Summary
Her beskriver vi en protokoll for generering av menneskeskapte-pluripotente stamceller fra pasient-avledet fibroblast-synoviocytter, ved hjelp av et system uten lentiviral feeder-celler.
Abstract
Eldre somatiske celler kan reverseres i en pluripotent stamcellelignende tilstand ved hjelp av et definert sett med omprogrammering faktorer. Tallrike studier har generert indusert-Pluripotent stamceller (iPSCs) fra ulike somatiske celletyper ved transducing fire Yamanaka transkripsjonsfaktorer: OCT4, Sox2, Klf4 og c-myc. Studiet av iPSCs forblir i forkant av biologisk og klinisk forskning. Spesielt kan pasientspesifikke iPSCs brukes som en banebrytende verktøy for studier av sykdommen patobiologi, ettersom iPSCs kan induseres fra vev av en hvilken som helst individ. Revmatoid artritt (RA) er en kronisk betennelsessykdom, klassifisert av ødeleggelse av brusk og bein strukturen i leddet. Synovial hyperplasi er en av de viktigste grunnene eller symptomer som fører til disse resultater i RA. Fibroblast-synoviocytter (FLSs) er de viktigste komponentcellene i hyperplastiske synovium. FLSs i felles limitlessly spre seg, til slutt invadere nabo cartilalder og bein. For tiden kan det hyperplastisk synovium fjernes ved et kirurgisk inngrep. Det fjernede synovium brukes for RA forskning som et materiale som reflekterer den inflammatoriske tilstand av skjøten. Som en stor aktør i patogenesen av RA kan FLSs brukes som materiale for å generere og undersøke iPSCs av RA-pasienter. I denne studien brukte vi FLSs av en RA pasient å generere iPSCs. Ved hjelp av en lentiviral system, oppdaget vi at FLSs kan generere RA pasient-spesifikke IPSC. De iPSCs generert fra FLSs kan videre brukes som et verktøy for å studere patofysiologien av RA i fremtiden.
Introduction
Pluripotente stamceller er neste-generasjons plattform i ulike kliniske og biologiske felt. De er et lovende verktøy som kan brukes på sykdom modellering, legemiddelscreening, og regenererende medisinsk terapi. Humane embryonale stamceller (hESCs) ble i hovedsak brukt til å studere og forstå pluripotente celler. Imidlertid isolert ved ødeleggelse av det humane blastocyst, er hESCs forbundet med flere etiske problemer. I 2007, Dr. Shinya Yamanaka og hans team reversert cellen programmeringsprosessen og utviklet stamceller fra menneskelige voksne somatiske celler 1,2. Derfor, i motsetning til hESCs, indusert-Pluripotent stamceller (iPSCs) kan genereres fra modne somatiske celler, unngår de etiske hindrene.
Vanligvis er iPSCs generert av levering av fire eksogene gener: Oct4, Sox2, Klf4, og c-Myc. Disse Yamanaka faktorene er opprinnelig levert med lentiviral og retrovirale systemer. De første iPSCs ble avledet fra mus somatisk calen 3. Deretter ble teknikk anvendt på humane dermale fibroblaster 1,2. Senere studier med hell generert iPSCs fra forskjellige kilder, for eksempel urin 4, blod 5,6, keratinocytter 7, og en rekke andre celletyper. Det er imidlertid noen somatiske celler som ikke har vært brukt i omprogrammering, og screening av de reprogrammerings-egenskapene til forskjellige celletyper fra bestemte vev i sykdomstilstand, er fremdeles nødvendig.
Revmatoid artritt (RA) er en sykdom som kan slå alle skjøter og føre til autoimmune tilstander i andre organer. RA rammer ca 1% av voksne i den industrialiserte verden. Det er en ganske vanlig sykdom og forekomsten øker hvert år åtte. Imidlertid er RA vanskelig å identifisere i de tidlige stadier og oncebone ødeleggelse oppstår det ingen behandling som kan gjenopprette skadene. Videre legemidlets effekt er forskjellig fra pasient til pasient, og det er vanskelig å forutsi den legeine som er nødvendig. Derfor er utvikling av et medikament-screening-metoden er nødvendig, og et cellemateriale som kan gjenspeile betingelsene for RA er nødvendig.
