Summary
Her beskriver vi en protokol til generering humane induceret pluripotente stamceller fra patient-afledt fibroblastlignende synoviocytter, ved anvendelse af en lentiviral system uden fødeceller.
Abstract
Modne somatiske celler kan vendes i en pluripotent stamcelle-lignende tilstand under anvendelse af et defineret sæt af omprogrammering faktorer. Talrige undersøgelser har genereret induceret-pluripotente stamceller (iPSCs) fra forskellige somatiske celletyper ved at transducere fire Yamanaka transkriptionsfaktorer: Oct4, Sox2, Klf4 og c-myc. Studiet af iPSCs forbliver på forkant med biologisk og klinisk forskning. Især kan patientspecifikke iPSCs anvendes som et banebrydende redskab til studiet af sygdom Patobiologi, eftersom iPSCs kan induceres fra vævet af en enkeltperson. Leddegigt (RA) er en kronisk inflammatorisk sygdom, klassificeret af ødelæggelse af brusk og knogle struktur i leddet. Synovial hyperplasi er en af de vigtigste årsager eller symptomer, der fører til disse resultater i RA. Fibroblastlignende synoviocytter (FLSs) er de vigtigste elementer celler i hyperplastisk synovium. FLSs i leddet limitlessly formere sig, efterhånden invaderer den tilstødende cartilalder og knogle. I øjeblikket kan det hyperplastiske synovium kun fjernes ved et kirurgisk indgreb. Det fjernede synovium anvendes til RA forskning som et materiale, der reflekterer den inflammatoriske tilstand af samlingen. Som en vigtig spiller i patogenesen af RA, kan FLSs anvendes som et materiale til at generere og undersøge iPSCs af RA-patienter. I denne undersøgelse, brugte vi FLSs af en RA patient at generere iPSCs. Ved hjælp af en lentiviral-system, opdagede vi, at FLSs kan generere RA patient-specifikke iPSC. De iPSCs genereres fra FLSs kan yderligere anvendes som et redskab til at studere patofysiologien af RA i fremtiden.
Introduction
Pluripotente stamceller er den næste generation platform i forskellige kliniske og biologiske område. De er et lovende redskab, der kan anvendes i sygdomsmodeller, drug screening, og regenerativ medicinsk terapi. Humane embryonale stamceller (hESCs) blev primært brugt til at studere og forstå pluripotente celler. Imidlertid isoleret ved ødelæggelse af den menneskelige blastocyst, er hESCs forbundet med flere etiske overvejelser. I 2007 Dr. Shinya Yamanaka og hans team vendt cellen programmeringsprocessen og udviklet stamceller fra menneskelige voksne somatiske celler 1,2. Derfor, i modsætning hESCs, inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) kan genereres fra modne somatiske celler, så man undgår de etiske forhindringer.
Normalt er iPSCs genereres af levering af fire eksogene gener: Oct4, Sox2, Klf4, og c-myc. Disse Yamanaka faktorer er oprindeligt leveres ved hjælp lentivirale og retrovirale systemer. De første iPSCs blev afledt fra muse somatisk calen 3. Bagefter blev teknikken i humane dermale fibroblaster 1,2. Efterfølgende undersøgelser held genereret iPSCs fra forskellige kilder, såsom urin 4, blod 5,6, keratinocytter 7, og flere andre celletyper. Der er dog nogle somatiske celler, der ikke er blevet anvendt i omprogrammering samt screening af omprogrammering kapaciteter af forskellige celletyper fra specifikke væv i sygdomstilstanden, stadig er nødvendig.
Rheumatoid arthritis (RA) er en sygdom, der kan ramme alle samlinger og føre til autoimmune tilstande i andre organer. RA påvirker omkring 1% af voksne i den udviklede verden. Det er en temmelig almindelig sygdom og forekomsten stiger hvert år 8. Men RA er svært at identificere i de tidlige stadier og oncebone ødelæggelse opstår der ingen behandling, der kan genvinde skaden. Endvidere lægemiddeleffektivitet forskellig fra patient til patient, og det er svært at forudsige lægeine der er påkrævet. Derfor er der behov for udviklingen af et lægemiddel-screeningsmetode, og en celle materiale, der kan afspejle betingelserne i RA er påkrævet.
