Un método para detectar y aislar las vías aéreas que inervan las neuronas sensoriales en ratones
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
nervios somatosensoriales transducen térmica, mecánica, química, y los estímulos nocivos causados por ambos agentes endógenos y ambientales. Los cuerpos celulares de estas neuronas aferentes se encuentran dentro de los ganglios sensoriales. Los ganglios sensoriales inervan un órgano específico o porción del cuerpo. Por ejemplo, el ganglio de la raíz dorsal (DRG) se encuentran en la columna vertebral y se extienden procesos en todo el cuerpo y las extremidades. Los ganglios del trigémino se encuentran en el cráneo y inervan la cara, y las vías respiratorias superiores. las vías aferentes vagales de los ganglios nodose se extienden por todo el intestino, el corazón y los pulmones. Las neuronas nodose controlan una gran variedad de funciones, tales como: frecuencia respiratoria, irritación de las vías respiratorias, tos y los reflejos. Por lo tanto, para entender y manipular su función, es crítico para identificar y aislar las vías respiratorias específicas subpoblaciones neuronales. En el ratón, las vías respiratorias están expuestos a un colorante indicador fluorescente, Fast Blue, para el rastreo retrógrado de las neuronas de la vía aérea específica nodoses. Los ganglios nodose se disocian y células activadas por fluorescencia (FAC) de clasificación se utiliza para recoger las células positivas de tinte. A continuación, el ácido ribonucleico de alta calidad (ARN) se extrae de las células positivas de tinte para la secuenciación de próxima generación. El uso de este método de la vía aérea se determina la expresión génica neuronal específico.
Introduction
nervios somatosensoriales transducen térmica, mecánica, química, y los estímulos nocivos causados por ambos agentes endógenos y ambientales. Los cuerpos celulares de estos nervios aferentes se encuentran en los ganglios sensoriales, tales como la raíz dorsal, trigeminal, o ganglios nudosos. Cada ganglio sensorial inerva regiones específicas del cuerpo y contiene células que inervan los órganos y tejidos separados dentro de esa región. Por ejemplo, el ganglio de la raíz dorsal (DRG) se encuentran en la columna vertebral y se extienden procesos en todo el cuerpo y las extremidades, mientras que los ganglios del trigémino se encuentran en el cráneo, que contiene neuronas que inervan la cara, ojos, meninges o superiores vías respiratorias 1, 2. Los ganglios nodosos del nervio vago se encuentra en el cuello por debajo del cráneo y contiene cuerpos celulares que se extienden las fibras nerviosas en todo el tracto gastrointestinal, el corazón y las vías respiratorias inferiores y los pulmones 3. En los seres humanos el ganglio nodoso se encuentra solo, sin embargo, en el ratón se fusionacon el ganglio yugular, que también inerva los pulmones 4. Este ganglio fusionado a menudo se llama la yugular / nodose complejo, ganglio vagal, o simplemente ganglio nudoso 5. En este caso, se conoce como el ganglio nudoso.
Las fibras aferentes de la nodose pasan la información de las vísceras al núcleo del tracto solitario (NTS) en el tronco cerebral. De entrada sensorial a este ganglio único controla una diversa gama de funciones, tales como la motilidad intestinal 6, la frecuencia cardíaca 7, la respiración 8,9, y las respuestas respiratorias irritantes activadas 10,11. Con esta diversidad de funciones y órganos inervados, es fundamental para dirigir y aislar subpoblaciones específicas de órgano del ganglio nudoso el fin de estudiar las vías neuronales individuales. Sin embargo, dado el pequeño tamaño de la nodose y el número limitado de neuronas que contiene esta no es una tarea trivial. Cada ratón ganglio nodoso contiene aproximadamente 5.000 neuronas 12Además de una extensa población de células de soporte satélite. De los 5.000 neuronas nodose, sólo un 3 – 5% de inervan las vías respiratorias. Por lo tanto, cualquier cambio funcionales, morfológicos o moleculares dentro de las neuronas que inervan las vías respiratorias, debido a la estimulación respiratoria o patologías, se perderán en el ganglio nodoso densamente poblado.
Para resolver este problema, se desarrolló un método para identificar y aislar las neuronas que inervan las vías respiratorias. Las vías respiratorias se expusieron a un colorante indicador fluorescente para identificar a los posteriores neuronas que inervan nodose. Fast Blue fue recogido por las neuronas y se desplaza rápidamente a sus cuerpos celulares en los que se deberá conservarse durante un máximo de ocho semanas 13 – 15. Una vez identificado, un protocolo de disociación suave, pero eficaz se utiliza para conservar tinte de etiquetado y la viabilidad celular de células activadas por fluorescencia (FAC) de clasificación. Las células clasificadas se utilizan para extraer el ácido ribonucleico de alta calidad (ARN) para determinar la expresión de genes o fu otro análisis molecular de aguas abajo. Este protocolo proporciona una técnica útil y robusto para el aislamiento de las neuronas sensoriales que inervan un tejido de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método para dirigirse a las neuronas de la vía aérea-inervación en los ganglios nudosos del nervio vago. Una vez marcado, los ganglios se disocian suavemente para preservar de manera óptima el número de células y la viabilidad. Estas neuronas son entonces FAC ordenadas directamente en tampón de lisis y se extrae el ARN. La importancia de este protocolo es la posibilidad de dirigir, aislar y preservar la calidad de una población específica de células sensoriales. La expresión génic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoyado por el NIH subvención R01HL105635 de la SEJ. Los autores desean agradecer a Diego V. Bohórquez para el asesoramiento técnico. También agradecemos a R. Ian Cumming para la asistencia técnica y la realización de la citometría de flujo en el Centro de Vacunas Humanas Duke Instituto de Investigación de citometría de flujo de recursos compartidos (Durham, Carolina del Norte). La citometría de flujo se realizó en el Laboratorio Regional de Biocontención en Duke, que recibió un apoyo parcial a la construcción de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (UC6-AI058607).
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
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