Summary
Здесь мы опишем протокол для генерации человека наведенного плюрипотентных стволовых клеток из пациента, полученных фибробластоподобных синовиоциты, с использованием лентивирусов системы без фидерных клеток.
Abstract
Зрелые соматические клетки могут быть отменены в плюрипотентные стволовые клетки, как состояние, используя определенный набор факторов перепрограммирования. Многочисленные исследования породили наведенного плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из различных типов соматических клеток с помощью трансдукции четыре Яманака факторы транскрипции: Oct4, Sox2, Klf4 и с-Myc. Изучение ИПСК остается на переднем крае биологической и клинических исследований. В частности, иПСК конкретного пациента могут быть использованы в качестве новаторского инструмента для изучения патобиологии заболевания, так как иПСК может быть вызван из ткани любого индивидуума. Ревматоидный артрит (РА) является хроническим воспалительным заболеванием, классифицируемых разрушением хряща и структуры кости в суставе. Синовиальной гиперплазии является одной из основных причин, или симптомы, которые приводят к этим результатам в РА. Фибробластоподобных синовиоциты (ФЛС) являются основным компонентом клетки в гиперплазированном синовии. ФЛС в суставе беспредельно размножаться, в конечном счете, вторжение в соседний cartilвозраст и кости. В настоящее время гиперпластический синовиальной можно удалить только с помощью хирургической процедуры. Удаленный синовиальной используется для исследований RA в качестве материала, который отражает воспалительное состояние сустава. В качестве основного игрока в патогенезе ревматоидного артрита, ФЛС может быть использован в качестве материала для создания и исследовать ИПСК пациентов с РА. В данном исследовании мы использовали FLSS пациента RA для создания иПСК. Использование лентивирусов системы, мы обнаружили, что ФЛС может генерировать RA конкретного пациента IPSC. В иПСК, полученные от ФЛС можно дополнительно использовать в качестве инструмента для изучения патофизиологии РА в будущем.
Introduction
Плюрипотентные стволовые клетки платформа следующего поколения в различных клинических и биологических полей. Они являются многообещающим инструментом, который может быть использован при моделировании заболеваний, скрининга лекарственных средств и регенеративной медицинской терапии. Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) в основном были использованы для изучения и понимания плюрипотентных клеток. Тем не менее, изолированных разрушением человеческой бластоцисты, ЭСК связаны с несколькими этическими проблемами. В 2007 году доктор Яманака и его команда вспять процесс программирования клеток и разработал стволовые клетки из человеческой взрослых соматических клеток 1,2. Таким образом, в отличие от ЭСК, наведенного плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть получены из зрелых соматических клеток, избегая этических препятствий.
Как правило, иПСК генерируются поставку четырех экзогенных генов: Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Эти факторы Яманака первоначально доставлены с использованием лентивирусов и ретровирусных систем. Первые иПСК были получены из мышиного соматической Cгезов 3. Впоследствии, методика была применена к фибробластах дермы человека 1,2. Последующие исследования успешно создали иПСК из различных источников, таких как моча, кровь 4 5,6, кератиноциты 7, и несколько других типов клеток. Тем не менее, есть некоторые соматические клетки, которые не были использованы в перепрограммировании, а также скрининг возможностей перепрограммирования клеток разных типов от конкретных тканей в состоянии болезни, по-прежнему требуется.
Ревматоидный артрит (РА) является заболеванием, которое может поражать все суставы и привести к аутоиммунных состояний в других органах. РА поражает около 1% взрослых в развитых странах мира. Это довольно распространенное заболевание , и его частота возрастает с каждым годом 8. Тем не менее, RA трудно определить на ранних стадиях и oncebone разрушения происходит не существует лечения, которое может восстановить ущерб. Кроме того, эффективность лекарственного средства отличается от пациента к пациенту, и трудно предсказать, медикине, что требуется. Таким образом, разработка метода скрининга наркотиков необходим, и необходим материал клеток, которые могут отражать условия РА.
