखाई देते हैंसहयोगी समाप्त, नकारात्मक चयन के दौरान डीसी की पर्याप्त संख्या को हटाने के लिए इसी टी, बी और एन.के. कोशिकाओं व्यय करना। 2 निलंबन के माध्यम से प्रवाह के आगे विभाजन विरोधी सीडी 8 बाध्यकारी पैदावार> CD8α स्थिति डीसी के 95% शुद्धता के लिए सकारात्मक चयन का उपयोग कर। इस के माध्यम से प्रवाह तो, विरोधी CD11c के बंधन> 95% शुद्ध CD8α Neg डीसी की आबादी उपज के लिए सकारात्मक चयन के अधीन था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वृक्ष के समान कोशिकाओं प्रमुख पेशेवर टी सेल प्रतिक्रिया की भड़काना में शामिल कोशिकाओं पेश प्रतिजन होने के लिए स्वीकार कर रहे हैं। उनका मुख्य कार्य सर्वेक्षण करने के लिए टी कोशिकाओं को प्रस्तुति के लिए एंटीजन ले रही है और प्रसंस्करण द्वारा ऊतक microenvironment है। विशिष्ट डीसी कैंपेन्स के समारोह का अध्ययन करने के लिए, इन एक दृष्टिकोण है कि अपने सामान्य phenotype और कार्यों का कहना है का उपयोग करते हुए पर्याप्त संख्या में अलग होने की जरूरत है। सबसे प्रोटोकॉल भोले चूहों से विशिष्ट डीसी सबसेट के अलगाव पर भरोसा करते हैं। चूंकि इन कोशिकाओं दुर्लभ हैं, अलगाव प्रक्रियाओं कुशल नहीं हैं और कोशिकाओं की संख्या कम उपज। 1 लाख सीडी 8 पीओएस डीसी, जबकि अधिकांश प्रयोगों हस्तांतरण के अध्ययन के साथ प्रदर्शन प्रति पशु कोशिकाओं के कम से कम इस नंबर का उपयोग करें - उदाहरण के लिए, एक तिल्ली बारे में केवल 0.5 निकलेगा। इस प्रकार, मौजूदा तरीकों की एक प्रमुख सीमा दाता चूहों और पर्याप्त मात्रा में की बहुत बड़ी संख्या का उपयोग कर के बिना पर्याप्त सेल नंबर को अलग-थलग करने में असमर्थता हैअभिकर्मकों की। हमारे विधि काफी हद तक एक फ्लाइट 3 एल स्रावित ट्यूमर के साथ प्रत्यारोपित बहुत डीसी विस्तार करने के लिए चूहों का उपयोग, immunomagnetic शुद्धि कदम की एक श्रृंखला का उपयोग कर तीन अच्छी तरह से पहचाना डीसी सबसेट की बहुत अधिक से अधिक संख्या की शुद्धि की अनुमति देकर इन समस्याओं पर काबू। यहां वर्णित प्रोटोकॉल इसलिए कम से कम कई गुना पैदावार के मामले में मौजूदा तरीकों पर एक बड़ा सुधार है।

कुछ निरंतर यहाँ वर्णित अलगाव प्रोटोकॉल के लिए मौजूद हैं। प्रमुख सीमा है कि प्रक्रिया में इन कोशिकाओं को अलग-थलग अनजाने में उनकी phenotype बदल सकता है के लिए प्रयोग किया जाता है। डीसी नजाकत endotoxin प्रदूषण और यांत्रिक उत्तेजनाओं कि उनके phenotype और समारोह में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के प्रति संवेदनशील हैं। इस तकनीक का एक और सीमा फ्लाइट 3 एल स्राव पर निर्भरता डीसी सबसेट का विस्तार है। इस ऊतक निवासी डीसी सबसेट कि व्यक्त नहीं करते फ्लाइट -3 रिसेप्टर में विस्तार की कमी का परिणाम है।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग सेल संवर्धन पर निर्भर करता है। सेल शुद्धि के अलगाव के लिए किट एक प्रोटोकॉल है कि अभिकर्मकों की सिफारिश की मात्रा में इस्तेमाल किया जा रहा होता है के साथ आता है। ट्यूमर असर चूहों की कोशिका संरचना भोले चूहों (चित्रा 2 सी) के उस से नाटकीय रूप से अलग है, और इसलिए हम क्रम में इष्टतम सेल पवित्रता को प्राप्त करने में हमारी तकनीक में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के लिए मात्रा में संशोधित किया है। डीसी पक्षपाती कोशिकाओं रहे हैं और स्तंभ मैट्रिक्स के लिए गैर-विशेष रूप से संलग्न कर सकते हैं। EDTA युक्त बफर के साथ स्तंभ बिस्तर का संतुलन सेल पालन को कम करता है, और लगातार दो स्तंभों पर धारावाहिक पारित होने के उपयोग सेल शुद्धता आगे बढ़ाता है।

