Summary
نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة الإمكانات البشرية من synoviocytes تشبه الخلايا الليفية المستمدة من المريض، وذلك باستخدام نظام lentiviral دون الخلايا المغذية.
Abstract
الخلايا الجسمية الناضجة يمكن عكسها إلى المحفزة تشبه الخلايا الجذعية دولة باستخدام مجموعة محددة من العوامل برمجة. لقد ولدت العديد من الدراسات التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) من مختلف أنواع الخلايا الجسدية من قبل transducing أربعة عوامل النسخ ياماناكا: Oct4، Sox2، Klf4 وج. Myc على. تبقى دراسة iPSCs في طليعة من الأبحاث البيولوجية والسريرية. على وجه الخصوص، iPSCs المريض محددة يمكن أن تستخدم كأداة رائدة لدراسة البيولوجيا المرضية المرض، منذ iPSCs يمكن أن يتسبب من الأنسجة من أي فرد. التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض التهابي مزمن، مصنفة حسب تدمير الغضروف والهيكل العظمي في مفصل. تضخم الزليلي هي واحدة من الأسباب الرئيسية أو الأعراض التي تؤدي إلى هذه النتائج في التهاب المفاصل الروماتويدي. Synoviocytes تشبه الخلايا الليفية (FLSs) هي الخلايا المكونة الرئيسية في الغشاء الزليلي التصنع. FLSs في مفصل تتكاثر دون حدود، في نهاية المطاف غزو cartil المجاورةالعمر والعظام. حاليا، الغشاء الزليلي التصنع يمكن إزالتها إلا عن طريق إجراء العمليات الجراحية. يتم استخدام الغشاء الزليلي إزالة للبحث RA كمادة يعكس حالة التهاب المفصل. كما لاعبا رئيسيا في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي، FLSs يمكن استخدامها كمادة لتوليد والتحقيق في iPSCs من مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي. في هذه الدراسة، استخدمنا FLSs لمريض التهاب المفاصل الروماتويدي لتوليد iPSCs. باستخدام نظام lentiviral، اكتشفنا أن FLSs يمكن أن تولد RA المريض محددة التوجيهية. وiPSCs الناتجة عن FLSs يمكن مواصلة استخدامها كأداة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لالتهاب المفاصل الروماتويدي في المستقبل.
Introduction
الخلايا الجذعية المحفزة هي منصة الجيل القادم في مختلف المجالات السريرية والبيولوجية. وهي أداة الواعدة التي يمكن استخدامها في النمذجة المرض، وفحص المخدرات، والعلاج الطبي على التجدد. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) بشكل رئيسي إلى دراسة وفهم الخلايا المحفزة. ومع ذلك، معزولة عن تدمير الكيسة الإنسان، وترتبط hESCs مع العديد من المخاوف الأخلاقية. في عام 2007، والدكتور شينيا ياماناكا وفريقه عكس عملية برمجة الخلية وتطوير الخلايا الجذعية من البالغين البشري الخلايا الجسدية 1،2. وبالتالي، فخلافا hESCs، التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) يمكن أن تتولد من الخلايا الجسمية الناضجة، وتجنب العقبات الأخلاقية.
عادة، يتم إنشاؤها iPSCs قبل تسليم أربع جينات الخارجية: Oct4، Sox2، Klf4، وج. Myc على. يتم تسليم هذه العوامل ياماناكا أصلا باستخدام أنظمة lentiviral وفيروسات. وقد استمدت هذه iPSCs الأولى من الماوس جسدية جملتعلمي اللغة اإلنكليزية 3. بعد ذلك، تم تطبيق هذه التقنية لالليفية الجلدية الإنسان 1،2. دراسات لاحقة إنشاء بنجاح iPSCs من مصادر مختلفة، مثل البول 4، والدم 5،6، الكيراتينية 7، والعديد من أنواع الخلايا الأخرى. ومع ذلك، هناك بعض الخلايا الجسدية التي لم يتم استخدامها في إعادة برمجة، وفحص إمكانيات إعادة برمجة مختلف أنواع الخلايا من أنسجة معينة في حالة المرض، لا تزال هناك حاجة.
التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو المرض الذي يمكن أن يصيب جميع المفاصل ويؤدي إلى الظروف الذاتية في الأجهزة الأخرى. RA يصيب حوالي 1٪ من البالغين في العالم المتقدم. وهو مرض شائع نوعا ما، وانتشاره يزيد كل سنة 8. ومع ذلك، RA من الصعب تحديد في المراحل المبكرة وoncebone تدمير يحدث هناك أي علاج يمكن أن استرداد الضرر. وعلاوة على ذلك، نجاعة الأدوية تختلف من مريض لآخر، وأنه من الصعب التنبؤ مسعفالمعهد الوطني للإحصاء ما هو مطلوب. لذلك، هناك حاجة إلى تطوير طريقة فحص المخدرات، ومطلوب مادة الخلية التي يمكن أن تعكس ظروف RA.
Synoviocytes تشبه الخلايا الليفية (FLSs) هي مشاركا نشطا الخلوي في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي 9،10. توجد FLSs في بطانة باطنة الزليلي بين الكبسولة المشتركة وتجويف، الذي يشار إليه أيضا باسم الغشاء الزليلي. من خلال دعم الهيكل المشترك وتوفير المواد الغذائية للغضروف المحيطة بها، FLSs عادة ما تلعب دورا حاسما في وظيفة مشتركة والصيانة. ومع ذلك، FLSs في الاتحاد الإقليمي لها النمط الظاهري الغازية. RA FLSs يكون النمط الظاهري للسرطان مثل، في نهاية المطاف تدمير العظام المحيطة بها من انتشار لانهائي 10. مع هذه الخاصية الفريدة، FLSs يمكن استخدامها كمادة الواعدة التي يمكن أن تعكس البيولوجيا المرضية من التهاب المفاصل الروماتويدي. ومع ذلك، ونادرا ما يتم إنتاج هذه الخلايا، والظواهر خلية يغير مثل خلايا تذهب من خلال العديد من المقاطع في في المختبر
نظريا، يمكن RA iPSCs المستمدة من المريض (RA-iPSCs) تصبح أداة مثالية لفحص المخدرات وإجراء مزيد من البحوث. iPSCs ولدت لديها قدرة التجديد الذاتي ويمكن الحفاظ على وتوسعت في المختبر. مع تعدد القدرات، وهذه الخلايا يمكن أن تكون متباينة في ناضجة خلية غضروفية وخلية عظمية الأنساب، التي يمكن أن تسهم المواد خلية للبحوث محددة في RA وغيرها من الأمراض المرتبطة العظام 11.
في هذه الدراسة، ونحن لشرح كيفية عزل وتوسيع FLSs من الغشاء الزليلي ازالتها جراحيا، وكيفية توليد RA-iPSCs من FLSs باستخدام lentiviruses التي تحتوي على عوامل ياماناكا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: وافق هذا البروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في كوريا (KC12TISI0861).
1. عزل خلية زليلية والتوسع
- خلية زليلية عزل
- تعقيم اثنين من أزواج من مقص جراحي وزوج واحد من الملقط.
- نقل الأنسجة الزليلي إلى صحن 100 ملم ويغسل مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
- قطع الأنسجة الدهنية والعظام بقايا مصفر. نقل الأنسجة قلص إلى بئر من لوحة 6 جيدا وإضافة 5 مل من المتوسط تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) مع 20٪ مصل بقري جنيني (FBS).
- ختم الأنسجة مع مقص حتى قطع صغيرة بما يكفي لاختراق ماصة للتصرف.
- نقل وسائل الإعلام التي تحتوي على الأنسجة لأنبوب مخروطي 50 مل. حصاد المواد المتبقية عن طريق إضافة 5 مل من DMEM مع 20٪ FBS لوحة 6 جيدا، ثم نقل إلى الأنبوب. </ لى>
- كولاجيناز ذوبان الجليد على الجليد. إضافة كولاجيناز إلى تركيز النهائي من 0.01٪ وختم الأنبوب مع بارافيلم. احتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 4 ساعة.
- بعد مرور فترة الحضانة، وملء الأنبوب مع DMEM مع 20٪ FBS، حتى الحجم الكلي هو 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج، RT لمدة 10 دقيقة.
- إزالة طاف دون الإخلال بيليه وإضافة 40 مل من وسائل الاعلام لresuspend الكرية.
