Summary
Qui si descrive un protocollo per la generazione di cellule staminali indotte pluripotenti-umani da sinoviociti fibroblasti come derivati da pazienti, utilizzando un sistema lentivirale senza cellule di alimentazione.
Abstract
cellule somatiche maturi possono essere invertiti in uno stato di cellule staminali pluripotenti, come usando un insieme definito di fattori di riprogrammazione. Numerosi studi hanno generato indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) da vari tipi di cellule somatiche da trasduzione quattro fattori di trascrizione Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Lo studio di iPSCs rimane all'avanguardia della ricerca biologica e clinica. In particolare, iPSCs paziente-specifici possono essere utilizzati come strumento pionieristica per lo studio della malattia pathobiology, poiché iPSCs possono essere indotte dal tessuto di ogni individuo. L'artrite reumatoide (AR) è una malattia infiammatoria cronica, classificati per la distruzione della cartilagine e struttura ossea nelle articolazioni. iperplasia sinoviale è uno dei motivi principali o sintomi che portano a questi risultati in RA. Sinoviociti fibroblasti-like (FLSS) sono le principali cellule del componente della membrana sinoviale iperplastica. FLSS nel giunto senza limiti proliferano, alla fine invadere il cartil adiacenteetà e osso. Attualmente, la membrana sinoviale iperplastica può essere rimosso solo da un intervento chirurgico. La sinovia rimosso viene utilizzato per la ricerca RA come un materiale che riflette la condizione infiammatoria dell'articolazione. Come un giocatore importante nella patogenesi della RA, FLSS può essere utilizzato come materiale per generare e studiare le iPSCs di pazienti affetti da AR. In questo studio, abbiamo usato il FLSS di un paziente RA per generare iPSCs. Utilizzando un sistema lentivirale, abbiamo scoperto che FLSS può generare RA paziente-specifici IPSC. I iPSCs generati da FLSS possono essere ulteriormente utilizzati come strumento per studiare la fisiopatologia della RA in futuro.
Introduction
Le cellule staminali pluripotenti sono la piattaforma di prossima generazione in vari campi clinici e biologici. Sono uno strumento promettente che può essere utilizzato in modelli di malattia, screening di farmaci, e la terapia medica rigenerativa. Umani cellule staminali embrionali (hESC) sono stati utilizzati principalmente per studiare e comprendere le cellule pluripotenti. Tuttavia, isolato dalla distruzione della blastocisti umana, hESC sono associati a diverse preoccupazioni etiche. Nel 2007, il dottor Shinya Yamanaka e il suo team invertito il processo di programmazione delle cellule e hanno sviluppato le cellule staminali adulte da cellule somatiche umane 1,2. Pertanto, a differenza di hESC, indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) possono essere generati da cellule somatiche mature, evitando gli ostacoli etici.
Di solito, iPSCs vengono generati con la consegna di quattro geni esogeni: Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc. Questi fattori Yamanaka sono originariamente forniti con sistemi lentivirali e retrovirali. I primi iPSCs sono stati ottenuti da topo somatica cells 3. Successivamente, la tecnica è stata applicata ai fibroblasti dermici umani 1,2. Studi successivi hanno generato con successo iPSCs da varie fonti, come ad esempio urina 4, il sangue 5,6, i cheratinociti 7, e diversi altri tipi di cellule. Tuttavia, ci sono alcune cellule somatiche che non sono stati utilizzati nella riprogrammazione, e lo screening delle capacità riprogrammazione dei vari tipi di cellule provenienti da tessuti specifici in stato di malattia, è ancora necessaria.
L'artrite reumatoide (AR) è una malattia che può colpire tutte le articolazioni e portare a condizioni autoimmuni in altri organi. RA colpisce circa l'1% degli adulti nel mondo sviluppato. Si tratta di una malattia piuttosto comune e la sua incidenza aumenta ogni anno 8. Tuttavia, RA è difficile da individuare nelle fasi iniziali e oncebone distruzione si verifica non esiste alcun trattamento in grado di recuperare il danno. Inoltre, l'efficacia dei farmaci differisce da paziente a paziente, ed è difficile prevedere il medicoine che è richiesto. Pertanto, è necessario lo sviluppo di un metodo di screening droga, ed è richiesto un materiale cella che può riflettere le condizioni di RA.
