Exosomalen miRNA-Analyse in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) der Patienten Plasma durch qPCR: ein gangbarer Flüssiges Biopsy-Tool
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
Die geringe Überlebensrate bei NSCLC (nicht-kleinzelligem Lungenkrebs) Patienten ist vor allem aufgrund der begrenzten Wirksamkeit von Behandlungen in fortgeschrittener Krankheit und schlechte Früherkennung 1. Aktivierende Mutationen in dem EGFR – Gen, das in einer Subpopulation von NSCLC – Patienten gefunden wurden, sind dafür bekannt , die Empfindlichkeit zu verleihen Kinaseinhibitoren zu Tyrosin (TKI). Leider entwickeln die Mehrheit der EGFR – mutierten NSCLC – Patienten TKI Widerstand 2. Gerade in diesem Zusammenhang ist eine korrekte Diagnose ist obligatorisch. In der Regel aufgrund Lokalisation von Tumoren, Biopsiegewebe bei NSCLC erhalten, ist nicht immer möglich. Daher sind mehrere Studien laufen, die nicht-invasive Methoden verwenden diese biologischen Daten zu erhalten. Exosomen sind als flüssige Biopsie Komponenten beschrieben , die untersucht werden , könnten drei diagnostische und prognostische Werte mit nicht-invasiven Techniken zu erhalten.
Exosomen sind Nanovesikeln (40-100 nm Durchmesser) von endocytic Ursprungs , die von 4 verschiedenen Zelltypen sowohl in physiologischen und pathologischen Bedingungen freigesetzt werden. Sie können Protein, Lipide, mRNA und microRNA tragen. Außerdem lassen sich mehrere Studien eine pleiotrope Rolle von Tumor abgeleitet Exosomen, das Wachstum und das Überleben von Tumorzellen beeinflussen können, Angiogenese, Stroma- und extrazelluläre Matrix Remodeling und drug resistance 5.
MicroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-codierende RNA , die in post-transkriptionalen Regulation beteiligt sind, die Bindung des 3'-UTR der Ziel – mRNAs und führt die mRNA zu einem Abbau oder zu einer nicht-Übersetzung 6. Selektive Sortierung von miRNAs in Exosomen beschrieben wurde. In diesem Zusammenhang wurde kürzlich gezeigt, in vitro und in vivo eine selektive Verpackung von miR-21 (einem bekannten miRNA mit onkogenen Effekte) in Exosomen von chronischer myeloischer Leukämie – Zelllinien nach Curcumin Behandlung 7 freigegeben.
Dasexosomalen miRNA Profil ist ähnlich dem miRNA – Profil des Primärtumors und dieses Merkmal kann 3 in frühen Diagnose und Prognose ausgenutzt werden. Genauer gesagt, besteht eine Möglichkeit , zu charakterisieren, durch Echtzeit – PCR, ausgewählt miRNAs mit dem molekularen Profil der Krankheit korreliert, z. B., EGFR – Mutationen unter anderem 8.
Hier ist die Analyse einer ausgewählten Gruppe von NSCLC-korrelierten miRNAs 8-9 beschrieben , die von Exosomen isoliert wurden im Blut von NSCLC – Patienten veröffentlicht. Nach Erhalt der Zustimmung Bericht von den Patienten, Plasma von 12 NSCLC-Patienten und 6 gesunden Kontrollen wurden analysiert informieren. Die exosome Isolierung wurde mit kommerziellen Kits durchgeführt nach dem Protokoll des Herstellers. Bevor exosome Isolierung Plasmaproben wurden mit RNAse behandelt, um miRNAs Verunreinigung zirkulierende abzubauen. Wir entschieden uns, diese Analyse mit einem kommerziellen Kit zur Durchführung aufgrund der begrenzten Standardisierung der anderen techniques (z. B. Ultrazentrifugieren) was besonders wichtig ist , wenn es mit klinischen Proben arbeiten. Dieses Kit enthält eine Proteinase K-Behandlung, die die RNAse abgebaut wird, und verringert somit das Risiko exosomalen miRNAs nach exosome Lyse abzubauen. MicroRNA-Analyse wurde durch sensitive und spezifische Real-Time PCR-Analyse durchgeführt; mir-1228-3p wurde als endogene Kontrolle verwendet und die Daten wurden normalisiert , gemäß der Formel 2 – ΔΔct. Die Kontrollwerte werden als Basislinie verwendet und die Ergebnisse werden in einer logarithmischen Skala dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit diesem kombinierten Protokoll war es möglich, eine exosomalen miRNA-Analyse von Plasma von NSCLC-Patienten durchzuführen. Diese Daten können den Krankheitszustand widerspiegeln, aber dies muss durch weitere Untersuchungen bestätigt werden.
Das Protokoll in diesem Artikel verwendet wurde, auf einem kommerziellen Kit für exosome Isolation basiert. Der Grund war , dass die anderen bekannten Isolierungsverfahren (z. B. Dichtegradient Ultrazentrifugation) erfordern manuelle Verf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
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