- كرر الخطوات من 1.1.10-1.1.11.
- Resuspend وبيليه في 25 مل من DMEM مع 20٪ FBS وانتظر كتل كبيرة من الأنسجة لتنزل الى القاع.
- نقل طاف على طبق 100 ملم واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 14 يوم.
- صيانة خلية زليلية والتوسع
- تجاهل وسائل الإعلام المستخدمة من لوحة وغسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
- إضافة 1 مل PBS / 1 ملم EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 2 دقيقة.
- اضغط على طبق بلطف وحوالةص الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الخلايا في 250 x ج، RT لمدة 2 دقيقة.
- إزالة طاف دون الإخلال بيليه و resuspend بيليه في 30 مل من DMEM مع FBS 20٪.
- نقل الخلايا إلى 3 × 100 مم أطباق، دون ترك أي بقايا المواد المرئية.
- استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الجديدة كل 3 د. انقسام الخلايا في 80٪ confluency باستخدام 1 مل PBS / 1 ملم EDTA. المحافظة حتى مرور 3 قبل الاستخدام. تقسيم كل طبق من الخلايا في 3 أطباق في كل انقسام.
ملاحظة: بعد وصول مرور 3، الخلايا التي لن يتم استخدامها على الفور يمكن تجميد.
2. إعادة برمجة FLSs عن طريق ترميز Lentiviruses العوامل ياماناكا
- تنبيغ (D0)
- البذور 3 × 10 4 خلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا في وسائط النمو (500 مل من DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
- في اليوم التالي، وإزالة قارورة واحدة من الفيروسة البطيئة التي تحتوي على 4 ياماناكا عوامل هي: Oct4، Klf4، Sox2 وج. Myc على من الفريزر وذوبان الجليد في 4 درجات مئوية. ملاحظة: تم إنتاج الفيروسة البطيئة من قبل الإجراء الموضح في دراسة سابقة لدينا 11.
- في حين ذوبان الفيروس، وتغيير وسائل الاعلام وسائل الاعلام النمو FLS (20٪ FBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية في DMEM) تحتوي على 10 ميكروغرام / مل بروميد hexadimethrine و 50 ميكروغرام / مل حامض الاسكوربيك.
- بعد تغيير وسائل الإعلام، إضافة 30 ميكرولتر من الفيروسة البطيئة للخلايا وتخلط بلطف. لتحسين العدوى، وأجهزة الطرد المركزي لوحة في 680 x ج، 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بعد الطرد المركزي، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
- الصيانة حتى إعادة برمجة مرئيا
- لمدة 3 أيام، واستبدال وسائل الإعلام يوميا مع وسائل الإعلام نمو FLS تحتوي على 0.1 ملي الزبدات الصوديوم و 50 ميكروغرام / مل حامض الاسكوربيك.
- في اليوم التالي، واستبدال وسائل الإعلام مع خليط من وسائط النمو FLS ووسائل الاعلام التوجيهية (نسبة 1: 1) تحتوي على 0.1 ملي الزبدات الصوديوم و 50 ميكروغرام / مل حامض الاسكوربيك.
ملاحظة: يتم إعطاء مكونات وسائل الإعلام التوجيهية في قائمة المواد / المعدات.
- خلايا تقسيم لمستعمرة تشكيل
- إعداد لوحة 6 جيدا المغلفة vitronectin.
- إضافة 60 ميكرولتر vitronectin إلى 6 مل PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+. ضع 2 مل من الخليط في كل الآبار واحتضان في RT لا يقل عن 1 ساعة. ملاحظة: إن تركيز عمل vitronectin هو 5 ميكروغرام / مل.
- على D5، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة 1 مل PBS / 1 ملم EDTA لفصل الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 2 دقيقة.
- حصاد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج، RT لمدة 2 دقيقة.
- انقسام الخلايا في 3 نسب مختلفة (1: 3، 1: 6 و 1: 9) لتحقيق confluencies مختلفة. إضافة 900 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى الخلية بيليه و resuspend. إضافة 300، 150، و 100 ميكرولتر من الخليط خلية لكل بئر من 6-كذلك لوحة لتحقيق نسبة 1: 3، 1: 6 و 1: 9 على التوالي.