Sinoviociti fibroblasto-simili (FLSS) sono un partecipante cellulare attivo nella patogenesi di RA 9,10. FLSS esiste nel rivestimento intimale sinoviale tra la capsula articolare e la cavità, che viene indicato anche come sinovia. Sostenendo la struttura comune e fornendo nutrienti alla cartilagine circostante, FLSS di solito giocano un ruolo cruciale nella funzione e la manutenzione delle articolazioni. Tuttavia, FLSS in AR hanno un fenotipo invasivo. RA FLSS hanno un fenotipo cancro-come, eventualmente distruggendo l'osso circostante dalla proliferazione infinita 10. Con questa caratteristica unica, FLSS può essere utilizzato come materiale promettente che può riflettere la pathobiology di RA. Eppure, queste cellule sono raramente prodotte, ei fenotipi cellulari alterano le cellule passano attraverso diversi passaggi in vitro
Teoricamente, RA iPSCs paziente-derivati (RA-iPSCs) possono diventare uno strumento ideale per lo screening di farmaci e ulteriori ricerche. IPSCs generati hanno la capacità di auto-rinnovamento e possono essere mantenuti e ampliati in vitro. Con pluripotenza, queste cellule possono essere differenziate in maturi condrociti e osteociti lignaggi, che possono contribuire materiale cellulare per la ricerca specifica in AR e altre malattie delle ossa legate 11.
In questo studio, abbiamo dimostrato come isolare ed espandere FLSS da una sinovia rimosso chirurgicamente, e come generare RA-iPSCs da FLSS utilizzando lentivirus contenenti fattori di Yamanaka.
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Protocol
Etica Dichiarazione: Questo protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università Cattolica di Corea (KC12TISI0861).
1. Isolamento sinoviociti ed espansione
- Isolamento sinoviociti
- Sterilizzare due paia di forbici chirurgiche e un paio di pinze.
- Trasferire il tessuto sinoviale ad un piatto 100 mm e lavare con 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 1% di penicillina / streptomicina.
- Tagliare i residui di tessuto grasso e ossa giallastre. Trasferire il tessuto tagliato per un pozzo di un 6-pozzetti e aggiungere 5 ml di terreno di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) con il 20% di siero fetale bovino (FBS).
- Tagliare i tessuti con le forbici finché i pezzi sono abbastanza piccole da penetrare in una pipetta monouso.
- Trasferire il supporto tissutale contenente in una provetta conica da 50 ml. Raccogliere il materiale rimanente aggiungendo 5 ml di DMEM con 20% FBS a 6 pozzetti e poi trasferire al tubo. </ Li>
- collagenasi disgelo sul ghiaccio. Aggiungere collagenasi ad una concentrazione finale di 0,01% e sigillare il tubo con parafilm. Incubare a bagnomaria a 37 ° C con agitazione per 4 ore.
- Dopo l'incubazione, riempire il tubo con DMEM con 20% FBS, finché il volume totale è 50 ml e centrifugare a 300 xg, RT per 10 min.
- Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere 40 ml di media per risospendere il pellet.
- Ripetere i passaggi 1.1.10-1.1.11.
- Risospendere il pellet in 25 ml di DMEM con 20% FBS e aspettare che i grandi ciuffi di tessuto a depositarsi sul fondo.
- Trasferire il supernatante in un piatto 100 mm e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 14 giorni.
- Sinoviociti mantenimento e l'espansione
- Eliminare i supporti utilizzati dalla piastra e lavare le cellule con 5 ml di PBS.
- Aggiungere 1 ml di PBS / 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 2 min.
- Toccare il piatto delicatamente e transfer le cellule in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare le cellule a 250 xg, RT per 2 min.
- Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in 30 ml di DMEM con 20% FBS.
- Trasferire le cellule a 3 x 100 mm piatti, senza lasciare alcun materiale residuo visibile.
- Sostituire il supporto con mezzi freschi ogni 3 d. Dividere le cellule a 80% di confluenza con 1 ml di PBS / 1 mM EDTA. Mantenere fino a passaggio 3 prima dell'uso. Dividere ogni piatto di cellule in 3 piatti in ogni frazione.
NOTA: Dopo aver raggiunto il passaggio 3, cellule che non stanno per essere utilizzato immediatamente possono essere congelati.