Fibroblastlignende synoviocytter (FLSs) er en aktiv cellulær deltager i patogenesen af RA 9,10. FLSs findes i synovial intimal foring mellem ledkapslen og hulrum, som også omtales som synovium. Ved at støtte fælles struktur og tilvejebringelse næringsstoffer til det omgivende brusk, FLSs spille sædvanligvis en afgørende rolle i ledfunktion og vedligeholdelse. Imidlertid FLSs i RA har en invasiv fænotype. RA FLSs har en cancer-lignende fænotype, vinder ødelægge den omgivende knogle ved uendelig proliferation 10. Med denne unikke egenskab, kan FLSs anvendes som et lovende materiale, der kan afspejle patobiologien af RA. Alligevel er disse celler sjældent producerede, og cellefænotyper ændre, som cellerne gå gennem flere passager i in vitro
Teoretisk set kan RA patient-afledte iPSCs (RA-iPSCs) blevet et ideelt værktøj til screening narkotika og yderligere forskning. Genereret iPSCs har selvfornyelse evne og kan fastholdes og udbygges i vitro. Med pluripotens, kan disse celler differentieres til modne chondrocyt og osteocyt slægter, som kan bidrage cellemateriale for specifik forskning i RA og andre knogle sygdomme 11.
I denne undersøgelse, viser vi, hvordan man isolerer og udvide FLSs fra et kirurgisk fjernet synovium, og hvordan man kan generere RA-iPSCs fra FLSs hjælp lentivirus indeholder Yamanaka faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Denne undersøgelse protokol blev godkendt af institutionelle gennemgang bestyrelse det katolske universitet i Korea (KC12TISI0861).
1. synoviocyt Isolering og Udvidelse
- synoviocyt Isolation
- Sterilisere to par kirurgiske sakse og en tang.
- Overfør synovialvævet til en 100 mm skål og vask med 5 ml phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 1% penicillin / streptomycin.
- Skær gullige fedt væv og knogler rester. Overfør det trimmede væv til en brønd af en 6-brønds plade og tilsættes 5 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 20% føtalt bovint serum (FBS).
- Hak væv med saksen, indtil stykkerne er små nok til at trænge en engangspipette.
- Overfør vævs-holdige medier til et 50 ml konisk rør. Høst det resterende materiale ved tilsætning af 5 ml DMEM med 20% FBS til 6-brønds plade og derefter overføre til røret. </ Li>
- Thaw collagenase på is. Tilføj collagenase til en slutkoncentration på 0,01% og forsegle røret med parafilm. Inkuber i et vandbad ved 37 ° C under omrystning i 4 timer.
- Efter inkubation fylde røret med DMEM med 20% FBS, indtil det samlede volumen er 50 ml og centrifugeres ved 300 xg, stuetemperatur i 10 min.
- Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten og der tilsættes 40 ml medier for at resuspendere pelleten.
- Gentag trin 1.1.10-1.1.11.
- Pellet resuspenderes i 25 ml DMEM med 20% FBS og vente på de store klumper af væv til at synke til bunds.
- Supernatanten overføres til en 100 mm skål og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i 14 dag.
- Synoviocyt Vedligeholdelse og Udvidelse
- Kassere de anvendte medier fra pladen og vaske cellerne med 5 ml PBS.
- Tilsæt 1 ml PBS / 1 mM EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i 2 min.
- Tryk på fadet forsigtigt og overfr cellerne til et 15 ml konisk rør. Centrifugeres cellerne ved 250 x g, stuetemperatur i 2 min.
- Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten og pellet resuspenderes i 30 ml DMEM med 20% FBS.
- Overfør cellerne til 3 x 100 mm skåle, uden at efterlade synlige rester materiale.
- Udskift medier med friske medier hver 3 d. Split cellerne ved 80% konfluens ved anvendelse af 1 ml PBS / 1 mM EDTA. Vedligehold indtil passage 3 før brug. Opdel hver skål af celler i 3 retter i hver split.
BEMÆRK: Efter at have nået passage 3, kan celler, der ikke skal bruges straks fryses.