- استبدال وسائل الإعلام يوميا مع وسائل الاعلام التوجيهية حتى تظهر المستعمرات. سوف تظهر المستعمرات بعد حوالي D18. ملاحظة: في هذه المرحلة، المستعمرات IPSC تتعايش مع FLSs غير برمجتها.
- إعداد لوحة 6 جيدا المغلفة vitronectin.
- مستعمرة قطف
- إعداد لوحة 48-جيدا المغلفة vitronectin بإضافة 500 ميكرولتر vitronectin إلى الآبار، واحتضان على RT لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
- وضع المجهر على مقاعد البدلاء النظيفة، وإزالة لوحة 6 جيدا من الحاضنة.
- إزالة حل vitronectin من لوحة 48-جيدا وإضافة 500 وسائل الاعلام التوجيهية ميكرولتر تستكمل مع المرتبطة رو-10MM، ملفوف لفائف تحتوي على البروتين كيناز (ROCK) المانع.
- باستخدام طرف 10P ماصة، وقطع جميع أنحاء المستعمرة. نقل مستعمرة التقطت لجانب واحد من لوحة 48-جيدا.
- بعد اختيار عدة مستعمرات، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- الحفاظ على الخلايا حتى المستعمرات هي إينو الكبيرلاف للنقل. ملاحظة: نحن عادة المسكوب الخلايا عندما يحصل على مستعمرة من الحقل المرئي من المجهر، عندما ينظر إليها في التكبير 100X.
3. المناعي تلطيخ
- إعداد الخلية
- وضع معقم 18 مم غطاء زجاجي في لوحة 12-جيدا.
- إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني لتبرد وشطف الزجاج غطاء.
- استبدال مع 1 مل من / مل vitronectin حل 10 ميكروغرام.
- احتضان لوحة في RT لا يقل عن 1 ساعة.
- تجاهل الحل vitronectin وiPSCs لوحة في لوحة 12-جيدا المغلفة vitronectin والثقافة لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، وتغيير وسائل الإعلام يوميا.
- تلطيخ الخلايا
- تجاهل وسائل الإعلام والثقافة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة.
- إصلاح الخلايا في 0.4٪ امتصاص العرق (PFA) لمدة 30 دقيقة في RT.
- Permeabilize الخلايا مع 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق على RT.
- إزالة permeabilizationحل وكتلة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA) لمدة 30 دقيقة في RT.
- تمييع الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA وفقا للجدول 1. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 ساعة على RT.
- إضافة الضد الثانوية (المخفف 1: 200)، واحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة على RT، وتجنب ضوء.
- علاج الخلايا مع 1 ميكرولتر / مل دابي لمدة 10 دقيقة.
- وضع غطاء زجاجي على أعلى من الزجاج الشرائح مع antifade كاشف واحتضانها في RT لمدة 24 ساعة، وتجنب ضوء.
- تحقق من التعبير مع المجهر مضان.
4. في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-PCR)
- استخراج مرنا من بيليه الخلية باستخدام guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم طريقة استخراج 11.
- تضخيم [كدنا من 2 ميكروغرام من إجمالي مرنا باستخدام النسخ العكسي 11.
- خلط المكونات المطلوبة لPCR باستخدام 2 ميكرولتر من [كدنا تيملوحة (11).
- أداء RT-PCR والتحقق من النتائج وفقا لهلام الكهربائي 11.
5. الفوسفاتاز القلوية (ا ف ب) تلطيخ
- iPSCs الثقافة لمدة 5-7 أيام عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 قبل تلطيخ.
- نضح في وسائل الإعلام وإصلاح الخلايا مع PFA 4٪ لمدة 1 دقيقة.
- تجاهل تثبيتي، وشطف الخلايا مع عازلة شطف 1X.
- إعداد الكواشف لAP تلطيخ. مزيج من المواد الكيميائية في نسبة التالية: سريع الأحمر البنفسج: نفثول AS-BI حل الفوسفات: الماء = 2: 1: 1.
- احتضان الخلايا مع حل تلطيخ على RT لمدة 15 دقيقة، وتجنب ضوء.
- تجاهل الحل تلطيخ وشطف الخلايا مع العازلة الشطف.