2. Riprogrammazione FLSS Utilizzando Lentivirus-codificano fattori di Yamanaka
- Trasduzione (D0)
- Seed 3 × 10 4 cellule per pozzetto di un 6-pozzetti in terreni di crescita (500 ml di DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina). Incubare le cellule O / N a 37 ° C in 5% CO2.
- Il giorno seguente, togliere un flaconcino di lentivirus contenente 4 Yamanaka fattori: Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc dal freezer e scongelare a 4 ° C. Nota: Lentivirus è stato prodotto mediante il procedimento descritto nel precedente studio 11.
- Mentre lo scongelamento il virus, cambiare i mezzi di comunicazione a supporto della crescita FLS (20% FBS più antibiotici in DMEM) contenente 10 mg / ml di bromuro hexadimethrine e acido ascorbico 50 mg / ml.
- Dopo aver cambiato i media, aggiungere 30 ml di lentivirus alle cellule e mescolare delicatamente. Per migliorare l'infezione, centrifugare la piastra a 680 xg, 35 ° C per 30 min.
- Dopo centrifugazione, incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2.
- Manutenzione fino riprogrammazione è visibile
- Per 3 giorni, sostituire il supporto giornaliero con i media la crescita FLS contenente 0,1 mm butirrato di sodio e acido ascorbico 50 mg / ml.
- Il giorno successivo, sostituire il supporto con una miscela di mezzi di crescita FLS esupporti COPSI (rapporto 1: 1) contenente 0,1 mM di butirrato di sodio e acido ascorbico 50 mg / ml.
Nota: I componenti del supporto IPSC è dato nella lista materiali / attrezzature.
- Dividere le celle di Colony Formazione
- Preparare un 6-pozzetti vitronectina rivestite.
- Aggiungere 60 ml vitronectina a 6 ml di PBS senza Ca 2+ e Mg 2+. Mettere 2 ml di miscela in ciascun pozzetto ed incubare a RT per almeno 1 ora. Nota: La concentrazione di lavoro del vitronectina è di 5 mg / ml.
- In D5, lavare le cellule con PBS.
- Aggiungere 1 ml di PBS / 1 mM EDTA per staccare le cellule e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 min.
- Raccogliere le cellule e centrifugare a 250 xg, RT per 2 min.
- Dividere le celle a 3 diversi rapporti (1: 3, 1: 6 e 1: 9) per ottenere diversi confluencies. Aggiungere 900 ml di media per il pellet e risospendere. Aggiungere 300, 150, e 100 microlitri della miscela di cellule per pozzetto di una 6-pozzetti per ottenere un rapporto di 1: 3, 1: 6 e 1: 9, rispettivamente.
- Sostituire il supporto giornaliero con i media IPSC fino all'apparizione di colonie. Le colonie vengono visualizzati dopo circa D18. Nota: In questa fase, le colonie IPSC coesistere con il FLSS non riprogrammato.
- Preparare un 6-pozzetti vitronectina rivestite.
- Colony raccolta
- Preparare una piastra vitronectin rivestita 48 pozzetti aggiungendo 500 microlitri vitronectin ai pozzetti e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- Posizionare il microscopio su una panchina pulita, e rimuovere la piastra da 6 pozzetti dal termostato.
- Rimuovere la soluzione vitronectin dalla piastra 48 pozzetti e aggiungere 500 microlitri mezzi IPSC integrato con 10mM Rho-associata, coiled-coil contenente proteina chinasi (ROCK) inibitore.
- Utilizzando una punta 10p pipetta, tagliare intorno alla colonia. Trasferire la colonia scelto per un pozzetto della piastra a 48 pozzetti.
- Dopo la raccolta diverse colonie, incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2.
- Mantenere le cellule fino a quando le colonie sono grandi enough per il trasferimento. Nota: Noi di solito rovesciato le cellule quando la colonia esce dal campo visibile del microscopio, se visti a ingrandimento 100X.
3. immunofluorescenza colorazione
- Preparazione delle cellule
- Posizionare un vetro di copertura sterile, 18 millimetri in un 12-pozzetti.
- Aggiungere 1 ml di PBS raffreddare e risciacquare il vetro di copertura.
- Sostituire con 1 ml di una soluzione 10 mg / ml vitronectina.
- Incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- Scartare la soluzione vitronectina e iPSCs piastra in 12 pozzetti vitronectina rivestite e cultura per 7 giorni a 37 ° C, 5% di CO 2, cambiando i media giornaliera.
- La colorazione delle cellule
- Eliminare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS una volta.
- Fissare le cellule in 0,4% paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a RT.
- Permeabilize le cellule con 0,1% Triton X-100 per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere la permeabilizzazionesoluzione e blocco con PBS contenente 2% di albumina di siero bovino (BSA) per 30 minuti a RT.
- Diluire gli anticorpi in PBS contenente 2% BSA in base alla tabella 1. Incubare le cellule con gli anticorpi primari per 2 ore a temperatura ambiente.
- Aggiungere l'anticorpo secondario (diluito 1: 200) e incubare le cellule per 1 ora a RT, evitando la luce.
- Trattare le cellule con 1 ml / ml DAPI per 10 min.
- Posizionare il vetro coperchio sulla parte superiore del vetrino con antifade reagente e incubare a temperatura ambiente per 24 ore, evitando la luce.
- Verifica un'espressione con un microscopio a fluorescenza.
4. in tempo reale Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
- Estrarre mRNA dal pellet cellulare utilizzando il guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio metodo di estrazione 11.
- Amplificare cDNA da 2 mg di mRNA totale utilizzando la trascrizione inversa 11.
- Miscelare i componenti necessari per la PCR usando 2 ml di cDNA TEMpiatto 11.
- Eseguire la RT-PCR e verificare i risultati di elettroforesi su gel 11.
5. fosfatasi alcalina (AP) La colorazione
- IPSCs di coltura per 5-7 giorni a 37 ° C, 5% di CO 2 prima della colorazione.
- Aspirare media e fissare le cellule con 4% PFA per 1 min.
- Eliminare il fissativo e lavare le cellule con tampone di lavaggio 1X.
- Preparare i reagenti per AP colorazione. Mescolare i reagenti nelle seguenti proporzioni: Fast Red Violet: soluzione di fosfato naftolo AS-BI: acqua = 2: 1: 1.
- Incubare le cellule con la soluzione colorante a temperatura ambiente per 15 min, evitando la luce.
- Eliminare la soluzione colorante e lavare le cellule con tampone di risciacquo.
- Coprire le cellule con PBS per prevenire l'essiccazione e verificare espressione utilizzando un microscopio campo chiaro.
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Representative Results
In questo studio, descriviamo un protocollo per generare iPSCs da FLSS utilizzando un sistema lentivirale. La figura 1A mostra un semplice schema del protocollo di isolamento FLS. Dopo la rimozione chirurgica della membrana sinoviale, il tessuto è stato tagliato in piccoli pezzi con le forbici chirurgiche. Collagenasi inserito isolare le cellule dai ciuffi di tessuto. Le cellule sono state incubate per 14 giorni prima di ulteriori trasformazioni. Figura 1B mostra la morfologia del isolata FLSS. Le cellule sono state mantenute per 3 passaggi prima dell'uso. FLSS condividono una caratteristica simile con fibroblasti generali. Il nostro isolato FLSS espresso i marcatori di fibrosi, Vimentina e fibronectina. L'isolato RA FLSS anche mostrato bassa espressione del marcatore sinoviociti macrofago-like, CD68 (Figura 1C).
FLSS sono state raccolte e trasdotto con lentivirus contenente 4 YamaNaka fattori di riprogrammazione. Dopo aver diviso le cellule a vari rapporti (D7), piccole colonie cominciarono ad apparire. Colonie visibili, come mostrato nella Figura 2A, apparvero D8-11. Le colonie possono essere raccolti da questo punto. La Figura 2B mostra un'immagine di una colonia raccolti e amplificato.
iPSCs sono stati ampliati fino a quando il passaggio 5-10 e poi utilizzati in vari saggi. CES indifferenziate sono caratterizzati da un elevato livello di AP. Le cellule sono state colorate per AP per confermare stato indifferenziato. RA-iPSCs espresso AP (Figura 2C), indicando che sono indifferenziate. Espressione marcatore pluripotenti è stata esaminata (Figura 2D, E). L'espressione di marcatori pluripotenti, come Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28, DPPB5 e TDGF1 è stata confermata mediante RT-PCR (Figura 2D). L'espressione di Oct3 / 4, Sox2 è stato confermato anche da un immunofluorescenzanalisi con marcatori aggiuntivi come SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 e Klf4. TRA-1-60, che attualmente è pensato per essere il marcatore più importante IPSC, è altamente espressa nei nostri iPSCs generati.