Fibroblast-synoviocytter (FLSs) er en aktiv cellulær deltaker i patogenesen av RA 9,10. FLSs finnes i ledd intimale foring mellom leddkapselen og hulrom, som også er referert til som synovium. Ved å støtte den felles struktur og gi næring til den omgivende brusk, FLSs vanligvis spille en avgjørende rolle i leddfunksjon og vedlikehold. Men FLSs i RA har en invasiv fenotype. RA FLSs har en kreftlignende fenotype, slutt å ødelegge omkringliggende benet ved uendelig spredning 10. Med denne unike egenskap, kan FLSs brukes som et lovende materiale som kan gjenspeile den patobiologi av RA. Likevel er disse cellene sjelden produsert, og cellen fenotyper endre som cellene går gjennom flere passasjer i in vitro
Teoretisk kan RA pasient avledet iPSCs (RA-iPSCs) blitt et ideelt verktøy for narkotika screening og videre forskning. Generert iPSCs har selvfornyelse evne og kan opprettholdes og utvides in vitro. Med pluripotency, kan disse cellene differensieres til modne chondrocyttransplantasjon og osteocyte slektsnavn, som kan bidra cellemateriale for spesifikk forskning i RA og andre bein-relaterte sykdommer 11.
I denne studien viser vi hvordan du isolerer og utvide FLSs fra et kirurgisk fjernet synovialhinne, og hvordan å generere RA-iPSCs fra FLSs hjelp lentiviruses inneholder Yamanaka faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Denne studien protokollen ble godkjent av Institutional Review Board of The Catholic University of Korea (KC12TISI0861).
1. Synoviocyte Isolering og Utvidelse
- Synoviocyte Isolation
- Steriliser to par kirurgiske sakser og en pinsett.
- Overfør synovial vev til en 100 mm skål og vask med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 1% penicillin / streptomycin.
- Skjær av gulaktig fettvev og beinrester. Overfør den trimmede vevet til en brønn i en 6-brønns plate og tilsett 5 ml av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 20% føtalt bovint serum (FBS).
- Hakk vev med saksen til bitene er små nok til å trenge gjennom en engangspipette.
- Overfør den vev-inneholdende medium i et 50 ml konisk rør. Høste gjenværende materiale ved tilsetning av 5 ml DMEM med 20% FBS til 6-brønns plate og deretter overføres til røret. </ Li>
- Tine kollagenase på is. Legg kollagenase til en sluttkonsentrasjon på 0,01% og forsegle røret med Parafilm. Inkubasjon i et vannbad ved 37 ° C med risting i 4 timer.
- Etter inkubasjon fylle røret med DMEM med 20% FBS, inntil det totale volum er 50 ml og sentrifuger ved 300 xg, RT i 10 min.
- Fjern supernatanten uten å forstyrre pelleten og tilsett 40 ml media til resuspender pelleten.
- Gjenta trinn 1.1.10-1.1.11.
- Resuspender pelleten i 25 ml DMEM med 20% FBS og vente for de store klumper av vev til å synke til bunns.
- Overfør supernatanten til en 100 mm skål og inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 i 14 dag.
- Synoviocyte vedlikehold og utbygging
- Kast den brukte media fra platen og vaske cellene med 5 ml PBS.
- Tilsett 1 ml PBS / 1 mM EDTA og inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 i 2 min.
- Trykk på fatet forsiktig og transfer cellene til et 15 ml konisk rør. Sentrifuger cellene ved 250 xg, RT i 2 min.
- Fjern supernatanten uten å forstyrre pelleten og resuspender pelleten i 30 ml DMEM med 20% FBS.
- Overfør cellene til 3 x 100 mm retter, uten å etterlate noen synlige left materiale.
- Bytt ut media med friske media hver 3 dager. Splitte cellene ved 80% konfluens ved bruk av 1 ml PBS / 1 mM EDTA. Oppretthold inntil passasje 3 før bruk. Del hver tallerken av celler inn i 3 retter i hver splittet.
MERK: Etter å ha nådd passering 3, kan celler som ikke kommer til å bli brukt umiddelbart fryses.
