ניתוח מירנה Exosomal ב non-small cell סרטן ריאות (NSCLC) מטופלים פלזמה באמצעות qPCR: כלי ביופסיה נוזלי ריאלי
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
שיעור ההישרדות הנמוך ב NSCLC (non-small סרטן ריאות מסוג התאים) חולים הוא בעיקר בשל היעילות המוגבלת של טיפולים במחלה מתקדמת לגילוי מוקדם עניי 1. מוטציות הפעלה בגן EGFR, כי התגלו בתוך תת-אוכלוסייה של חולי NSCLC, ידועות להעניק רגישות טירוזין קינאז inhibitors (TKIs). למרבה הצער, רוב המטופלים NSCLC מוטציה ב- EGFR לפתח TKI התנגדות 2. במיוחד בהקשר זה, אבחנה נכונה היא חובה. באופן כללי, בשל לוקליזציה של גידולים, קבלת רקמות ביופסית NSCLC היא לא תמיד אפשרית. לכן, מספר מחקרים נמשכים המשתמשים בשיטות לא פולשני להשיג נתונים ביולוגיים אלה. Exosomes מתואר מרכיבים נוזלים ביופסיה שיכול להיחקר על מנת לקבל ערכי אבחון פרוגנוסטית עם טכניקות לא פולשנית 3.
Exosomes הם nanovesicles (40 – 100 קוטר ננומטר) של דוארהמוצא ndocytic שפורסמו על ידי תאים מסוגים שונים הן בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים 4. הם יכולים לשאת חלבונים, שומנים, mRNA ו מיקרו-רנ"א. יתר על כן, מספר מחקרים מראים תפקיד pleiotropic של exosomes נגזר גידול, אשר יכול להשפיע על צמיחה והישרדות של תאים סרטניים, אנגיוגנזה, סטרומה שיפוץ תאי מטריקס סמי התנגדות 5.
מיקרו RNA (miRNAs) הם RNA קצר ללא קידוד המעורבים בתקנה שלאחר תעתיק, מחייב 3'-UTR של תעתיקי היעד והובלת mRNA השפלה או א-התרגום הלא 6. מיון סלקטיבי של miRNAs לתוך exosomes תואר. בהקשר זה, לאחרונה הודגם, במבחנת in vivo, באריזה סלקטיבית של miR-21 (מירנה ידועה עם אפקטים שבעור) ב exosomes שפורסם על ידי שורות תאים לוקמיה מיאלואידית כרוניות לאחר טיפול כורכומין 7.
הexosomal מירנה פרופיל דומה לפרופיל מירנה של הגידול הראשוני תכונה זו עשויה להיות מנוצלת על אבחון מוקדם הפרוגנוזה 3. באופן ספציפי, קיימת אפשרות לאפיין, על ידי PCR בזמן האמת, miRNAs שנבחר בקורלציה עם הפרופיל המולקולרי של מחלה, למשל., מוטציות EGFR בין היתר 8.
כאן, הניתוח של פאנל נבחרת של NSCLC בקורלציה miRNAs 8-9 מתואר כי בודדו exosomes שוחרר בדם של חולי NSCLC. לאחר הקבלה להודיע דו"ח הסכמה מצד החולים, פלזמה של 12 חולי NSCLC ו -6 ביקורת בריאה, נותחה. בידוד exosome בוצע עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. לפני בידוד exosome, דגימות פלסמה טופלו RNase, כדי לבזות miRNAs במחזור המזהם. החלטנו לבצע ניתוח זה עם ערכה מסחרית בשל סטנדרטיזציה המוגבלת techni אחרבככפרו (למשל., ultracentrifugation) אשר חשוב במיוחד כשעובדים עם דגימות קליניות. ערכה זו כוללת טיפול proteinase K, אשר יהיה לבזות את RNAse, ובכך מקטין את הסיכון להשפיל miRNAs exosomal לאחר תמוגה exosome. ניתוח MicroRNA בוצע על ידי ניתוח רגיש וספציפי Real-Time PCR; mir-1228-3p שימש פקד אנדוגני ונתונים היו מנורמל לפי הנוסחה 2 – ΔΔct. ערכי בקרה משמשים בסיס והתוצאות מוצגות סולם לוגריתמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם פרוטוקול משולב זה ניתן היה לבצע ניתוח מירנה exosomal מפלזמה של חולי NSCLC. נתונים אלה עשויים לשקף את מצב המחלה, אך זו צריכה להיות מאושרת על ידי מחקר נוסף.
הפרוטוקול המשמש במאמר זה התבסס על ערכה מסחרית לבידוד exosome. הסיבה לכך הייתה כי נהל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
- Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
- Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
- Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
- Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
- Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
- Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR’1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).