Per ulteriori analisi, abbiamo eseguito cariotipo e saggio teratoma. RA-iPSCs hanno mostrato un normale modello cromosomico di 44 + XY (Figura 3A). 12 settimane post iniezione di Ra-iPSCs in topi SCID, teratomi aveva formato e visualizzati diversi tessuti, come la ghiandola, tessuto adiposo e vasi sanguigni (figura 3b). La differenziazione strato di germe è stata confermata anche per il tramite immunofluorescenza. cellule Ectoderma lignaggio sono state colorate positivamente per Otx2. cellule mesodermiche espresso brachyury, e endoderma è stata confermata da una colorazione positiva di SOX17.
Figura 1: ProtoColo per FLS isolamento da un paziente RA. (A) Un semplice diagramma del metodo utilizzato per l'isolamento sinoviociti. (B) Morfologia isolato FLSS. (C) microscopia a fluorescenza immagine di FLSS macchiato con i marcatori fibrotica vimentina, fibronectina e un marcatore sinoviociti macrofago-like, CD68. Tutte le barre scale = 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Generazione di iPSCs da FLSS isolato da un paziente RA (A) in campo chiaro immagine di una colonia iPSC prima di scegliere.. (B) L'immagine di una colonia dopo la raccolta. (C) Colony macchiato per AP. (D) PCR o analisimarcatori pluripotenti f. (E) microscopia a fluorescenza immagine di iPSCs. I iPSCs generati espressi tutti i marcatori pluripotenti. Tutte le barre scale = 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi del cariotipo e teratoma Assay (A) ad alta risoluzione G-banded immagini che mostra normali karyograms di iPSCs.. L'immagine rappresenta un normale contenuto cromosomico diploide maschio 46XY. (B) I risultati del test di teratoma e immunofluorescenza. Tutte le barre scale = 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Prima della scoperta di iPSCs, gli scienziati hanno utilizzato principalmente CES per studiare la biologia delle cellule staminali e di altre linee cellulari attraverso la differenziazione. Tuttavia, CES provengono dalla massa interna della blastocisti, che è un embrione in fase iniziale. Per isolare CES, la distruzione della blastocisti è inevitabile, sollevando questioni etiche che sono impossibili da superare. Inoltre, anche se i CES hanno caratteristiche di staminalità e pluripotenza, non possono essere ottenuti da individui e, talvolta, non sono uno strumento ideale per l'analisi personalizzata e screening della malattia.
Nel 2007, Takahashi et al. iPSCs generati da fibroblasti umani 2. Teoricamente, a differenza di CES, iPSCs possono essere generati da tutte le cellule somatiche adulte. Con questo vantaggio, iPSCs si pensa di essere lo strumento ideale per il trapianto di auto-cellula. Inoltre, con il concetto di memoria epigenetica, iPSCs sono ritenuti essere il materiale cellulare ideale per la simulazione di condizioni patogeni, cioè. Modellazione malattia. Ci sono stati molti studi condotti utilizzando vari tipi di cellule, come le cellule del sangue, le cellule di urina e altro ancora. Tuttavia, ci sono molti tipi di cellule, come FLSS, in cui non è stato condotto riprogrammazione.
malattie artritiche sono i principali disturbi del sistema immunitario che possono causare disabilità permanente. RA è causata da infiammazione cronica delle articolazioni, alla fine resultimg in danno osseo e cartilagine. E 'difficile da curare o invertire il danno soprattutto perché cartilagine non può rigenerare in vivo. Pertanto rigenerative medicina utilizzando iPSCs sono un nuovo strumento critico per la cura di RA. La perdita di massa ossea e la cartilagine è anche provocato la formazione di panno. Panno è una struttura horn-like che può essere visto nell'immagine istologico del giunto. Il panno è fatto da FLSS che proliferano senza limiti, come le cellule tumorali. Pertanto, si ritiene che il FLSS può riflettere le caratteristiche patologiche della malattia. In questo studio, abbiamo utilizzato paziente FLSs per generare iPSCs.