2. Omprogrammering FLSs Bruke lentiviruses-koder Yamanaka Factors
- Transduksjon (D0)
- Seed 3 x 10 4 celler pr brønn i en 6-brønns plate i vekstmedium (500 ml DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin). Inkuber cellene O / N ved 37 ° C i 5% CO2.
- Dagen etter, fjerne ett hetteglass med lentivirus som inneholder fire Yamanaka faktorer: Oct4, Klf4, Sox2 og c-myc fra fryseren og tine ved 4 ° C. Merk: Lentivirus ble fremstilt ved den fremgangsmåte som er beskrevet i vår tidligere studie 11.
- Mens tining viruset, endre media til FLS vekstmedium (20% FBS, pluss antibiotika i DMEM) inneholdende 10 ug / ml hexadimethrine bromid og 50 ug / ml askorbinsyre.
- Etter endring av media, legger 30 mL av lentivirus til cellene og bland forsiktig. For å forbedre infeksjon, sentrifuger platen ved 680 xg, 35 ° C i 30 minutter.
- Etter sentrifugering, inkubere cellene ved 37 ° C i 5% CO2.
- Vedlikehold Inntil Omprogrammering er synlig
- For tre dag, erstatte media daglig med FLS vekstmedier som inneholder 0,1 mM natrium butyratproduserende og 50 mikrogram / ml askorbinsyre.
- Den neste dagen, erstatte media med en blanding av FLS vekstmedier ogIPSC medium (1: 1 forhold) inneholdende 0,1 mM natriumbutyrat og 50 ug / ml askorbinsyre.
Merk: Komponentene i IPSC media er gitt i materialer / utstyrsliste.
- Deling av celler for Colony Formation
- Forbered en vitronectin-belagt seks-brønns plate.
- Legg 60 mL vitronectin til 6 ml PBS uten Ca 2+ og Mg 2+. Satt 2 ml av blandingen i hver brønn og inkuberes i romtemperatur i minst 1 time. Merk: Arbeids konsentrasjonen av vitronectin er 5 mikrogram / ml.
- På D5, vaskes cellene med PBS.
- Tilsett 1 ml PBS / 1 mM EDTA for å løsne cellene og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 2 min.
- Høste celler og sentrifuger ved 250 xg, RT i 2 min.
- Splitte cellene ved 3 forskjellige forhold (1: 3, 1: 6, og 1: 9) for å oppnå forskjellige confluencies. Legg 900 mL av media til cellen pellet og resuspender. Legg 300, 150, og 100 ul av celleblandingen per brønn av en 6-brønns plate for å oppnå et forhold på 1: 3, 1: 6, og 1: 9, henholdsvis.
- Bytt ut media daglig med IPSC media til kolonier vises. Kolonier vises etter om D18. Merk: På dette stadiet, IPSC kolonier sameksistere med ikke-omprogrammeres FLSs.
- Forbered en vitronectin-belagt seks-brønns plate.
- Colony plukking
- Fremstille en 48-brønners vitronektin-belagte plate ved å tilsette 500 ul vitronektin til brønnene og inkuber ved romtemperatur i minst 1 time.
- Plasser mikroskop på en ren benk, og fjerne den seks-brønns plate fra inkubatoren.
- Fjern vitronectin oppløsningen fra 48-brønns plate og tilsett 500 mL IPSC media supplert med 10 mM Rho-forbundet, coiled-spole inneholder protein kinase (ROCK) hemmer.
- Ved hjelp av en 10p pipette, klippe rundt kolonien. Overfør plukket kolonien til en brønn på 48-brønners plate.
- Etter å plukke flere kolonier, inkubere cellene ved 37 ° C, 5% CO2.
- Oppretthold cellene til koloniene er store enough for overføring. Merk: Vi vanligvis sølt cellene når kolonien kommer ut av det synlige feltet i mikroskop, når sett ved 100X forstørrelse.
3. immunfluorescens Farging
- Cell Forberedelse
- Plassere et sterilt 18 mm dekkglass i en 12-brønns plate.
- Tilsett 1 ml PBS for å kjøle og skyll glasset.