Фибробластоподобных синовиоцитов (FLSS) являются активным участником клеточное в патогенезе ревматоидного артрита 9,10. ФЛС существуют в синовиальной интимы прокладки между суставной капсулы и полости, которая также упоминается как синовии. Поддерживая совместную структуру и обеспечивая питательные вещества для окружающей хряща, ФЛС обычно играют решающую роль в совместной функции и техническом обслуживании. Тем не менее, ФЛС в РА имеют инвазивный фенотип. РА ФЛС есть рак , как фенотип, в конечном счете разрушает окружающую кость бесконечной пролиферации 10. С помощью этой уникальной характеристикой, ФЛС может быть использован в качестве перспективного материала, который может отражать патобиологии RA. Тем не менее, эти клетки редко производятся, так и клеточные фенотипы изменяют , так как клетки проходят через несколько проходов в ин витро
Теоретически, RA пациента, полученных иПСК (RA-иПСК) может стать идеальным инструментом для скрининга лекарственных средств и проведения дальнейших исследований. Сформированные иПСК обладают способностью самообновления и может быть сохранена и расширена в пробирке. С плюрипотентности, эти клетки могут быть дифференцированы в зрелые хондроцитов и остеоцитов родах, которые могут способствовать клеточного материала для конкретных исследований в РА и других заболеваний , связанных с костями 11.
В данном исследовании мы покажем, как изолировать и расширить FLSS от удаленного хирургическим путем синовии, и как генерировать RA-ИПСК из ФЛС с использованием лентивирусов, содержащих Яманака факторы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Этот протокол исследования был одобрен этическими комитетами католического университета Кореи (KC12TISI0861).
1. синовиоцитов Выделение и расширения
- синовиоцитов Изоляция
- Стерилизация две пары хирургических ножниц и одну пару щипцов.
- Передача синовиальной ткани на 100 мм чашку и промывают 5 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), содержащем 1% пенициллина / стрептомицина.
- Отрезанные желтоватые жировую ткань и кости остатки. Передача обрезанную ткани на лунку 6-луночного планшета и добавляют 5 мл среды Игла в модификации Игла (DMEM) с 20% фетальной телячьей сыворотки (FBS).
- Нарезать ткани с ножницами, пока кусочки не достаточно малы, чтобы проникать Пипеткой.
- Передача ткани, содержащей носитель в коническую пробирку на 50 мл. Урожай оставшийся материал путем добавления 5 мл DMEM с 20% FBS в 6-луночный планшет, а затем перенести в пробирку. </ Li>
- Оттепель коллагеназы на льду. Добавить коллагеназы до конечной концентрации 0,01% и запечатать трубу с парафином. Инкубируют на водяной бане при 37 ° C при встряхивании в течение 4 часов.
- После инкубации, заполнить трубку с DMEM с 20% FBS, пока общий объем не 50 мл и центрифуге при 300 мкг, RT в течение 10 мин.
- Удалить супернатант, не нарушая гранул и добавляют 40 мл среды для ресуспендирования гранул.
- Повторите шаги 1.1.10-1.1.11.
- Ресуспендируют осадок в 25 мл DMEM с 20% FBS и ждать больших комков ткани опускаются на дно.
- Перенести супернатант в 100 мм чашку и инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 14 дней.
- Синовиоцитов обслуживание и расширение
- Выбросьте использованные носители из пластины и промыть клетки с 5 мл PBS.
- Добавить 1 мл ФБР / 1 мМ ЭДТА и инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 2 мин.
- Нажмите на блюдо мягко и transfeR клетки в коническую пробирку на 15 мл. Центрифуга клетки при 250 мкг, RT в течение 2 мин.
- Удалить супернатант, не нарушая гранул и ресуспендируют осадок в 30 мл DMEM с 20% FBS.
- Передача клетки до 3 х 100 мм чашках, не оставляя видимых остатки материала.
- Заменить носитель свежей средой каждые 3 d. Разделение клеток при 80% сплошности с использованием 1 мл ФБР / 1 мМ ЭДТА. Поддерживать до прохождения 3 перед использованием. Разделите каждое блюдо из клеток в 3-х блюд в каждом расколе.
Примечание: После достижения прохода 3, клетки, которые не будут использоваться сразу же могут быть заморожены.