FLSS sono il principale tipo di cellula che contribuiscono alla patogenesi della RA. Come una cella che è più esposta all'ambiente infiammatoria all'interno dell'articolazione sinoviale, il nostro gruppo ritiene che possa essere usato come un materiale che riflette condizione di malattia del paziente. Pertanto, secondo il metodo di riprogrammazione prima, abbiamo cercato di generare iPSCs specifici RA da FLSS, con la consegna del 4 Yamanaka fattori - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 e c-Myc - da lentivirus. FLSS sono stati isolati dalla sinovia rimosso. Il taglio della membrana sinoviale è critico quando isolare FLSS. residui ossei e grasso possono rendere più complicato ottenere puro FLSS. Inoltre, l'uso di collagenasi è inevitabile per isolamento FLS. È importante utilizzare cellule tra i passaggi 3-8. Quando FLSS raggiungono passaggio 3, il fattore di Yamanaka contenente lentivirus sono generati a seguito della procedura di cui al nostro precedente lavoro 11. Utilizzando i lentivirus prodotte, Abbiamo generato con successo iPSCs RA FLS-derivati (RA-iPSCs). Pure cloni IPSC sono stati generati dal metodo colonia di raccolta. Il RA-iPSCs espresso tutti i marcatori di trascrizione pluripotenti e aveva un cariotipo normale. Inoltre, RA-iPSCs sono stati in grado di differenziarsi in tutti i tre strati germinali secondo il saggio teratoma. Inoltre, abbiamo confermato che RA-iPSCs mostrato più mineralizzazione quando differenziate in linee osteogeniche in vitro (dati non riportati) 11.
Tuttavia, vi sono alcune limitazioni a questo metodo. Lentivirus richiedono l'integrazione genomica per la riprogrammazione. Klf-4 e c-Myc sono oncogeni e questi due fattori Yamanaka possono facilitare la crescita tumorale in vivo. Pertanto, non può essere ideale per utilizzare questi fattori per generare materiali per applicazioni cliniche. Inoltre, FLSS e fibroblasti cutanei non sono difficili da ottenere in cliniche. Come accennato in vari rapporti, fibroblasti cutanei (cioè dermaL fibroblasti) possono essere ottenuti solo da biopsie. FLSS può essere isolato solo da una procedura chirurgica invasiva e questo intervento viene eseguito su pazienti con iperplasia grave che hanno subito un intervento chirurgico al ginocchio. Pertanto, non vi è alcuna necessità di utilizzare FLSS quando riprogrammazione un non-RA COPSI. Inoltre, il processo mediante il quale i fibroblasti vengono preparati per la riprogrammazione è difficile e richiede tempo. FLSS condividono le stesse carenze, come fibroblasti cutanei. Pertanto, sono necessari fonti di cellule che sono più facili da maneggiare e ottengono.
Per questo motivo, i ricercatori hanno cominciato a cercare una fonte cellulare alternativa. Un materiale attualmente utilizzato è globuli. È facile prelevare il sangue e il processo di isolamento è relativamente semplice e veloce. Inoltre, vi è uno spostamento dall'uso di lentivirus a strumenti che non richiedono genoma integrazione, come i sistemi Sendai virali, piccole molecole, e plasmidi episomiale.
Sebbene FLSS non può essere utilizzato comeun materiale per individui diversi, è ancora un ottimo materiale per la generazione RA-iPSCs per scopi di ricerca. In futuro, stiamo cercando di creare una banca iPSC RA paziente FLS-derivati. RA pazienti mostrano singolarmente diverse reazioni a farmaci che vengono utilizzati per il trattamento. Con diverse linee di RA iPSCs, speriamo di generare una cella-banca farmaco-screening per pazienti affetti da AR. Con lo screening tutti i farmaci su ciascuna linea cellulare, potremmo essere in grado di predire quale farmaco funzionerà su cui singolo paziente.
In conclusione, questo protocollo descrive l'applicazione della tecnologia COPSI alla reumatologia. Con questo protocollo, iPSCs può essere generato da RA paziente di derivazione FLSS, e le iPSCs generati hanno le caratteristiche richieste. Questi iPSCs possono essere utilizzati nella ricerca clinica, lo screening di stupefacenti, la modellazione della malattia, e la medicina rigenerativa per ulteriori indagini della biologia di RA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
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