- Erstatte med 1 ml av en 10 mikrogram / ml oppløsning vitronektin.
- Platen inkuberes ved romtemperatur i minst 1 time.
- Kast vitronektin løsning og plate iPSCs på vitronektin-belagte 12-brønns plate og kultur i 7 dager ved 37 ° C, 5% CO2, idet media ble endret daglig.
- Cell Farging
- Kast kultur media og vaske cellene med PBS gang.
- Fiksere cellene i 0,4% paraformaldehyd (PFA) i 30 minutter ved RT.
- Permeabilisere cellene med 0,1% Triton X-100 i 5 min ved RT.
- Fjern permeabilizationløsning og blokk med PBS inneholdende 2% bovint serumalbumin (BSA) i 30 min ved RT.
- Fortynn de antistoffer i PBS inneholdende 2% BSA i henhold til tabell 1. Cellene inkuberes med de primære antistoffer i 2 timer ved RT.
- Legge til den sekundære antistoff (fortynnet 1: 200) og inkuberes cellene i 1 time ved romtemperatur, unngå lys.
- Behandle cellene med 1 pl / ml DAPI i 10 minutter.
- Plassere dekkglasset på toppen av sleiden glass med antifade reagens og inkuber ved romtemperatur i 24 timer, unngå lys.
- Bekreft uttrykk med en fluorescens mikroskop.
4. Real-time Polymerase kjedereaksjon (RT-PCR)
- Ekstrahere mRNA fra cellepelleten med guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform ekstraksjon metode 11.
- Forsterke cDNA fra 2 mikrogram av det totale mRNA ved hjelp av revers transkripsjon 11.
- Bland komponentene som kreves for PCR ved bruk av 2 mL av cDNA template 11.
- Utfør RT-PCR og verifisere resultatene etter gelelektroforese 11.
5. alkalisk fosfatase (AP) Farging
- Kultur iPSCs i 5-7 dager ved 37 ° C, 5% CO 2 før farging.
- Aspirer media og fikse celler med 4% PFA i 1 min.
- Kast fiksativ og skyll cellene med 1X skylling buffer.
- Forbered reagenser for AP farging. Blanding av reagensene i det følgende forhold: Fast Red Violet: Naphthol AS-BI-fosfat løsning: vann = 2: 1: 1.
- Cellene inkuberes med det fargeløsning ved RT i 15 min, unngå lys.
- Kast flekker og skyll cellene med skylle buffer.
- Dekk cellene med PBS for å hindre uttørking og verifisere uttrykk ved hjelp av en lys-feltet mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien, beskriver vi en protokoll for å generere iPSCs fra FLSs ved hjelp av et lentiviral system. Figur 1A viser en enkel løsning av FLS isolasjonsprotokoll. Etter kirurgisk fjerning av synovium ble vevet kuttet opp i små stykker ved hjelp av kirurgiske sakser. Kollagenase ble tilsatt for å isolere cellene fra klumper av vev. Celler ble inkubert i 14 dager før videre behandling. Figur 1B viser morfologien av den isolerte FLSs. Celler ble opprettholdt i 3 passeringer før bruk. FLSs dele en lignende karakteristikk med generelle fibroblaster. Vår isolert FLSs uttrykte fibrotiske markører, vimentin og Fibronektin. Det isolerte RA FLSs også viste lav ekspresjon av makrofag-lignende synoviocyte markør, CD68 (figur 1C).
FLSs ble høstet og transduced med lentiviruses inneholder fire Yamanaka faktorer for omprogrammering. Etter å splitte cellene ved forskjellige forhold (D7), små kolonier begynte å dukke opp. Synlige kolonier, som vist i figur 2A, dukket opp på D8-11. Kolonier kan plukkes fra dette punktet. Figur 2B viser et bilde av en valgt og forsterket koloni.
iPSCs ble utvidet til passasje 5-10, og deretter anvendt i forskjellige analyser. Udifferensierte ESCs er preget av en høy grad av AP. Cellene ble farget for AP å bekrefte udifferensiert tilstand. RA-iPSCs uttrykt AP (figur 2C), som indikerer at de er udifferensierte. Pluripotent markør uttrykk ble undersøkt (figur 2D, E). Uttrykket av pluripotente markører som Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28, DPPB5 og TDGF1 ble bekreftet ved hjelp av RT-PCR (figur 2D). Ekspresjonen av Oct3 / 4, Sox2 ble også bekreftet ved immunofluorescens ennalysis med flere markører som SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 og Klf4. TRA-1-60, som for tiden er antatt å være den viktigste IPSC markør, ble sterkt uttrykt i våre genererte iPSCs.
