En metode til at målrette og Isoler Airway-innerverer sensoriske neuroner i mus
Summary
Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
Abstract
Somatosensoriske nerver transducerer termiske, mekaniske, kemiske og skadelige stimuli forårsaget af både endogene og miljømæssige midler. Cellelegemerne af disse afferente neuroner er beliggende inden for sensoriske ganglier. Sensoriske ganglier innerverer et specifikt organ eller del af legemet. For eksempel er det dorsalrodsganglier (DRG), der ligger i rygsøjlen og udvide processer i hele kroppen og lemmer. Trigeminus ganglier er placeret i kraniet og innerverer ansigtet, og øvre luftveje. Vagus afferenter af de knudrede ganglier udstrække sig gennem tarmen, hjerte og lunger. De knudrede neuroner styre en bred vifte af funktioner såsom: respirationsfrekvens, luftvejsirritation, og hoste reflekser. Således at forstå og manipulere deres funktion, er det afgørende at identificere og isolere luftvejs specifikke neuronale delpopulationer. Hos mus, der luftvejene udsat for et fluorescerende sporstof farvestof, Fast Blue, til retrograd sporing af luftvejs-specifik knudrede neurons. De knudrede ganglier dissocieres og fluorescens-aktiveret celle (FAC) sortering anvendes til at opsamle farvestof positive celler. Dernæst høj kvalitet ribonukleinsyre (RNA) udvundet fra farvestof positive celler til næste generation sekventering. Ved hjælp af denne metode luftveje specifikke neuronal genekspression bestemmes.
Introduction
Somatosensoriske nerver transducerer termiske, mekaniske, kemiske og skadelige stimuli forårsaget af både endogene og miljømæssige midler. Cellelegemerne af disse afferente nerver er placeret i sensoriske ganglier, såsom dorsale, trigeminal eller knudrede ganglier. Hver sensoriske ganglion innerverer specifikke områder af kroppen og indeholder celler, der innerverer separate organer og væv i regionen. For eksempel er det dorsalrodsganglier (DRG), der ligger i rygsøjlen og udvide processer i hele kroppen og lemmer, mens trigeminusganglier er placeret i kraniet, der indeholder neuroner, der innerverer ansigt, øjne, meninges eller øvre luftveje 1, 2. Den knudrede ganglier i vagusnerven ligger i nakken under kraniet og indeholder cellelegemer, som strækker sig nervefibre hele mave-tarmkanalen, hjerte og nedre luftveje og lunger 3. Hos mennesker den knudrede ganglion står alene, men i musen det er fusioneretmed jugularis ganglion, som også innerverer lungerne 4. Denne kondenserede ganglion kaldes ofte jugularis / knudrede kompleks, vagal ganglion, eller blot knudrede ganglion 5. Her er det benævnt knudrede ganglion.
Afferente fibre af knudrede videregive oplysninger fra indvoldene til kernen af det ensomme tarmkanalen (NTS) i hjernestammen. Sensorisk input til denne unikke ganglion styrer en bred vifte af funktioner, såsom tarmmotilitet 6, puls 7, respiration 8,9, og lokalirriterende-aktiverede respiratoriske responser 10,11. Med denne mangfoldighed af funktioner og innerverede organer, er det vigtigt at målrette og isolere organspecifikke subpopulationer af den knudrede ganglion for at studere individuelle nervebaner. Men i betragtning af den lille størrelse af knudrede og det begrænsede antal neuroner indeholder dette ikke er en triviel opgave. Hver mus knudrede ganglion indeholder ca. 5.000 neuroner 12foruden en lang population af støtte satellitceller. Af de 5.000 knudrede neuroner, kun 3 – 5% innerverer luftvejene. Derfor eventuelle funktionelle, morfologiske eller molekylære ændringer inden luftvejs-innerverer neuroner, på grund af respiratorisk stimulation eller patologier, vil gå tabt i den tæt pakkede knudrede ganglion.
For at løse dette problem blev der udviklet en metode til at identificere og isolere neuroner, der innerverer luftvejene. Luftvejene blev udsat for et fluorescerende sporstof farvestof til at identificere de efterfølgende innerverer knudrede neuroner. Fast Blue blev samlet op af neuroner og rejser hurtigt til deres celle organer, hvor det tilbageholdes i op til otte uger 13 – 15. Når identificeret, en blid, men effektiv, dissociation protokol blev anvendt til at bevare mærkning farvestof og cellelevedygtighed for fluorescerende aktiveret celle (FAC) sortering. Sorterede celler anvendes til at ekstrahere høj kvalitet ribonukleinsyre (RNA) til bestemmelse af genekspression eller feller anden nedstrøms molekylær analyse. Denne protokol giver en nyttig og robust teknik til at isolere sensoriske neuroner, der innerverer et væv af interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at målrette luftvejs-innerverer neuroner i knudrede ganglier i vagusnerven. Når mærket er de ganglier forsigtigt dissocieres til optimalt at bevare celleantal og levedygtighed. Disse neuroner er derefter FAC sorteret direkte i lysebuffer og RNA ekstraheres. Betydningen af denne protokol er evnen til at målrette, isolere, og bevare kvaliteten af en specifik sensorisk celle population. Genekspression er beskrevet i denne lille population af neuroner, og organs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet af NIH give R01HL105635 til SEJ. Forfatterne vil gerne takke Diego V. Bohórquez for teknisk rådgivning. Vi takker også R. Ian Cumming til teknisk bistand og udføre flowcytometri på Duke menneskelige Vaccine Institute Research flowcytometri Shared Resource Facility (Durham, NC). Flowcytometri blev udført i det regionale biologisk indeslutning Laboratory ved Duke som fik delvis støtte til byggeri fra National Institutes of Health, National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme (UC6-AI058607).
Materials
| Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
| NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
| digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
| particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
| Heating block | LabNet | ||
| 70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
| RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
| 2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
| RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
| Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |
References
- Manteniotis, S., et al. Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia. PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).
- Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse. BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia. J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).
- Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways. J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).
- Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing. Cell. 161, 1-12 (2015).
- Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. Nodose ganglia-modulatory effects on respiration. Physiol Res. 62, 227-235 (2013).
- Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents. Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).
- Bautista, D. M., et al. TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).
- Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin. Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Res. 1319, 60-69 (2010).
- Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).
- Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels. J Vis Exp. (82), e50782 (2013).
- Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus. Am J Physiol – Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).
- Kwong, K., Lee, L. -. Y. PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli. J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).
- Joachim, R. A., et al. Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways. Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).
- Kaan, T. K. Y., et al. Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats. Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).
- Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon. Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).
- Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).
