Summary
Aqui nós descrevemos um protocolo para a geração de células-tronco humanas pluripotentes induzidas por a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos derivados de pacientes, utilizando um sistema lentiviral sem células alimentadoras.
Abstract
células somáticas adultas pode ser revertida em um estado de células estaminais pluripotentes-like usando um conjunto definido de fatores de reprogramação. Numerosos estudos têm gerado induzida por pluripotentes células estaminais (iPSCs) a partir de vários tipos de células somáticas por transdução de quatro Yamanaka fatores de transcrição: Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc. O estudo das iPSCs permanece na vanguarda da pesquisa biológica e clínica. Em particular, iPSCs específicos do paciente pode ser usado como uma ferramenta para o estudo pioneiro de patobiologia doença, uma vez que iPSCs pode ser induzida a partir do tecido de qualquer indivíduo. A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crónica, classificada pela destruição da cartilagem e do osso na estrutura da articulação. hiperplasia sinovial é uma das principais razões ou sintomas que levam a estes resultados em RA. Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLSS) são as principais células de componentes na membrana sinovial hiperplásica. FLSS na articulação limitlessly proliferam, eventualmente, invadindo o CARTIL adjacenteidade e osso. Actualmente, a sinóvia hiperplásica só pode ser removido por um procedimento cirúrgico. A sinóvia removido é utilizado para a investigação AR como um material que reflecte a condição inflamatória da articulação. Como um jogador importante na patogênese da AR, FLSS pode ser usado como um material para gerar e investigar as iPSCs de pacientes com AR. Neste estudo, foi utilizado o FLSS de um paciente com AR para gerar iPSCs. Utilizando um sistema de lentivírus, descobrimos que pode gerar FLSS RA iPSC específica para cada paciente. As iPSCs gerados a partir FLSS pode ser ainda utilizado como uma ferramenta para estudar a patofisiologia da RA no futuro.
Introduction
células-tronco pluripotentes são a plataforma de próxima geração em vários campos clínicos e biológicos. Eles são uma ferramenta promissora que podem ser utilizados nos modelos de doença, o rastreio de drogas, e a terapia médica regenerativa. Human Embryonic Stem Cells (hESCs) foram usados principalmente para estudar e compreender células pluripotentes. No entanto, isolado pela destruição do blastocisto humano, hESCs estão associados com vários problemas éticos. Em 2007, o Dr. Shinya Yamanaka e sua equipe reverteu o processo de programação celular e desenvolveu células-tronco de adultos humanos células somáticas 1,2. Portanto, ao contrário de hESCs, induzida por pluripotentes células estaminais (iPSCs) podem ser gerados a partir de células somáticas adultas, evitando os obstáculos éticos.
Normalmente, iPSCs são gerados através da entrega de quatro genes exógenos: Oct4, Sox2, KLF4, e c-Myc. Esses fatores Yamanaka são originalmente entregues usando sistemas de lentivírus e retrovirais. Os primeiros iPSCs foram derivadas de rato c somáticaells 3. Mais tarde, a técnica foi aplicada para fibroblastos dérmicos humanos 1,2. Estudos subsequentes com êxito iPSCs gerado a partir de várias fontes, tais como urina 4, sangue 5,6, queratinócitos 7, e vários outros tipos de células. No entanto, existem algumas células somáticas que não foram utilizados na reprogramação, e rastreio das capacidades de reprogramação de vários tipos de células específicas de tecidos no estado de doença, é ainda necessária.
A artrite reumatóide (AR) é uma doença que pode atingir todas as articulações e levar a doenças auto-imunes em outros órgãos. RA afeta cerca de 1% dos adultos no mundo desenvolvido. É uma doença bastante comum e sua incidência aumenta a cada ano 8. No entanto, o RA é difícil identificar nas fases iniciais e oncebone destruição ocorre não há nenhum tratamento que pode recuperar o dano. Além disso, a eficácia do fármaco varia de paciente para paciente, e que é difícil prever a medicINE que é necessário. Por conseguinte, é necessário o desenvolvimento de um método de rastreio de drogas, e um material de célula que pode reflectir as condições da AR é necessária.
Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLSS) é um participante ativo celular na patogênese da AR 9,10. FLSS existem no revestimento sinovial da íntima entre a cápsula e a cavidade articular, a qual também é referida como a membrana sinovial. Ao apoiar a estrutura conjunta e fornecer nutrientes para a cartilagem circundante, FLSS geralmente desempenham um papel crucial na função e manutenção conjunta. No entanto, FLSS na AR têm um fenótipo invasivo. RA FLSS têm um fenótipo de câncer, como, eventualmente, destruir o osso circundante por uma proliferação infinita 10. Com esta característica única, FLSS pode ser usado como um material promissor que pode reflectir a patobiologia de RA. No entanto, estas células são raramente produzidos, e os fenótipos celulares como alterar as células passam por várias passagens in vitro
Teoricamente, RA iPSCs derivadas de pacientes (RA-iPSCs) pode se tornar uma ferramenta ideal para o rastreio de drogas e novas pesquisas. IPSCs gerados têm capacidade de auto-renovação e pode ser mantido e expandido in vitro. Com pluripotência, essas células podem ser diferenciadas em linhagens de condrócitos e osteócitos maduras, que podem contribuir material celular para a pesquisa específica na AR e outras doenças relacionadas com os ossos 11.
No presente estudo, nós demonstramos como isolar e expandir FLSS a partir de uma membrana sinovial removido cirurgicamente, e como gerar RA-iPSCs de FLSS usando lentivírus que contêm factores Yamanaka.
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Protocol
Declaração de Ética: Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861).
1. Isolamento e sinoviito de expansão
- Isolamento sinovi�ito
- Esterilizar dois pares de tesouras cirúrgicas e um par de fórceps.
- Transferir o tecido sinovial para uma placa de 100 mm e lava-se com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de penicilina / estreptomicina.
- Cortar os resíduos de tecido de gordura e ossos amarelados. Transferir o tecido cortado para um poço de uma placa de 6 poços e adicionam-se 5 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro bovino fetal a 20% (FBS).
- Pique os tecidos com a tesoura até que as peças são pequenas o suficiente para penetrar uma pipeta descartável.
- Transferir o meio contendo tecido para um tubo cónico de 50 ml. Colher o material remanescente por adição de 5 ml de DMEM com FBS a 20% para a placa de 6 poços e, em seguida, transferir para o tubo. </ Li>
- colagenase Thaw no gelo. Adicionar a colagenase a uma concentração final de 0,01% e selar o tubo com parafilme. Incubar em um banho de água a 37 ° C com agitação durante 4 h.
- Após a incubação, encher o tubo com o meio DMEM com FBS a 20%, até que o volume total é de 50 ml e centrifugar a 300 xg, à ta durante 10 min.
- Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicione 40 ml de meio para ressuspender o sedimento.
- Repita os passos 1.1.10-1.1.11.
- Ressuspender o sedimento em 25 ml de DMEM com 20% de FBS e esperar que as grandes aglomerações de tecido para desviar para o fundo.
- Transferir o sobrenadante para uma placa de 100 mm e incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 14 dias.
- Sinovi�ito Manutenção e Expansão
- Descartar os meios utilizados a partir da placa e lavar as células com 5 ml de PBS.
- Adicionar EDTA 1 ml de PBS / 1 mM e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 2 min.
- Toque o prato delicadamente e transfer as células para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugar as células a 250 xg, TA, durante 2 min.
- Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e ressuspender o sedimento em 30 ml de DMEM com 20% de FBS.
- Transferir as células a 3 x 100 mm, sem deixar qualquer material restante visível.
- Substituir a mídia com meios frescos a cada 3 d. Dividir as células a 80% de confluência utilizando EDTA 1 ml de PBS / 1 mM. Manter até 3 de passagem antes do uso. Divida cada prato de células em 3 pratos em cada divisão.
NOTA: Depois de alcançar passagem 3, as células que não estão indo para ser utilizado de imediato pode ser congelado.