डीसी अत्यधिक पक्षपाती कोशिकाओं रहे हैं और इन विवो में आम तौर पर बारीकी से कोशिकी ऊतक मैट्रिक्स के साथ जुड़े रहे हैं। आदेश उपज बढ़ाने के लिए, यह कोलैजिनेज़ और पर्याप्त टिम के लिए DNase के साथ प्लीहा ऊतक को पचाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैई इन कोशिकाओं के एक अधिक से अधिक संख्या में निकालने के लिए। यह भी सुनिश्चित करें कि प्लीहा ऊतक टुकड़े पूरी तरह से है, जबकि पाचन के दौर से गुजर कोलैजिनेज़ / DNase मैं समाधान में डूबे हुए हैं होने के लिए महत्वपूर्ण है। के बाद से इन कोशिकाओं को अत्यधिक endotoxin उत्तरदायी हैं डीसी अलगाव का एक अन्य महत्वपूर्ण विशेषता है, अलगाव की प्रक्रिया के दौरान सख्त बाँझपन और endotoxin मुक्त की स्थिति बनाए रखने के लिए है। endotoxin मुक्त शेयरों से हौसले से तैयार अभिकर्मकों का प्रयोग करें, और फिल्टर उपयोग करने से पहले सभी अभिकर्मकों बाँझ। सभी सेल अलगाव buffers और मीडिया एफसीएस कि detectable endotoxin से मुक्त होने के लिए प्रमाणित है के साथ पूरक होना चाहिए। इन कोशिकाओं को भी अत्यधिक यांत्रिक उत्तेजनाओं और दोहराया यांत्रिक उत्तेजना इन कोशिकाओं की परिपक्वता राज्य को बदल सकता है के प्रति संवेदनशील हैं। हालांकि कुछ यांत्रिक बल collagenase पाचन के बाद एक सेल झरनी के माध्यम से ऊतक के लिए मजबूर करने की जरूरत है, इस के रूप में धीरे संभव के रूप में किया जाना चाहिए। इसके अलावा, कोशिकाओं की जोरदार pipetting संभव के रूप में ज्यादा से बचा जाना चाहिएई, और विस्तृत बोर विंदुक युक्तियाँ कतरनी बलों को कम से कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

दत्तक हस्तांतरण मॉडल डीसी के विशिष्ट सबसेट द्वारा प्रतिजन प्रस्तुति और टी सेल भड़काना की जांच के लिए उपयोगी है। हालांकि, यह अन्य अध्ययनों कि प्रतिजन के हस्तांतरण अंतर्जात डीसी को प्रतिजन स्पंदित डीसी से उत्पन्न हो सकने में प्रदर्शन किया गया है। इस प्रकार, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रतिजन स्पंदित कोशिकाओं द्वारा उकसाया "कब्जा" प्रतिजन और नहीं है कि स्थानांतरित कर एपीसी के पेश अंतर्जात डीसी द्वारा प्रस्तुति प्रतिबिंबित कर सकते हैं। हस्तांतरण की इस तरह की तेजी से वृद्धि हुई है, तो पृथक डीसी की तैयारी मृत या मर कोशिकाओं होते हैं। यह रूप में तेजी से संभव के रूप में डीसी अलगाव और ट्रांसफर प्रोटोकॉल बाहर ले जाने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है, पूर्व ठंडा buffers के साथ बाँझ शर्तों का उपयोग सेल अस्तित्व को बढ़ाने के लिए। हम दौरान सेल लगाव को कम से कम करने के लिए कम से बाध्यकारी सेल संस्कृति प्लेटों में ऊष्मायन के साथ इस कारण के लिए 4 घंटा की एक अपेक्षाकृत कम प्रतिजन स्पंदन अवधि चुना है,इस कदम। इसके अलावा, बढ़ाया संस्कृति हालत सुसंस्कृत डीसी की परिपक्वता स्थिति को बदल सकता है, और दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों 22 के परिणाम को प्रभावित कर सकता है।