2. Перепрограммирование ФЛС Использование Лентивирусов-кодирующих факторы Яманака
- Трансдукция (Д0)
- Семенной 3 × 10 4 клеток на лунку 6-луночного планшета в ростовой среде (500 мл DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина , дополненной). Инкубируйте клетки O / N при температуре 37 ° С в 5% CO2.
- На следующий день, удалите один флакон, содержащий 4 лентивирусов Яманака факторов: Oct4, Klf4, Sox2 и с-Мус из морозильной камеры и оттепель при 4 ° С. Примечание: Лентивирус был получен в соответствии с процедурой , описанной в предыдущем исследовании 11.
- В то время как оттаивает вирус, изменения носителя питательной среды FLS (20% FBS плюс антибиотики в DMEM), содержащей 10 мкг / мл полибрен и 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
- После смены носителя, добавляют 30 мкл лентивирусов к клеткам и аккуратно перемешать. Для улучшения инфекции, центрифугировать планшет при 680 х г, 35 ° С в течение 30 мин.
- После центрифугирования, инкубировать клетки при 37 ° С в 5% CO 2.
- Техническое обслуживание До перепрограммирование Видимый
- В течение 3 суток, замените носитель ежедневно с FLS ростовой средой, содержащей 0,1 мМ бутират натрия и 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
- На следующий день, замените носитель со смесью сред роста FLS иIpsc медиа (соотношение 1: 1), содержащего 0,1 мМ бутират натрия и 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
Примечание: Компоненты СМИ иПСК приведен в списке материалов / оборудования.
- Деление клеток для формирования колонии
- Приготовьте витронектиновый покрытием 6-луночный планшет.
- Добавить 60 мкл витронектина до 6 мл PBS без Са 2+ и Mg 2+. Поместите 2 мл смеси в каждый лунки и инкубируют в КТ в течение по меньшей мере 1 ч. Примечание: Рабочая концентрация витронектина составляет 5 мкг / мл.
- На d5, мыть клетки с PBS.
- Добавить 1 мл PBS / 1 мМ ЭДТА , чтобы открепления клеток и инкубируют при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 2 мин.
- Урожай клетки и центрифуги при 250 мкг, RT в течение 2 мин.
- Разделение клеток при 3-х различных соотношениях (1: 3, 1: 6 и 1: 9) для достижения различных confluencies. Добавьте 900 мкл среды к осадку клеток и ресуспендируют. Добавьте 300, 150, и 100 мкл клеточной смеси на лунку 6-луночный планшет для достижения соотношении 1: 3, 1: 6 и 1: 9, соответственно.
- Замените носитель ежедневно с IPSC СМИ, пока не появятся колонии. Колонии появится примерно через D18. Примечание: На данном этапе IPSC колонии сосуществовать с не-перепрограммировать ФЛС.
- Приготовьте витронектиновый покрытием 6-луночный планшет.
- Сбор колонии
- Подготовка 48-луночный планшет с витронектином покрытием путем добавления 500 мкл витронектина в лунки, и инкубируют при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
- Поместите микроскоп на чистом столе, и снять 6-луночного планшета из инкубатора.
- Удалить решение витронектиновый из 48-луночного планшета и добавить 500 мкл среды IPSC, дополненной 10 мМ Rho-ассоциированной, суперспирализованный содержащий протеинкиназы (ROCK) ингибитор.
- Используя наконечник пипетки 10p, обвести колонии. Перенести принимаемое колонии в одну лунку 48-луночного планшета.
- После того, как собирание несколько колоний, инкубировать клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2.
- Поддерживать клетки до тех пор, пока колонии большие ENOтьфу для передачи. Примечание: Обычно мы пролили клетки, когда колония выходит из видимой области микроскопа, если смотреть на 100х.
3. Иммунофлуоресценции Окрашивание
- Cell Подготовка
- Поместите стерильную 18 мм защитное стекло в 12-луночного планшета.
- Добавьте 1 мл PBS, чтобы охладить и полоскать покровного стекла.
- Заменить на 1 мл мл витронектина раствора 10 мкг /.
- Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
- Отменить решение витронектиновый и ИПСК пластины в витронектина покрытием пластины 12-луночного и культуры в течение 7 дней при температуре 37 ° С, 5% СО 2, изменение средств массовой информации ежедневно.
- Cell Окрашивание
- Выбросьте культуральной среды и промыть клетки с PBS один раз.
- Зафиксировать клетки в 0,4% параформальдегида (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Клетки проницаемыми с 0,1% тритона Х-100 в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалите пермеабилизациираствора и блок с ФБС, содержащим 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Развести антитела в PBS , содержащем 2% BSA в соответствии с таблицей 1. Инкубируйте клетки с первичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Добавить вторичные антитела (разбавленный 1: 200) и инкубировать клетки в течение 1 часа при комнатной температуре, избегая света.
- Treat клеток с 1 мкл / мл DAPI в течение 10 мин.
- Поместите покровное стекло поверх предметное стекло с реагентом antifade и инкубируют при комнатной температуре в течение 24 ч, избегая света.
- Проверьте выражение с помощью флуоресцентного микроскопа.
4. В режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)
- Экстракт мРНК из клеточного осадка с помощью гуанидина тиоцианата-фенол-хлороформ методом экстракции 11.
- Amplify кДНК из 2 мкг тотальной мРНК с использованием обратной транскрипции 11.
- Смешайте компоненты, необходимые для проведения ПЦР с использованием 2 мкл кДНК ТЭМПластина 11.
- Выполните RT-PCR и проверить результаты помощью гель - электрофореза 11.
5. щелочной фосфатазы (AP) Окрашивание
- Культура иПСК в течение 5-7 дней при 37 ° С, 5% СО 2 до окрашивания.
- Аспирируйте средства массовой информации и зафиксировать клетки с 4% PFA в течение 1 мин.
- Выбросьте закрепитель и промойте клетки с буфером для ополаскивания 1X.
- Подготовка реагентов для окрашивания AP. Перемешайте реагенты в следующем соотношении: Fast Red Violet: нафтол AS-BI фосфатный раствор: вода = 2: 1: 1.
- Инкубируйте клетки с красящим раствором при комнатной температуре в течение 15 мин, избегая света.
- Выбросьте окрашивание раствора и промыть клетки с буфером для ополаскивания.
- Накройте клетки с PBS, чтобы предотвратить высыхание и проверять выражение с использованием светлого поля микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В данном исследовании мы опишем протокол для генерации иПСК из ФЛС с использованием лентивирусов системы. На рисунке 1А показана простая схема протокола изоляции FLS. После хирургического удаления синовиальной оболочки, ткань разрезали на маленькие кусочки с помощью хирургических ножниц. Коллагеназы был добавлен, чтобы изолировать клетки от комков ткани. Клетки инкубировали в течение 14 дней перед дальнейшей обработкой. На фиг.1В показана морфология изолированной ФЛС. Клетки выдерживали в течение 3-х пассажей перед использованием. ФЛС разделяют подобную характеристику с общим фибробластами. Наша изолированные ФЛС выражали фиброзные маркеры, Виментин и фибронектина. Выделенную RA ФЛС также показали низкую экспрессию макрофагами как синовиоцитов маркер, CD68 (Рисунок 1С).
ФЛС собирали и трансдуцированных с лентивирусов, содержащей 4 ЯмаНака факторы для перепрограммирования. После разделения клеток при различных соотношениях (D7), небольшие колонии начали появляться. Видимые колонии, как показано на рисунке 2А, появился на D8-11. Колонии могут быть выбраны с этой точки. Фигура 2В показывает изображение укомплектовываются и усиливаемого колонии.
иПСК были расширены до прохода 5-10, а затем использовали в различных анализах. Undifferentiated стволовые клетки характеризуются высоким уровнем AP. Клетки окрашивали для AP для подтверждения недифференцированного состояния. RA-иПСК выражается AP (рис 2C), что указывает на их недифференцированные. Плюрипотентных экспрессии маркеров исследовали (рис 2D, Е). Выражение маркеров плюрипотентных , таких как Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28, DPPB5 и TDGF1 была подтверждена с использованием RT-PCR (рис 2D). Выражение Oct3 / 4, Sox2 было также подтверждено иммунофлюоресценции анализ с дополнительными маркерами, такими как SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 и Klf4. TRA-1-60, который в настоящее время считается самым важным IPSC маркером, высоко выражена в наших генерируемых ИПСК.