2. Reprogramação FLSS Usando lentivírus que codificam fatores de Yamanaka
- Transdução (D0)
- Seed 3 x 10 4 culas por po de uma placa de 6 poços em meio de crescimento (500 ml de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina). Incubar as células O / N a 37 ° C em 5% de CO2.
- No dia seguinte, remover um frasco de lentivírus contendo 4 Yamanaka factores: Oct4, KLF4, Sox2 e c-Myc a partir do congelador e descongelamento, a 4 ° C. Nota: Lentivírus foi produzido pelo processo descrito no nosso estudo anterior 11.
- Enquanto o descongelamento do vírus, alterar os meios de comunicação para a mídia de crescimento FLS (20% FBS além de antibióticos em DMEM) contendo / ml de brometo de Hexadimetrina 10 mg e ácido ascórbico 50 mg / ml.
- Depois de alterar a mídia, adicionar 30 ul de lentivírus para as células e misture delicadamente. Para melhorar a infecção Centrifugar a placa a 680 x g, 35 ° C durante 30 min.
- Após centrifugação, as células incubar a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Manutenção Até reprogramação é visível
- Durante 3 dias, substitui os meios diariamente com meio de crescimento FLS contendo 0,1 mM de butirato de sódio e ácido ascórbico a 50 ug / ml.
- No dia seguinte, substituir a mídia com uma mistura de meios de crescimento FLS emeios iPSC (proporção 1: 1) contendo 0,1 mM de butirato de sódio e ácido ascórbico a 50 ug / ml.
Nota: Os componentes dos meios iPSC é dada na lista de materiais / equipamentos.
- As células de divisão de Formação de Colónias
- Prepara-se uma placa de 6 poços revestidas com vitronectina.
- Adicionar 60 ul de vitronectina a 6 ml de PBS, sem Ca 2+ e Mg 2+. Coloque 2 ml de cada mistura em poços e incuba-se temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. Nota: A concentração de trabalho de vitronectina é de 5 ug / mL.
- No D5, lavar as células com PBS.
- Adicionar 1 ml de PBS / 1 mM EDTA para separar as células e incuba-se a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 min.
- Colheita das células e centrifugar a 250 xg, TA, durante 2 min.
- Dividir as células em 3 diferentes proporções (1: 3, 1: 6 e 1: 9) para se conseguir diferentes confluencies. Adicionar 900 ul de meios de comunicação para a pelete de células e ressuspender. Adicionar 300, 150, e 100 uL da mistura de células por poço de uma 6-bem placa para conseguir uma proporção de 1: 3, 1: 6, e 1: 9, respectivamente.
- Substitua os meios de comunicação diária com a mídia IPSC até colónias aparecer. Colónias aparece após cerca de D18. Nota: Nesta fase, as colónias IPSC co-existir com o FLSS não reprogramada.
- Prepara-se uma placa de 6 poços revestidas com vitronectina.
- picking Colony
- Prepara-se uma placa revestida com vitronectina de 48 poços por adição de 500 ul de vitronectina aos poços, e incuba-se à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
- Coloque o microscópio sobre uma bancada limpa, e remover a placa de 6 poços da incubadora.
- Remover a solução de vitronectina a partir da placa de 48 poços e adicionar 500 ul IPSC meios suplementados com 10 mM de Rho-associado, em espiral enrolada contendo proteína cinase (ROCHA) inibidor.
- Usando uma ponta 10p pipeta, corte em torno da colônia. Transferir a colónia escolhido para um poço da placa de 48 poços.
- Depois de escolher várias colónias, incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Manter as células até que as colónias são grandes enough para transferência. Nota: Normalmente as células derramado quando a colónia fica fora do campo visível do microscópio, quando visto uma ampliação de 100X.
3. Imunofluorescência Coloração
- Preparação de Células
- Colocar uma tampa de vidro 18 milímetros estéril para uma placa de 12 poços.
- Adicionar 1 ml de PBS para esfriar e lave a tampa de vidro.
- Substituir com 1 ml de uma solução / 10 ug mL de vitronectina.
- Incubar a placa a temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
- Descartar a solução vitronectina e iPSCs placa na placa de 12 poços revestida com vitronectina e cultura durante 7 dias a 37 ° C, 5% de CO 2, mudando os meios diariamente.