2. Omprogrammering FLSs Brug Lentivirus-koder Yamanaka Faktorer
- Transduktion (D0)
- Seed 3 × 10 4 celler pr brønd i en 6-brønds plade i vækstmedier (500 ml DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin). Inkubér cellerne O / N ved 37 ° C i 5% CO2.
- Den følgende dag, fjerne et hætteglas med lentivirus indeholdende 4 Yamanaka faktorer: Oct4, Klf4, Sox2 og c-myc fra fryseren og tø ved 4 ° C. Bemærk: lentivirus blev fremstillet ved fremgangsmåden beskrevet i vores tidligere undersøgelse 11.
- Mens optøning virus, ændre mediet til FLS vækstmedier (20% FBS plus antibiotika i DMEM) indeholdende 10 ug / ml hexadimethrinbromid og 50 ug / ml ascorbinsyre.
- Efter ændring af mediet, tilsættes 30 pi lentivirus til cellerne og blandes forsigtigt. At forbedre infektion, centrifugeres pladen ved 680 x g, 35 ° C i 30 minutter.
- Efter centrifugering inkuberes cellerne ved 37 ° C i 5% CO2.
- Vedligeholdelse Indtil Omprogrammering er Synlig
- For tre dage, erstatte medierne dagligt med FLS vækstmedier indeholdende 0,1 mM natriumbutyrat og 50 ug / ml ascorbinsyre.
- Den næste dag, erstatte medierne med en blanding af FLS vækstmedier ogiPSC media (1: 1-forhold) indeholdende 0,1 mM natriumbutyrat og 50 ug / ml ascorbinsyre.
Bemærk: Komponenterne i iPSC medier er givet i listen materialer / udstyr.
- Opdeling af celler for Colony Formation
- Forbered en vitronectin-coatede plade med 6 brønde.
- Tilføj 60 pi vitronectin til 6 ml PBS uden Ca2 + og Mg2 +. Sætte 2 ml blanding i hver brønde og inkuber i RT i mindst 1 time. Bemærk: Arbejdsgruppen koncentration af vitronectin er 5 ug / ml.
- På D5, vask af cellerne med PBS.
- Tilsæt 1 ml PBS / 1 mM EDTA for at frigøre cellerne og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 2 min.
- Cellerne høstes og centrifugeres ved 250 xg, stuetemperatur i 2 min.
- Split cellerne ved 3 forskellige forhold (1: 3, 1: 6, og 1: 9) for at opnå forskellige confluencies. Tilføj 900 pi medier til cellepelleten og resuspender. Der tilsættes 300, 150, og 100 pi af celleblandingen pr brønd af en 6-brønds plade til opnåelse af et forhold på 1: 3, 1: 6 og 1: 9.
- Udskift medierne dagligt med IPSC medier indtil kolonier vises. Kolonier vises efter ca. D18. Bemærk: På dette tidspunkt, IPSC kolonier sameksistere med den ikke-omprogrammeret FLSs.
- Forbered en vitronectin-coatede plade med 6 brønde.
- Colony plukning
- Der fremstilles en 48-brønd vitronectin-coatede plade ved tilsætning 500 pi vitronectin til brøndene, og der inkuberes ved stuetemperatur i mindst 1 time.
- Placer mikroskopet på et rent bænken, og fjern 6-brønds plade fra inkubatoren.
- Fjern vitronectin opløsningen fra 48-brønds plade og tilsæt 500 pi IPSC medium suppleret med 10 mM Rho-associeret, coiled-coil holdigt protein kinase (ROCK) inhibitor.
- Ved hjælp af en 10p pipettespids, skære omkring kolonien. Overfør det opsamlede koloni til en brønd af 48-brønds plade.
- Efter plukning flere kolonier, inkuberes cellerne ved 37 ° C, 5% CO2.
- Opretholde cellerne indtil kolonierne er store enoUH til overførsel. Bemærk: Vi normalt spildte cellerne når kolonien kommer ud af det synlige område af mikroskopet, når de ses på 100X forstørrelse.
3. Immunfluorescensfarvning
- celle Fremstilling
- Placer en steril 18 mm dækglas i en 12-brønds plade.