सारांश में, वृक्ष के समान कोशिका जीव विज्ञान अनुसंधान के एक बहुत सक्रिय क्षेत्र है, और एक विश्वसनीय पद्धति के विकास के डीसी कि ईमानदारी से उनके vivo प्ररूपी प्रतिबिंबित और कार्यात्मक विचलन इन कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक विशाल अवसर प्रदान करता है उत्पन्न करने के लिए है। यह रसायन है कि डीसी कार्यों मिलाना सकता है, लेकिन पशु मॉडल में प्रणालीबद्ध प्रशासित नहीं किया जा सकता शामिल अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है। ब्याज पूर्व vivo इन रसायनों के साथ की पृथक डीसी सबसेट इलाज के लिए एक व्यावहारिक और व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रतिजन प्रस्तुति रास्ते में से यंत्रवत विवरण स्पष्ट मदद कर सकता है।

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Acknowledgments

इस काम के रस प्रवाह करने के लिए एनआईएच / NIAID अनुदान AI45889 द्वारा समर्थित किया गया cytometry अध्ययनों FACS कोर आइंस्टीन कैंसर केंद्र (एनआईएच / NCI CA013330) और केंद्र एड्स अनुसंधान के लिए (एनआईएच / NIAID AI51519) द्वारा समर्थित सुविधाओं का उपयोग कर किए गए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies, Gibco 25300-054
Isoflurane  Sigma-Aldrich CDS019936-250MG
Collagenase D  Roche Diagnostics 11088858001
DNase I (dry powder) QIAGEN 79254
200 proof ethanol  Thermo Fisher Scientific 9-6705-004-220 Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer Sigma-Aldrich R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine  Life Technologies, Gibco 11875-119
DMEM medium with L-glutamine  Life Technologies, Gibco 11995-073
200 mM L-glutamine  Life Technologies 25030081
MEM non-essential amino acids  Life Technologies, Gibco 11140-050
MEM essential amino acids  Life Technologies 11130-051 
β-mercaptoethanol  Life Technologies, Invitrogen 21985-023
Sodium pyruvate  Life Technologies 11360-070
HEPES Life Technologies, Invitrogen 15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) Life Technologies, Invitrogen 20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) Life Technologies, Gibco 14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution  Life Technologies 15575-020
Bovine serum albumin (BSA)  Sigma-Aldrich A2153
Fetal calf serum Atlanta Biologicals S11050 
Penicillin/streptomycin  Life Technologies, Invitrogen 15140-163
Trypan blue (dry powder)  Sigma-Aldrich T6146-5G  Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi Biotech 130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c  Miltenyi Biotech 130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit  Miltenyi Biotech 130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) BD Biosciences 553141
Anti-mouse CD11c-FITC  BD Biosciences 553801
Anti-mouse CD8α-PerCP  BD Biosciences 553036
Anti-mouse B220-PE  BD Biosciences 553090
1 ml syringes  BD 26048
23 G1 needle  BD 305145
100 mm Petri dishes  Thermo Fisher Scientific 875712
Surgical instruments  Kent Scientific INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm) BD 352350
Large Petri plates  Thermo Fisher Scientific FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) Corning 431097
LS columns  Miltenyi 130-042-401
Magnetic stand MACS separator  Miltenyi Biotec 130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips  PerkinElmer 111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates  Corning CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice  Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line described by Mach et al., 2000
Serum free DMEM and RPMI media
500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine
5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)
5 ml HEPES Buffer (1 M)
5 ml L-glutamine (200 mM)
0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)		 Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution
Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml.		 This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use.

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References

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माउस वृक्ष के समान सेल सबसेट के अलगाव के लिए एक कुशल और उच्च उपज विधि
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Arora, P., Porcelli, S. A. An… More

Arora, P., Porcelli, S. A. An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets. J. Vis. Exp. (110), e53824, doi:10.3791/53824 (2016).

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