- A coloração celular
- Descartar o meio de cultura e lava-se as células uma vez com PBS.
- Fixar as células em 0,4% de paraformaldeído (PFA) durante 30 min à TA.
- Permeabilizar as células com 0,1% de Triton X-100 durante 5 min à TA.
- Remover a permeabilizaçãosolução e bloco com PBS contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA) durante 30 min à temperatura ambiente.
- Dilui-se a anticorpos em PBS contendo BSA a 2% de acordo com a Tabela 1. Incubam-se as células com os anticorpos primários durante 2 h à RT.
- Adicionar o anticorpo secundário (diluído 1: 200) e incuba-se as células durante 1 h à temperatura ambiente, evitando a luz.
- Tratar as células com 1 ul / ml de DAPI durante 10 min.
- Colocar a tampa de vidro na parte superior da lâmina de vidro com antifade reagente e incubar à TA durante 24 horas, evitando a luz.
- Verificar a expressão com um microscópio de fluorescência.
4. em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)
- Extrair ARNm a partir do sedimento celular utilizando o tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio método de extracção 11.
- Amplificar o ADNc a partir de 2 ug de ARNm total usando transcrição reversa 11.
- Misturar os componentes necessários para a PCR utilizando 2 ul de ADNc de METplaca 11.
- Execute RT-PCR e verificar os resultados por eletroforese em gel de 11.
5. fosfatase alcalina (AP) Coloração
- IPSCs cultura durante 5-7 dias a 37 ° C, 5% de CO 2 antes da coloração.
- Aspirar os meios de comunicação e corrigir as células com PFA 4% durante 1 min.
- Descartar o fixador e lavar as células com tampão de lavagem 1X.
- Prepare os reagentes para coloração com AP. Misturar os reagentes nas seguintes proporções Fast Red Violet: solução de fosfato de Naftol AS-BI: água = 2: 1: 1.
- Incubam-se as células com a solução de coloração à TA durante 15 min, evitando a luz.
- Descartar a solução de coloração e lavar as células com tampão de lavagem.
- Cobrir as células com PBS para evitar a secagem e verificar a expressão utilizando um microscópio de campo brilhante.
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Representative Results
Neste estudo, nós descrevemos um protocolo para gerar iPSCs de FLSS usando um sistema lentiviral. A Figura 1A mostra um esquema simples do protocolo de isolamento FLS. A seguir à remoção cirúrgica da membrana sinovial, o tecido foi cortado em pequenos pedaços utilizando uma tesoura cirúrgica. A colagenase foi adicionado para isolar as células dos aglomerados de tecido. As células foram incubadas durante 14 dias antes de processamento adicional. A Figura 1B mostra a morfologia do FLSS isolado. As células foram mantidas durante 3 passagens antes da sua utilização. FLSS partilham uma característica semelhante com fibroblastos gerais. Nossa isolado FLSS expressaram os marcadores fibróticos, vimentina e fibronectina. O isolado RA FLSS também apresentou baixa expressão do marcador sinoviito semelhantes a macrófagos, CD68 (Figura 1C).
FLSS foram colhidas e transduzidas com lentivírus contendo 4 YamaNaka fatores de reprogramação. Após dividir as células em várias proporções (D7), pequenas colônias começaram a aparecer. Colónias visíveis, como mostrado na Figura 2A, apareceu no D8-11. As colónias podem ser colhidas a partir deste ponto. A Figura 2B mostra uma imagem de uma colónia colhidos e amplificado.
iPSCs foram expandidas até 10/05 passagem e, em seguida, usado em vários ensaios. CES indiferenciadas são caracterizadas por um elevado nível de AP. As células foram coradas para AP para confirmar o estado indiferenciado. RA-iPSCs expressa AP (Figura 2C), o que indica que eles são indiferenciadas. Expressão do marcador pluripotentes foi examinada (Figura 2D, E). A expressão dos marcadores pluripotentes, tais como OCT3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28, DPPB5 e TDGF1 foi confirmada por RT-PCR (Figura 2D). A expressão de OCT3 / 4, Sox2 também foi confirmada por imunofluorescência umnálise com marcadores adicionais, tais como SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 e KLF4. TRA-1-60, que atualmente é pensado para ser o marcador mais importante iPSC, foi altamente expresso nas nossas iPSCs gerados.