Для дальнейшего анализа, мы провели кариотипирование и тератомы анализа. RA-иПСК показал нормальную структуру хромосомной 44 + XY (рис 3А). 12 недель после инъекции-РА-ИПСК в SCID мышей, тератомы были сформированы и отображены различные ткани, такие как железы, жировой ткани и кровеносных сосудов (рис 3б). Дифференциация зародышевые листки также была подтверждена с помощью иммунофлуоресценции окрашивания. Эктодерма линии преемственности клетки положительно окрашивали на Otx2. Мезодермальных клеток выражали Brachyury и энтодермы было подтверждено положительным окрашиванием SOX17.
Рисунок 1: Protocола для FLS изоляции от пациента РА. (А) Простая схема метода , используемого для изоляции синовиоцитов. (Б) Морфология изолированных ФЛС. (C) люминесцентной микроскопии изображение ФЛС окрашенных фиброзных маркеров виментину, фибронектин и макрофагами как синовиоцитов маркер, CD68. Все Масштабные полоски = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Генерация ИПСК из ФЛС , выделенных из пациента РА (А) Яркое поле образ колонии иПСК , прежде чем выбрать.. (B) Изображение колонии после сбора. (C) колонии окрашивали на AP. (D) ПЦР анализ OF плюрипотентные маркеры. (Е) люминесцентной микроскопии изображение ИПСК. Сформированные иПСК выражены все плюрипотентные маркеры. Все Масштабные полоски = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Анализ кариотипов и тератомы анализ (A) с высоким разрешением G-Banded изображения , показывающие обычные karyograms из ИПСК.. Изображение представляет собой нормальное содержание хромосомной диплоидный мужской 46XY. (B) Результаты анализов тератомы и иммунофлуоресцентного окрашивания. Все Масштабные полоски = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
До открытия ИПСК, ученые в основном использовали эмбриональные для изучения биологии стволовых клеток и других клеточных клонов путем дифференциации. Тем не менее, стволовые клетки происходят из внутренней массы бластоцисты, которая является ранней стадии эмбриона. Для выделения ЭСК, разрушение бластоцисты является неизбежным, повышение этических вопросов, которые невозможно преодолеть. Кроме того, хотя ЭСК имеют стволовости характеристики и плюрипотентности, они не могут быть получены от физических лиц и иногда не является идеальным инструментом для персонализированного анализа и скрининга заболеваний.
В 2007 году , Такахаши и др. генерируемые иПСК из человеческих фибробластов 2. Теоретически, в отличие от ЭСК, иПСК могут быть получены из любых взрослых соматических клеток. С этим преимуществом, иПСК, как полагают, является идеальным инструментом для трансплантации авто-клеток. Кроме того , с концепцией эпигенетической памяти, иПСК , как полагают, является идеальным материалом клеток для моделирования патогенных условий, т.е.. Моделирование болезни. Там было много исследований, проведенных с использованием различных типов клеток, таких как клетки крови, клетки мочи и многое другое. Тем не менее, существует много типов клеток, таких как ФЛС, в котором не было проведено перепрограммирование.
Артритов являются основными иммунные нарушения, которые могут привести к постоянной инвалидности. RA вызвана хроническим воспалением в суставах, в конце концов resultimg в кости и повреждение хряща. Трудно вылечить или обратить вспять ущерб , особенно потому , что хрящ не может восстанавливаться в естественных условиях. Поэтому регенеративной медицины с использованием иПСК являются новым важным инструментом для лечения РА. Потеря кости и хрящи также приводит к образованию паннусной. Паннус является хорновских структуру, которую можно увидеть в гистологической изображение сустава. Паннус производится ФЛС, которые пролиферируют беспредельно как раковые клетки. Таким образом, считается, что ФЛС может отражать патологические особенности течения заболевания. В данном исследовании мы использовали FL пациентаSs для создания иПСК.