- Tilsæt 1 ml PBS at køle og skylle dækglasset.
- Erstat med 1 ml af en 10 ug / ml vitronectin opløsning.
- Inkubér pladen ved stuetemperatur i mindst 1 time.
- Kassér vitronectin opløsning og pladernes iPSCs i vitronectin-coatede plade med 12 brønde og kultur i 7 dage ved 37 ° C, 5% CO2, ændre mediet dagligt.
- cellefarvning
- Kassér dyrkningsmedierne og vask af cellerne med PBS én gang.
- Fikseres cellerne i 0,4% paraformaldehyd (PFA) i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Permeabilisere cellerne med 0,1% Triton X-100 i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern permeabiliseringopløsning og blok med PBS indeholdende 2% bovint serumalbumin (BSA) i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Fortynd antistofferne i PBS indeholdende 2% BSA i henhold til tabel 1. Inkubér cellerne med de primære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur.
- Tilføj det sekundære antistof (fortyndet 1: 200) og inkuber cellerne i 1 time ved stuetemperatur, undgå lys.
- Behandl cellerne med 1 pl / ml DAPI i 10 minutter.
- Placer dækglasset oven på objektglasset med antifade reagens og inkuberes ved stuetemperatur i 24 timer, undgå lys.
- Verificere ekspression med et fluorescensmikroskop.
4. Real-time polymerasekædereaktion (RT-PCR)
- Uddrag mRNA fra cellepelleten ved anvendelse af guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion metode 11.
- Forstærk cDNA fra 2 ug samlede mRNA ved hjælp af revers transkription 11.
- Bland nødvendige komponenter til PCR under anvendelse af 2 pi cDNA templade 11.
- Udfør RT-PCR og kontrollere resultaterne ved gelelektroforese 11.
5. alkalisk phosphatase (AP) Farvning
- Kultur iPSCs i 5-7 dage ved 37 ° C, 5% CO2 før farvning.
- Aspireres medierne og løse cellerne med 4% PFA i 1 min.
- Kassér fiksativ og skyl cellerne med 1X skyllepuffer.
- Forbered reagenser til AP farvning. Bland reagenserne i følgende forhold: Fast Red Violet: Naphthol AS-BI phosphatopløsning: vand = 2: 1: 1.
- Inkubér cellerne med farvningen opløsning ved stuetemperatur i 15 minutter, undgå lys.
- Kassér farvningsopløsning og skyl cellerne med skyllepuffer.
- Dæk cellerne med PBS for at forhindre udtørring og verificere udtryk ved hjælp af en lys-felt mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse beskriver vi en protokol til at generere iPSCs fra FLSs ved hjælp af et lentiviral system. Figur 1A viser et simpelt arrangement med FLS isolation protokollen. Efter kirurgisk fjernelse af synovium blev vævet hakket i små stykker med kirurgiske sakse. Collagenase blev tilsat for at isolere cellerne fra klumper af væv. Cellerne blev inkuberet i 14 dage før yderligere behandling. Figur 1B viser morfologi isolerede FLSs. Celler blev opretholdt i 3 passager før brug. FLSs deler en lignende karakteristik med generelle fibroblaster. Vores isolerede FLSs udtrykte fibrotiske markører, vimentin og fibronectin. Det isolerede RA FLSs viste også lav ekspression af makrofag-lignende synoviocyt markering, CD68 (figur 1C).
FLSs blev høstet og transduceret med lentivirus indeholdende 4 Yamanaka faktorer for omprogrammering. Efter spaltning af cellerne på forskellige forhold (D7), små kolonier begyndte at dukke op. Synlige kolonier, som vist i figur 2A, optrådte på D8-11. Kolonier kan plukkes fra dette punkt. Figur 2B viser et billede af en plukket og amplificeret koloni.
iPSCs blev ekspanderet indtil passage 5-10 og derefter anvendt i forskellige assays. Udifferentierede økonomiske og sociale råd er kendetegnet ved et højt niveau af AP. Celler blev farvet for AP at bekræfte den udifferentierede tilstand. RA-iPSCs udtrykte AP (figur 2C), hvilket indikerer at de er udifferentierede. Pluripotent markør ekspression blev undersøgt (figur 2D, E). Ekspressionen af pluripotente markører, såsom Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28, DPPB5 og TDGF1 blev bekræftet under anvendelse af RT-PCR (figur 2D). Udtrykket af Oct3 / 4, blev Sox2 bekræftes også af immunfluorescens enNALYSE med yderligere markører såsom SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 og Klf4. TRA-1-60, som i øjeblikket menes at være den vigtigste iPSC markør, blev stærkt udtrykt i vores genereret iPSCs.