- تغطية الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمنع جفاف والتحقق من التعبير باستخدام المجهر مشرق الميدان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة، وصفنا بروتوكول لتوليد iPSCs من FLSs باستخدام نظام lentiviral. ويبين الشكل 1A مخطط بسيط للبروتوكول العزلة FLS. وبعد الاستئصال الجراحي للالزليلي، والمفروم النسيج الى قطع صغيرة باستخدام مقص جراحي. وأضاف كولاجيناز لعزل الخلايا من كتل من الأنسجة. وحضنت الخلايا لمدة 14 يوما قبل مزيد من المعالجة. ويبين الشكل 1B مورفولوجية FLSs معزولة. واستمرت الخلايا لمدة 3 مقاطع قبل الاستخدام. مشاركة FLSs صفة مماثلة مع الخلايا الليفية العامة. أعرب لدينا معزولة FLSs والتليف، فيمنتين وفيبرونكتين]. كما أظهرت RA FLSs معزولة التعبير المنخفض للعلامة خلية زليلية مثل بلعم، CD68 (الشكل 1C).
تم حصادها FLSs وtransduced مع lentiviruses تحتوي على 4 ياماالعوامل ناكا لإعادة البرمجة. بعد تقسيم الخلايا في نسب مختلفة (D7)، التي مستعمرات صغيرة على ما يبدو. المستعمرات مرئية، كما هو مبين في الشكل 2A، ظهرت في D8-11. المستعمرات يمكن التقاطها من هذه النقطة. ويبين الشكل 2B صورة لمستعمرة اختار وتضخيمها.
تم توسيع iPSCs حتى مرور 5-10 ومن ثم استخدامها في مختلف المقايسات. تتميز المجالس الاقتصادية والاجتماعية غير متمايزة من قبل على مستوى عال من AP. كانت ملطخة الخلايا للAP لتأكيد حالة غير متمايزة. وأعرب RA-iPSCs AP (الشكل 2C)، مما يدل على أنهم غير متمايزة. تم فحص التعبير علامة المحفزة (الشكل 2D، E). وأكد التعبير عن علامات المحفزة مثل Oct3 / 4، Sox2، NANOG، Lin28، DPPB5 وTDGF1 باستخدام RT-PCR (الشكل 2D). التعبير عن Oct3 / 4، وأكد Sox2 أيضا المناعي لnalysis مع علامات إضافية مثل SSEA4، هيئة تنظيم الاتصالات، 1-60، 1-81 هيئة تنظيم الاتصالات وKlf4. هيئة تنظيم الاتصالات 1-60، والتي يعتقد حاليا أن تكون علامة IPSC أهم، وأعرب غاية في iPSCs ولدت لدينا.
لمزيد من التحليل، أجرينا تنميط نووي وفحص مسخي. وأظهرت RA-iPSCs نمط الكروموسومات العادي من 44 + XY (الشكل 3A). حقن 12 أسابيع منصب RA-iPSCs في الفئران SCID، وكان مسخي المبيض شكلت وعرضها الأنسجة المختلفة، مثل الغدة، الأنسجة الدهنية والأوعية الدموية (الشكل 3B). تم تأكيد التمايز طبقة الجرثومية أيضا من خلال تلطيخ المناعي. كانت ملطخة خلايا الأديم الظاهر النسب بشكل إيجابي لOtx2. وأعرب خلايا أرومية متوسطة براتشيوري، وأكدت الأديم من تلطيخ إيجابي من SOX17.