Para uma análise mais aprofundada, foi realizado cariótipo e ensaio de teratoma. Ra-iPSCs mostrou um padrão cromossómico normal 44 + XY (Figura 3A). 12 semanas pós-injecção de Ra-iPSCs em ratinhos SCID, teratomas tinha formado e apresentado diversos tecidos, tais como glândula, tecido adiposo e vasos sanguíneos (Figura 3B). A diferenciação camada germinativa foi também confirmada através de imunofluorescência. células ectoderma linhagem foram positivamente coradas para OTX2. células mesodérmicas expressa Brachyury, e endoderme foi confirmada por coloração positiva de Sox17.
Figura 1: Protocol para FLS Isolamento a partir de um paciente com AR. (A) Um diagrama simples do método utilizado para o isolamento sinoviito. (B) Morfologia do isolado FLSS. (C) microscopia de fluorescência de imagem de FLSS coradas com fibrótica vimentina marcadores, fibronectina e um marcador sinovi�ito macrófago-like, CD68. Todas as barras de escala = 200 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Geração de iPSCs de FLSS isolado de um paciente RA imagem (A)-campo brilhante de uma colónia iPSC antes de escolher.. (B) Imagem de uma colônia após a colheita. (C) Colony coradas para AP. Análise (D) O PCRmarcadores pluripotentes f. (E) microscopia de fluorescência de imagem de iPSCs. As iPSCs geradas expressa todos os marcadores pluripotentes. Todas as barras de escala = 200 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise do cariótipo e Teratoma Assay (A) de alta resolução G-unido imagens mostrando cariogramas normais de iPSCs.. A imagem representa um conteúdo cromossômico 46XY normais macho diplóide. (B) os resultados dos ensaios de teratoma e imunofluorescência. Todas as barras de escala = 200 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Antes da descoberta da iPSCs, os cientistas usaram principalmente os CES para estudar a biologia de células-tronco e outras linhagens de células através da diferenciação. No entanto, os CES originam a partir da massa interna de um blastocisto, que é um embrião de fase inicial. Para isolar os CES, a destruição do blastocisto é inevitável, levantando questões éticas que são impossíveis de superar. Além disso, embora os CES têm características stemness e pluripotência, eles não podem ser obtidos a partir de indivíduos e às vezes não são uma ferramenta ideal para a análise personalizada e rastreio da doença.
Em 2007, Takahashi et al. iPSCs gerados a partir de fibroblastos humanos 2. Teoricamente, ao contrário do CES, iPSCs podem ser gerados a partir de quaisquer células somáticas adultas. Com essa vantagem, iPSCs são pensados para ser a ferramenta ideal para o transplante de células automático. Além disso, com o conceito de memória epigenética, iPSCs são pensados ser o material celular ideal para a simulação de condições patogénicas, isto é,. Modelagem doença. Tem havido muitos estudos feitos usando vários tipos de células, tais como células de sangue, células de urina e mais. No entanto, existem muitos tipos de células, tais como FLSS, em que não tenha sido conduzidos reprogramação.
doenças artríticas são as principais doenças imunológicas que podem causar incapacidade permanente. RA é causada pela inflamação crônica nas articulações, eventualmente, resultimg em danos osso e cartilagem. É difícil de curar ou reverter o dano de cartilagem especialmente porque não pode regenerar in vivo. Portanto regenerativos medicina usando iPSCs são uma nova ferramenta fundamental para a cura de RA. A perda de osso e cartilagem é também resultou na formação de panos. Pannus é uma estrutura de corneta do tipo que pode ser visto na imagem histológica da articulação. O pannus é feita por FLSS que proliferam ilimitadamente como células cancerosas. Portanto, pensa-se que o FLSS pode reflectir as características patológicas da doença. Neste estudo, foram utilizados paciente FLSs para gerar iPSCs.