For ytterligere analyse, utførte vi karyotypering og teratom analysen. RA-iPSCs viste en normal kromosomalt mønster av 44 + XY (figur 3A). 12 uker-post injeksjon av RA-iPSCs i SCID-mus, teratomas hadde dannet og vises ulike vev, for eksempel kjertel, fettvev og blodårer (Figur 3B). Den bakterie lag differensieringen ble også bekreftet ved immunfluorescens farging. Ektoderm avstamning celler ble positivt farget for Otx2. Mesodermal cellene uttrykte brachyury, og endoderm ble bekreftet av positiv farging av SOX17.
Figur 1: Protocol for FLS Isolasjon fra en RA pasient. (A) En enkel diagram av metoden som brukes for synoviocyte isolasjon. (B) Morfologi av isolert FLSs. (C) Fluorescensmikroskopi bilde av FLSs farget med fibrotisk markører vimentin, fibronektin og en makrofag-lignende synoviocyte markør, CD68. Alle Scale barer = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Generering av iPSCs fra FLSs isolert fra en RA pasient (A) Bright-feltet bilde av en IPSC koloni før plukke.. (B) Bilde av en koloni etter plukking. (C) Colony farget for AP. (D) PCR-analyse of pluripotente markører. (E) Fluorescensmikroskopi bilde av iPSCs. De genererte iPSCs uttrykte alle pluripotente markører. Alle Scale barer = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Karyotype Analyse og Teratoma analyse (A) Høyoppløselige G-banded bilder som viser normale karyograms av iPSCs.. Bildet representerer en 46XY normal diploid mannlig kromosominnhold. (B) Resultater av teratom analyser og immunfluorescens flekker. Alle Scale barer = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Før oppdagelsen av iPSCs, forskere hovedsakelig brukt ESCs å studere stamcellebiologi og andre celle linjer gjennom differensiering. Imidlertid ESCs stammer fra den indre massen av en blastocyst som er tidlig stadium embryo. For å isolere ESCs, ødeleggelse av blastocyst er uunngåelig, heve etiske problemstillinger som er umulig å overvinne. Dessuten, selv ESCs har stemness egenskaper og pluripotency, de kan ikke hentes fra enkeltpersoner, og er noen ganger ikke et ideelt verktøy for personlig analyse og sykdom screening.
I 2007 Takahashi et al. genererte iPSCs fra humane fibroblaster 2. Teoretisk, i motsetning til ESCs, iPSCs kan genereres fra alle voksne somatiske celler. Med denne fordelen, er iPSCs tenkt å være et ideelt verktøy for auto-celle transplantasjon. Også, med begrepet epigenetisk minnet, iPSCs antatt å være den ideelle cellemateriale for simulering av patogene tilstander, dvs. Sykdom modellering. Det har vært mange studier som er gjort ved hjelp av forskjellige typer av celler slik som blodceller, urin celler og mer. Likevel er det mange celletyper, slik som FLSs, der omprogrammering ikke er blitt utført.
Leddgikt sykdommer er store immune sykdommer som kan føre til varig uførhet. RA er forårsaket av kronisk betennelse i leddene, til slutt resultimg i ben og brusk skader. Det er vanskelig å kurere eller reversere skader, spesielt fordi brusk ikke kan regenerere in vivo. Derfor regenerativ medisin bruker iPSCs er en ny viktig verktøy for herding av RA. Ben og brusk tap resulterte også i pannus formasjon. Pannus er et horn-lignende struktur som kan sees i det histologiske bildet av skjøten. Den pannus er laget av FLSs som sprer limitlessly som kreftceller. Derfor er det antatt at den FLSs kan reflektere de patologiske egenskaper av sykdommen. I denne studien brukte vi tålmodig FLSs å generere iPSCs.