الشكل 1: Protocرأ لFLS عزل من مريض التهاب المفاصل الروماتويدي. (A) رسم تخطيطي بسيط عن الطريقة المستخدمة لعزل خلية زليلية. (ب) مورفولوجية FLSs معزولة. (C) الإسفار المجهري صورة FLSs ملطخة علامات متليفة فيمنتين، فبرونيكتين وخلية زليلية علامة تشبه البلاعم، CD68. جميع الحانات مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: جيل من iPSCs من FLSs المعزولة من مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي صورة (A) برايت مجال مستعمرة التوجيهية قبل اختيار. (ب) صورة من مستعمرة بعد حصوله. (C) مستعمرة الملون لAP. (D) PCR تحليل سعلامات المحفزة F. (E) الإسفار المجهري صورة iPSCs. أعربت iPSCs الناتجة عن علامات المحفزة. جميع الحانات مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل النمط النووي ومسخي الفحص (A) عالية الدقة G النطاقات الصور تظهر karyograms طبيعي من iPSCs. تمثل صورة ل46XY العادي مضاعفا الذكور محتوى الكروموسومات. (ب) نتائج فحوصات مسخي وتلطيخ المناعي. جميع الحانات مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قبل اكتشاف iPSCs والعلماء تستخدم أساسا المجالس الاقتصادية والاجتماعية لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية والأنساب الخلية الأخرى من خلال التمايز. ومع ذلك، المجالس الاقتصادية والاجتماعية تنشأ من الكتلة الداخلية من الكيسة، وهو الجنين في مرحلة مبكرة. لعزل المجالس الاقتصادية والاجتماعية، وتدمير الكيسة أمر لا مفر منه، ورفع القضايا الأخلاقية التي من المستحيل التغلب عليها. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن المجالس الاقتصادية والاجتماعية لها خصائص stemness وتعدد القدرات، التي لا يمكن الحصول عليها من الأفراد وتكون في بعض الأحيان ليس أداة مثالية لتحليل الشخصية وفحص الأمراض.
في عام 2007، تاكاهاشي آخرون. iPSCs المتولدة من الخلايا الليفية الإنسان (2). من الناحية النظرية، على عكس المجالس الاقتصادية والاجتماعية، iPSCs يمكن أن تتولد من أي الخلايا الجسدية الكبار. مع هذه الميزة، ويعتقد iPSCs أن تكون أداة مثالية للزرع لصناعة السيارات في الخلية. أيضا، مع مفهوم ذاكرة جينية، ويعتقد iPSCs أن تكون المواد خلية مثالية لمحاكاة الظروف المسببة للأمراض، أي. النمذجة المرض. كانت هناك العديد من الدراسات التي أجريت باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا مثل خلايا الدم، وخلايا البول وأكثر من ذلك. ومع ذلك، وهناك العديد من أنواع الخلايا، مثل FLSs، التي لم تجر إعادة برمجة.
أمراض التهاب المفاصل والاضطرابات المناعية الرئيسية التي يمكن أن تسبب إعاقة دائمة. والتهاب المفاصل الروماتويدي ينجم عن التهاب مزمن في المفاصل، resultimg في نهاية المطاف في العظام والغضاريف ضرر. ومن الصعب لعلاج أو عكس الضرر خاصة لأن الغضروف لا يمكن أن تستعيد في الجسم الحي. لذلك الدواء باستخدام التجدد iPSCs هي أداة حاسمة جديدة للعلاج من التهاب المفاصل الروماتويدي. أسفرت فقدان العظام والغضاريف أيضا في تشكيل متقطعة مزنية. متقطعة مزنية هو بنية تشبه قرن والتي يمكن مشاهدتها في الصورة النسيجية من المفصل. ويتكون متقطعة مزنية من FLSs التي تتكاثر دون حدود مثل الخلايا السرطانية. لذلك، يعتقد أن FLSs يمكن أن تعكس الخصائص المرضية للمرض. في هذه الدراسة، كنا المريض FLقوات الأمن الخاصة لتوليد iPSCs.
