Aqui nós descrevemos um protocolo para a geração de células-tronco humanas pluripotentes induzidas por a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos derivados de pacientes, utilizando um sistema lentiviral sem células alimentadoras.
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Artigo de método
Geração de células-tronco pluripotentes induzida por Usando sinoviócitos semelhantes a fibroblastos Isolado de articulações de pacientes com artrite reumatóide
Neste artigo
Resumo
Resumo
células somáticas adultas pode ser revertida em um estado de células estaminais pluripotentes-like usando um conjunto definido de fatores de reprogramação. Numerosos estudos têm gerado induzida por pluripotentes células estaminais (iPSCs) a partir de vários tipos de células somáticas por transdução de quatro Yamanaka fatores de transcrição: Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc. O estudo das iPSCs permanece na vanguarda da pesquisa biológica e clínica. Em particular, iPSCs específicos do paciente pode ser usado como uma ferramenta para o estudo pioneiro de patobiologia doença, uma vez que iPSCs pode ser induzida a partir do tecido de qualquer indivíduo. A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crónica, classificada pela destruição da cartilagem e do osso na estrutura da articulação. hiperplasia sinovial é uma das principais razões ou sintomas que levam a estes resultados em RA. Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLSS) são as principais células de componentes na membrana sinovial hiperplásica. FLSS na articulação limitlessly proliferam, eventualmente, invadindo o CARTIL adjacenteidade e osso. Actualmente, a sinóvia hiperplásica só pode ser removido por um procedimento cirúrgico. A sinóvia removido é utilizado para a investigação AR como um material que reflecte a condição inflamatória da articulação. Como um jogador importante na patogênese da AR, FLSS pode ser usado como um material para gerar e investigar as iPSCs de pacientes com AR. Neste estudo, foi utilizado o FLSS de um paciente com AR para gerar iPSCs. Utilizando um sistema de lentivírus, descobrimos que pode gerar FLSS RA iPSC específica para cada paciente. As iPSCs gerados a partir FLSS pode ser ainda utilizado como uma ferramenta para estudar a patofisiologia da RA no futuro.
Introdução
células-tronco pluripotentes são a plataforma de próxima geração em vários campos clínicos e biológicos. Eles são uma ferramenta promissora que podem ser utilizados nos modelos de doença, o rastreio de drogas, e a terapia médica regenerativa. Human Embryonic Stem Cells (hESCs) foram usados principalmente para estudar e compreender células pluripotentes. No entanto, isolado pela destruição do blastocisto humano, hESCs estão associados com vários problemas éticos. Em 2007, o Dr. Shinya Yamanaka e sua equipe reverteu o processo de programação celular e desenvolveu células-tronco de adultos humanos células somáticas 1,2. Portanto, ao contrário de hESCs, indu....
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Protocolo
Declaração de Ética: Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861).
1. Isolamento e sinoviito de expansão
- Isolamento sinovi�ito
- Esterilizar dois pares de tesouras cirúrgicas e um par de fórceps.
- Transferir o tecido sinovial para uma placa de 100 mm e lava-se com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de penicilina / estreptomicina.
- Cortar os resíduos de tecido de gordura e ossos amarelados. Transferir o tecido cortado para um poço de uma placa de 6 poços e adicionam-se 5 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco ....
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Resultados
Neste estudo, nós descrevemos um protocolo para gerar iPSCs de FLSS usando um sistema lentiviral. A Figura 1A mostra um esquema simples do protocolo de isolamento FLS. A seguir à remoção cirúrgica da membrana sinovial, o tecido foi cortado em pequenos pedaços utilizando uma tesoura cirúrgica. A colagenase foi adicionado para isolar as células dos aglomerados de tecido. As células foram incubadas durante 14 dias antes de processamento adicional. A Figura .......
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Discussão
Antes da descoberta da iPSCs, os cientistas usaram principalmente os CES para estudar a biologia de células-tronco e outras linhagens de células através da diferenciação. No entanto, os CES originam a partir da massa interna de um blastocisto, que é um embrião de fase inicial. Para isolar os CES, a destruição do blastocisto é inevitável, levantando questões éticas que são impossíveis de superar. Além disso, embora os CES têm características stemness e pluripotência, eles não podem ser obtidos a partir de indivíduos e às.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa financiado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças da Coreia (HI13D2188).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Prato de 100 mm | TPP | 93100 | |
| Placa de 6 poços | TPP | 92006 | |
| Tubo córnico de 50 ml | SPL | 50050 | |
| Tubo córnico de 15 ml | SPL | 50015 | |
| Pipeta descartável de 10 ml | Falcon | 7551 | |
| Pipeta descartável de 5 ml | Falcon | 7543 | |
| Placa de 12 poços | TPP | 92012 | |
| FLS Materiais de Isolamento | |||
| Tesoura | |||
| Pinça | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilina Estreptomicina | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Colagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoetanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilina Estreptomicina | Life Technologies | P4333 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | ingrediente de mídia iPSC (500 ml) |
| Bicarbonato de Sódio | Life Technologies | 25080-094 | ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 543 μ g/ml) |
| Selenito de Sódio | Sigma Aldrich | S5261 | ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 14 ng/mL) |
| Aldrich | T3705 | Transfferin Sigma Humana | (Conc.: 10.7 μ g/ml) |
| Ingrediente básico da mídia FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 20 μ g/ml) |
| TGF&beta humano; 1 | Peprotech | 100-21 | ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ácido Ascórbico | Sigma | Aldrich A8960 | ingrediente de mídia iPSC (Conc.: 64 μ g/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Butirato de Sódio | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectina | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inibidor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Materiais de Controle de Qualidade | |||
| 18 mm Vidro de Cobertura | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tecnologia & Inovação | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anticorpo anti-SSEA4 | Millipore | MAB4304 | |
| Anticorpo anti-Oct4 | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Anticorpo | Millipore | MAB4360 | |
| Anticorpo anti-Sox2 | Biolegend | 630801 | |
| Anticorpo anti-TRA-1-81 Anticorpo | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 anticorpo IgG (H+L) de cabra Ponta | prova molecular | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 anticorpo IgG (H+L) de cabra anti-coelho | Sonda molecular | A11037 | |
| A ponta de prova molecular | D1306 | ||
| de DAPI prolonga o reagente antifade do ouro | Invitrogen | P36934 | |
| Vidro da corrediça, revestido | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Clorofórmio | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Etanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid Kit de Síntese de cDNA de Fita | Inicial Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polimerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| estrela de carregamento | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) marcador de escada de DNA | Enzynomics | DM003 | |
| Fosfatase alcalina | Millipore | SCR004 |
Referências
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131....
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Reimpressões e permissões