For yderligere analyse, vi udførte karyotypebestemmelse og teratom assay. RA-iPSCs viste et normalt kromosomsæt mønster af 44 + XY (figur 3A). 12 uger post injektion af RA-iPSCs i SCID-mus, var teratomer dannet og vises forskellige væv, såsom kirtel, fedtvæv og blodkar (figur 3B). Kim lag differentiering blev også bekræftet gennem immunfluorescensfarvning. Ektoderm afstamningsceller blev positivt farvet for Otx2. Mesodermale celler udtrykte Brachyury, og endoderm blev bekræftet ved positiv farvning af SOX17.
Figur 1: Protocol for FLS Isolering fra en RA Patient. (A) En simpel diagram over den anvendte metode til synoviocyt isolation. (B) Morfologi af isolerede FLSs. (C) Fluorescensmikroskopi billede af FLSs farvet med fibrotisk markører vimentin, fibronectin og en makrofag-lignende synoviocyt markering, CD68. Alle Scale barer = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Generering af iPSCs fra FLSs isoleret fra en RA Patient (A) Lys-field billede af en iPSC koloni før plukke.. (B) Billede af en koloni efter plukningen. (C) Colony farvet for AP. (D) PCR-analyse of pluripotente markører. (E) Fluorescens mikroskopi billede af iPSCs. De genererede iPSCs udtrykte alle de pluripotente markører. Alle Scale barer = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Karyotype Analyse og Teratom Assay (A) Høj opløsning G-banded billeder viser normale karyograms af iPSCs.. Billedet repræsenterer en 46XY normal diploid mandlige kromosomale indhold. (B) Resultater af teratoma assays og immunfluorescensfarvning. Alle Scale barer = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Før opdagelsen af iPSCs, videnskabsfolk hovedsagelig anvendes sektorråd at studere stamcellebiologi og andre cellelinier gennem differentiering. Men ØSR stammer fra den indre masse af en blastocyst, som er et tidligt stadie foster. For at isolere økonomiske og sociale råd, ødelæggelse af blastocyst er uundgåelig, hæve etiske spørgsmål, der er umulige at overvinde. Selv om økonomiske og sociale råd har stemness egenskaber og pluripotens, de kan ikke tappes fra personer og er nogle gange ikke et ideelt værktøj til personlig analyse og screening sygdom.
I 2007 Takahashi et al. genererede iPSCs fra humane fibroblaster 2. Teoretisk modsætning økonomiske og sociale råd, iPSCs kan genereres fra enhver voksne somatiske celler. Med denne fordel, er iPSCs menes at være det ideelle værktøj til auto-celle transplantation. Også med begrebet epigenetisk hukommelse, iPSCs menes at være den ideelle cellemateriale til simulering af patogene tilstande, dvs.. Sygdom modellering. Der har været mange undersøgelser udført under anvendelse af forskellige typer af celler, såsom blodlegemer, urin-celler og mere. Men der er mange celletyper, såsom FLSs, hvori omprogrammering ikke er blevet gennemført.
Gigtsygdomme er store immune lidelser, der kan forårsage permanent invaliditet. RA er forårsaget af kronisk inflammation i leddene, til sidst resultimg i knogler og brusk skader. Det er svært at helbrede eller vende skaden især fordi brusk ikke kan regenerere in vivo. Derfor regenerativ medicin ved hjælp iPSCs er en ny kritisk værktøj til helbredelse af RA. Knoglen og brusktab er også resulteret i pannusdannelse. Pannus er et horn-lignende struktur, der kan ses i histologiske billede af samlingen. Den pannus er lavet af FLSs der formere limitlessly ligesom kræftceller. Derfor menes det, at den FLSs kan afspejle de patologiske egenskaber ved sygdommen. I denne undersøgelse anvendte vi patient FLSs at generere iPSCs.