FLSs هي نوع من الخلايا الرئيسية التي تسهم في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي. كما خلية التي يتعرض معظمها للبيئة التهابات داخل مفصل زلالي، يعتقد مجموعتنا أنه يمكن استخدامها كمادة يعكس حالة مرض المريض. لذلك، وذلك باستخدام أقدم طريقة لإعادة برمجة، حاولنا لتوليد iPSCs-RA محددة من FLSs، وذلك باستخدام تسليم 4 ياماناكا العوامل - Oct3 / 4، Sox2، Klf4 وج. Myc على - من الفيروسة البطيئة. تم عزل FLSs من الغشاء الزليلي الذي تمت إزالته. كان تقليم الغشاء الزليلي حاسما عندما عزل FLSs. يمكن العظام والدهون بقايا جعلها أكثر تعقيدا للحصول على FLSs نقية. أيضا، استخدام كولاجيناز أمر لا مفر منه لعزل FLS. من المهم أن استخدام الخلايا بين الممرات 3-8. عندما تصل FLSs مرور 3، يتم إنشاء عامل ياماناكا التي تحتوي على lentiviruses التالية الإجراء المنصوص عليه في عملنا السابق 11. باستخدام lentiviruses المنتجة، نجحنا لدت iPSCs المستمدة FLS-RA (RA-iPSCs). تم إنشاؤها استنساخ IPSC نقية من طريقة مستعمرة قطف. وأعرب RA-iPSCs كل علامات النسخ المحفزة وكان النمط النووي العادي. وعلاوة على ذلك، كانت قادرة على التمايز إلى جميع الطبقات الجرثومية الثلاث وفقا لفحص مسخي وRA-iPSCs. أيضا، ونحن قد أكد أن RA-iPSCs أظهرت المزيد من تمعدن عندما متباينة في الأنساب عظمية في المختبر (لا تظهر البيانات) 11.
ومع ذلك، هناك بعض القيود على هذا الأسلوب. تتطلب Lentiviruses التكامل الجيني لإعادة البرمجة. KLF-4 و ج. Myc على هي الجينات المسرطنة ويمكن لهذه العوامل ياماناكا اثنين تسهيل نمو الورم في الجسم الحي. لذلك، قد لا يكون مثاليا لاستخدام هذه العوامل لتوليد مواد التطبيقات السريرية. وعلاوة على ذلك، FLSs والخلايا الليفية الجلد ليست صعبة الحصول عليها في العيادات. كما ورد في التقارير المختلفة، الخلايا الليفية الجلد (أي ديرمالا يمكن إلا أن الخلايا الليفية ل) أن يحصل عليها الخزعات لكمة. FLSs يمكن عزل إلا من خلال إجراء العمليات الجراحية الغازية ويتم تنفيذ هذه الجراحة في المرضى الذين يعانون من تضخم شديد الذين خضعوا لعملية جراحية في الركبة. لذلك، ليست هناك حاجة لاستخدام FLSs عند إعادة برمجة وغير RA التوجيهية. بالإضافة إلى ذلك، العملية التي من خلالها يتم إعداد الخلايا الليفية لإعادة البرمجة صعبة وتستغرق وقتا طويلا. مشاركة FLSs نفس العيوب كما الليفية الجلد. لذلك، يطلب من مصادر الخلايا التي هي أسهل في التعامل معها والحصول عليها.
لهذا السبب، بدأ الباحثون بالبحث عن مصدر خلية بديل. والمواد المستخدمة حاليا هي خلايا الدم. فمن السهل لسحب الدم وعملية العزل هي بسيطة نسبيا وسريعة. وعلاوة على ذلك، هناك تحول من استخدام lentiviruses إلى الأدوات التي لا تتطلب الجينوم التكامل، مثل نظم سينداي الفيروسية، جزيئات صغيرة، والبلازميدات episomal.
على الرغم من أن FLSs لا يمكن أن تستخدممادة للأفراد متنوعة، فإنه لا يزال مادة كبيرة عند إنشاء RA-iPSCs لأغراض البحث. في المستقبل، ونحن نتطلع لتوليد بنك التوجيهية المستمدة FLS-RA المريض. مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي تظهر بشكل فردي ردود الفعل المتنوعة إلى العقاقير التي تستخدم لعلاج. مع عدة أسطر من RA iPSCs، نأمل أن تولد خلية البنوك الفرز الدواء لمرضى التهاب المفاصل الروماتويدي. عن طريق فحص جميع الأدوية في كل سطر الخلية، ونحن قد تكون قادرة على التنبؤ المخدرات التي ستعمل على أي مريض على حدة.
في الختام، يصف هذا البروتوكول تطبيق تكنولوجيا التوجيهية لأمراض الروماتيزم. مع هذا البروتوكول، iPSCs يمكن أن تتولد من FLSs المستمدة مريض التهاب المفاصل الروماتويدي، وiPSCs ولدت لديهم الخصائص المطلوبة. هذه iPSCs يمكن استخدامها في الأبحاث السريرية، وفحص المخدرات، والنمذجة المرض، والطب التجديدي لمزيد من التحقيقات في بيولوجيا RA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