ФЛС являются основным типом клеток, которые вносят вклад в патогенезе ревматоидного артрита. В качестве клетки, которая в основном подвергается воспалительной среде внутри синовиальной сустава, наша группа считала, что она может быть использована в качестве материала, который отражает состояние заболевания пациента. Поэтому, используя самый ранний метод перепрограммирования, мы попытались произвести RA специфические ИПСК из ФЛС, используя доставку 4 Яманака факторы - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и с-Мус - от лентивирусов. ФЛС были выделены из удаленного синовии. Обрезка синовии имеет решающее значение при выделении FLSS. Костные и жировые остатки могут сделать его более сложным для получения чистого FLSS. Кроме того, использование коллагеназы неизбежно для изоляции FLS. Важно, чтобы использовать ячейки между проходами 3-8. Когда ФЛС достигают проход 3, коэффициент Яманака , содержащий лентивирусов генерируются в соответствии с процедурой , указанной в нашей более ранней работе 11. Используя полученные лентивирусовМы успешно создали RA-FLS, полученные иПСК (RA-иПСК). Чистые клоны IPSC были получены методом подхвата колонии. RA-иПСК выражали все маркеры плюрипотентных транскрипции и имели нормальный кариотип. Кроме того, RA-иПСК были способны дифференцироваться во все три зародышевых листка в соответствии с анализом тератомы. Кроме того , мы подтвердили , что RA-иПСК показали более минерализацию , когда дифференцируются в остеогенных родословных в пробирке (данные не показаны) 11.
Тем не менее, существуют некоторые ограничения на этот метод. Лентивирусов требуют геномную интеграции для перепрограммирования. KLF-4 и с-Мус являются онкогены и эти два Яманака факторы могут способствовать росту опухоли в естественных условиях. Таким образом, он не может быть идеальным, чтобы использовать эти факторы для создания материалов для клинических применений. Кроме того, ФЛС и фибробласты кожи не трудно получить в клиниках. Как уже упоминалось в различных докладах, фибробласты кожи (дермы т.е.л) фибробласты могут быть получены только с помощью пробивных биопсий. ФЛС могут быть выделены только с помощью инвазивной хирургической процедуры, и эта операция выполняется на больных с тяжелой гиперплазии, перенесших операции на колене. Таким образом, нет необходимости использовать FLSS при перепрограммировании не-RA IPSC. Кроме того, процесс, с помощью которого фибробласты подготовлены к перепрограммированию сложно и занимает много времени. ФЛС одни и те же недостатки, что фибробласты кожи. Таким образом, источники клеток, которые легче обрабатывать и получать обязательные для заполнения.
По этой причине, исследователи начали искать альтернативный источник клеток. Использованный в настоящее время материал клетки крови. Легко нарисовать кровь и процесс изоляции является относительно простым и быстрым. Кроме того, происходит сдвиг от использования лентивирусов для инструментов, которые не требуют генома интеграции, таких как Сендай вирусных систем, небольших молекул и эписомальные плазмид.
Хотя ФЛС не могут быть использованы в качествематериал для различных лиц, он по-прежнему большой материал при создании RA-ИПСК для исследовательских целей. В будущем, мы хотим, чтобы сгенерировать пациента RA FLS производный IPSC банк. больных РА индивидуально показывают различные реакции на лекарственные средства, которые используются для лечения. При наличии нескольких линий РА ИПСК, мы надеемся сформировать лекарственно-скрининг клеток-банк для пациентов с РА. По скрининга все лекарства на каждой клеточной линии, мы можем быть в состоянии предсказать, какой препарат будет работать на каком конкретного пациента.
В заключение, этот протокол описывает применение технологии иПСК к ревматологии. С помощью этого протокола, иПСК могут быть получены из RA пациента, полученного ФЛС, и сгенерированные иПСК имеют требуемые характеристики. Эти иПСК могут быть использованы в клинических исследованиях, скрининга лекарственных средств, моделирования болезней и восстановительной медицины для дальнейших исследований биологии РА.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