FLSs er hovedcelletype som bidrar til patogenesen av RA. Som en celle som er mest utsatt for inflammatorisk miljø inne i synovial leddet, vår gruppe trodde at den kan brukes som et materiale som reflekterer pasientens sykdomstilstand. Derfor, ved å bruke den tidligste reprogrammerings-metoden, forsøkte vi å generere RA-spesifikk iPSCs fra FLSs, ved hjelp av leveringen av 4 Yamanaka faktorer - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-Myc - fra lentivirus. FLSs ble isolert fra den fjernede synovium. Den trimming av synovialhinne var kritisk da isolere FLSs. Bein og fett rester kan gjøre det mer komplisert å skaffe rent FLSs. Dessuten er bruk av kollagenase uunngåelig for FLS isolasjon. Det er viktig å bruke celler mellom passasjer 3-8. Når FLSs nå passasje 3, er det Yamanaka faktor som inneholder lentivirus genereres ved å følge prosedyren som er nevnt i vårt tidligere arbeid 11. Ved hjelp av de produserte lentiviruses, Vi får generert RA FLS-avledet iPSCs (RA-iPSCs). Pure IPSC kloner ble generert av kolonien plukking metode. RA-iPSCs uttrykte alle pluripotente transkripsjons markører og hadde en normal karyotype. Videre RA-iPSCs var i stand til å differensiere til alle tre bakterie lag i henhold til den teratom analysen. Også har vi bekreftet at RA-iPSCs viste mer mineralisering når differensiert i osteogene linjene in vitro (data ikke vist) 11.
Det er imidlertid noen begrensninger for denne metoden. Lentiviruses krever genomisk integrasjon for omprogrammering. KLF-4 og c-Myc er onkogener og disse to Yamanaka faktorene kan legge til rette for tumorvekst in vivo. Derfor kan det ikke være ideelt å bruke disse faktorene til å generere materialer for kliniske anvendelser. Videre FLSs og hudfibroblaster er ikke vanskelig å få tak i klinikker. Som nevnt i forskjellige rapporter, hudfibroblaster (dvs. dermal fibroblaster) kan bare oppnås ved punsj biopsier. FLSs kan isoleres kun av en invasiv kirurgisk prosedyre, og denne operasjonen er utført på pasienter med alvorlig hyperplasi som har gjennomgått en kneoperasjon. Derfor er det ikke nødvendig å bruke FLSs når omprogrammering av et ikke-RA IPSC. I tillegg er den prosessen som fibroblaster fremstilles for omprogrammering er vanskelig og tidkrevende. FLSs deler de samme svakhetene som hud fibroblaster. Derfor er cellekilder som er enklere å håndtere og oppnå nødvendig.
Av denne grunn, har forskere begynt å søke etter en alternativ celle-kilde. En for tiden brukte materialet er blodceller. Det er lett å trekke blod og isoleringsprosessen er relativt enkel og rask. Videre er det et skifte fra bruk av lentivirus til verktøy som ikke krever genom-integrasjon, for eksempel Sendai virus-systemer, små molekyler og episomale plasmider.
Selv om FLSs ikke kan brukes somet materiale for ulike individer, er det fortsatt et stort materiale ved generering av RA-iPSCs for forskningsformål. I fremtiden ser vi for å generere en RA pasient FLS-avledet IPSC bank. RA-pasienter viser individuelt ulike reaksjoner på legemidler som brukes til behandling. Med flere linjer med RA iPSCs, håper vi å skape en narkotika-screening celle-bank for RA-pasienter. Ved screening alle legemidler på hver cellelinje, kan vi være i stand til å forutsi hvilket medikament vil fungere på som enkelte pasient.
Som konklusjon, beskriver denne protokollen anvendelse av IPSC teknologi til reumatologi. Med denne protokollen kan iPSCs genereres fra RA pasient-avledet FLSs, og de genererte iPSCs har de nødvendige egenskapene. Disse iPSCs kan brukes i klinisk forskning, legemiddelscreening, sykdom modellering, og regenerativ medisin for videre undersøkelser av biologien til RA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