FLSS são o principal tipo de célula que contribuem para a patogênese da AR. Como uma célula que está mais exposta ao ambiente inflamatório no interior da articulação sinovial, o nosso grupo pensou que ele pode ser usado como um material que reflecte a condição da doença do paciente. Portanto, utilizando-se o método mais antigo reprogramação, tentou-se gerar iPSCs específico de AR-FLSS, usando a entrega dos 4 Yamanaka Factores - OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-Myc - por lentivírus. FLSS foram isolados a partir da sinóvia removido. O recorte da sinóvia era crítico ao isolar FLSS. resíduos de osso e gordura pode torná-lo mais complicado para obter pura FLSS. Além disso, a utilização de colagenase é inevitável para o isolamento FLS. É importante a utilização de células entre as passagens 3-8. Quando FLSS chegar passagem 3, o fator Yamanaka contendo lentivírus são gerados seguindo o procedimento mencionado no nosso trabalho anterior 11. Usando os lentivírus produzidos, Nós com sucesso gerado iPSCs RA FLS-derivados (RA-iPSCs). clones de IPSC puras foram gerados através do método de separação de colónias. A RA-iPSCs expressa todos os marcadores de transcrição pluripotentes e teve um cariótipo normal. Além disso, os ra-iPSCs foram capazes de se diferenciar em todas as três camadas germinais de acordo com o ensaio de teratoma. Além disso, têm confirmado que os RA-iPSCs mostrou mais mineralização quando diferenciadas em linhagens osteogénicas in vitro (dados não mostrados) 11.
No entanto, existem algumas limitações para este método. Lentivírus exigem a integração genômica para a reprogramação. KLF-4 e C-Myc são oncogenes e estes dois factores Yamanaka pode facilitar o crescimento do tumor in vivo. Por isso, pode não ser ideal para utilizar estes factores para gerar materiais para aplicações clínicas. Além disso, FLSS e fibroblastos da pele não são difíceis de obter em clínicas. Como mencionado em vários relatórios, fibroblastos da pele (ou seja, dermal fibroblastos) só pode ser obtida por biópsias. FLSS pode ser isolada por um procedimento cirúrgico invasivo e esta operação é realizada em pacientes com hiperplasia severa que tenham sido submetidos a cirurgia do joelho. Portanto, não há nenhuma necessidade de usar um FLSS ao reprogramar RA não-CPSP. Além disso, o processo pelo qual são preparados os fibroblastos para a reprogramação é difícil e demorada. FLSS compartilham as mesmas deficiências como fibroblastos da pele. Portanto, as fontes de células que são mais fáceis de manusear e obtêm são necessários.
Por esta razão, os pesquisadores começaram a procurar uma fonte alternativa célula. Um material actualmente utilizado é glóbulos. É fácil de extrair o sangue e o processo de isolamento é relativamente simples e rápido. Além disso, há uma mudança a partir da utilização de ferramentas de lentivírus que não requerem genoma-integração, tais como sistemas de Sendai virais, as moléculas pequenas, e plasmídeos epissómicos.
Embora FLSS não pode ser usado comoum material para diversos indivíduos, ainda é um ótimo material ao gerar RA-iPSCs para fins de pesquisa. No futuro, nós estamos olhando para gerar um banco iPSC RA paciente FLS-derivado. pacientes com AR mostram individualmente diversas reacções para drogas que são utilizadas para o tratamento. Com várias linhas de RA iPSCs, nós estamos esperando para gerar uma célula-bank-triagem de drogas para pacientes com AR. Por triagem de todas as drogas em cada linha celular, que pode ser capaz de predizer qual medicamento vai funcionar no qual paciente individual.
Em conclusão, este protocolo descreve a aplicação da tecnologia iPSC a reumatologia. Com este protocolo, iPSCs podem ser gerados a partir de FLSS RA paciente derivado, e as iPSCs gerados têm as características necessárias. Estes iPSCs pode ser usado em pesquisas clínicas, a seleção da droga, modelagem de doenças e medicina regenerativa para futuras investigações sobre a biologia de RA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
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