FLSs er den største celletype, der bidrager til patogenesen af RA. Som en celle, der er mest udsat for den inflammatoriske miljø inde i synovial joint, vores gruppe mente, at det kan anvendes som et materiale, der afspejler patientens sygdomstilstand. Derfor bruger den tidligste omprogrammering metode, vi har forsøgt at generere RA-specifikke iPSCs fra FLSs, ved hjælp af levering af 4 Yamanaka faktorer - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-Myc - ved lentivirus. FLSs blev isoleret fra den fjernede synovium. Den trimning af synovium var kritisk, når isolere FLSs. Ben og fedt rester kan gøre det mere kompliceret at opnå ren FLSs. Også brugen af collagenase er uundgåeligt for FLS isolation. Det er vigtigt at bruge celler mellem passager 3-8. Når FLSs nå passage 3, er det Yamanaka faktor indeholder lentivirus genereret efter den nævnt i vores tidligere arbejde 11. Brug af den producerede lentivira, Vi med succes genereret RA-FLS-afledte iPSCs (RA-iPSCs). Pure IPSC kloner blev genereret af koloni plukning metode. RA-iPSCs udtrykte alle de pluripotente transskription markører og havde en normal karyotype. Endvidere RA-iPSCs kunne differentiere til alle tre kimlag ifølge teratom assay. Vi har også bekræftet, at RA-iPSCs viste mere mineralisering når differentieret i osteogene afstamninger in vitro (data ikke vist) 11.
Der er dog nogle begrænsninger for denne metode. Lentivira kræver genomisk integration til omprogrammering. KLF-4 og C-Myc er onkogener og disse to Yamanaka faktorer kan lette tumorvækst in vivo. Derfor kan det ikke være ideelt at anvende disse faktorer til at generere materialer til kliniske anvendelser. Desuden FLSs og hud fibroblaster er ikke svært at opnå i klinikker. Som nævnt i forskellige rapporter, hudfibroblaster (dvs. dermal fibroblaster) kan kun opnås ved Hulning biopsier. FLSs kan kun isoleres ved en invasiv kirurgisk procedure, og denne operation er udført på patienter med svær hyperplasi, der har gennemgået en knæoperation. Der er derfor ikke nødvendigt at bruge FLSs når omprogrammering en ikke-RA iPSC. Derudover proces, hvorved fibroblaster er forberedt til omprogrammering er vanskelig og tidskrævende. FLSs deler de samme mangler som hud fibroblaster. Derfor er celle, der er lettere at håndtere og opnå påkrævet.
Af denne grund har forskere begyndt at søge efter en alternativ cellekilde. En for tiden anvendte materiale er blodceller. Det er let at trække blod og isoleringen processen er forholdsvis enkel og hurtig. Desuden er der et skift fra brugen af lentivira til værktøjer, der ikke kræver genom-integration, såsom Sendai virale systemer, små molekyler og episomale plasmider.
Selvom FLSs ikke kan anvendes somet materiale til forskellige individer, er det stadig en stor materiale, når du genererer RA-iPSCs til forskningsformål. I fremtiden ser vi at generere en RA-patient FLS-afledte iPSC bank. RA-patienter viser individuelt forskelligartede reaktioner på lægemidler, der anvendes til behandling. Med flere linjer af RA iPSCs, håber vi at generere en lægemiddel-screening celle-bank for RA-patienter. Ved at screene alle lægemidler på hver cellelinie, kan vi være i stand til at forudsige, hvilke narkotika vil arbejde på, som enkelte patient.
Afslutningsvis denne protokol beskriver anvendelsen af iPSC teknologi til reumatologi. Med denne protokol, kan iPSCs genereres fra RA patient-afledte FLSs, og de genererede iPSCs har de nødvendige egenskaber. Disse iPSCs kan bruges i klinisk forskning, narkotika screening, sygdom modellering og regenerativ medicin for yderligere undersøgelser af biologi RA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
