Summary
Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes humanas inducida de sinoviocitos similares a fibroblastos derivados del paciente, utilizando un sistema lentiviral sin células alimentadoras.
Abstract
células somáticas maduras pueden revertirse a un estado de células madre pluripotentes-como el uso de un conjunto definido de factores de reprogramación. Numerosos estudios han generado células pluripotentes inducidas-madre (iPSCs) de diversos tipos de células somáticas mediante la transducción cuatro factores de transcripción Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. El estudio de las células iPS se mantiene a la vanguardia de la investigación biológica y clínica. En particular, iPSCs específicos del paciente se pueden utilizar como una herramienta para el estudio pionero de patobiología de la enfermedad, ya que iPSCs pueden ser inducidos a partir del tejido de cualquier individuo. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica, clasificados por la destrucción del cartílago y la estructura ósea en la articulación. hiperplasia sinovial es una de las principales razones o síntomas que conducen a estos resultados en la AR. Los sinoviocitos tipo fibroblasto (FLSs) son las principales células componentes de la membrana sinovial hiperplásica. FLSs en la articulación ilimitadamente proliferan, finalmente invadir el cartil adyacentesla edad y el hueso. Actualmente, la membrana sinovial hiperplásica se puede quitar solamente por un procedimiento quirúrgico. La membrana sinovial eliminado se utiliza para la investigación RA como un material que refleja la condición inflamatoria de la articulación. Como un jugador importante en la patogénesis de la AR, FLSs se puede utilizar como un material para generar e investigar las iPSCs de pacientes con AR. En este estudio, hemos utilizado la FLSs de un paciente con AR para generar células iPS. El uso de un sistema lentiviral, descubrimos que puede generar FLSs RA-paciente específico IPSC. Las iPSCs generados a partir de FLSs se pueden utilizar además como una herramienta para estudiar la fisiopatología de la AR en el futuro.
Introduction
Las células madre pluripotentes son la plataforma de próxima generación en diversos campos clínicos y biológicos. Son una herramienta prometedora que puede utilizarse en el modelado de la enfermedad, la detección de drogas, y la terapia médica regenerativa. Las células madre embrionarias humanas (hESCs) se utilizaron principalmente para estudiar y comprender células pluripotentes. Sin embargo, aislado por la destrucción del blastocisto humano, hESCs están asociados con varias preocupaciones éticas. En 2007, el Dr. Shinya Yamanaka y su equipo invirtieron el proceso de programación celular y desarrollan células madre a partir de células somáticas adultas humana 1,2. Por lo tanto, a diferencia de hESCs, inducida por las células madre pluripotentes (iPSCs) se pueden generar a partir de células somáticas maduras, evitando los obstáculos éticos.
Por lo general, iPSCs son generados por la entrega de cuatro genes exógenos: Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Estos factores Yamanaka son entregados originalmente usando sistemas de lentivirus y retrovirus. Las primeras células iPS se derivaron de ratón c somáticaells 3. Posteriormente, la técnica se aplicó a los fibroblastos dérmicos humanos 1,2. Estudios posteriores generado correctamente iPSCs de diversas fuentes, tales como orina 4, la sangre 5,6, queratinocitos 7, y varios otros tipos de células. Sin embargo, hay algunas células somáticas que no han sido usados en la reprogramación, y el cribado de las capacidades de reprogramación de diversos tipos de células de tejidos específicos en el estado de la enfermedad, sigue siendo necesaria.
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad que puede afectar a todas las juntas y conducir a enfermedades autoinmunes en otros órganos. La AR afecta a alrededor del 1% de los adultos en el mundo desarrollado. Es una enfermedad bastante común y su incidencia aumenta cada año 8. Sin embargo, RA es difícil de identificar en las primeras etapas y oncebone destrucción ocurre no existe un tratamiento que puede recuperar el daño. Por otra parte, la eficacia del fármaco varía de paciente a paciente, y es difícil predecir el médicoine que se requiere. Por lo tanto, se necesita el desarrollo de un método de selección de fármacos, y se requiere un material celular que puede reflejar las condiciones de la AR.
Los sinoviocitos similares a fibroblastos (FLSs) son un participante celular activo en la patogénesis de la AR 9,10. FLSs existe en el revestimiento de la íntima sinovial entre la cápsula y cavidad de la junta, que también se refiere como la membrana sinovial. Mediante el apoyo a la estructura de la articulación y el aporte de nutrientes al cartílago circundante, FLSs suelen jugar un papel crucial en la función de las articulaciones y el mantenimiento. Sin embargo, FLSs en la AR tiene un fenotipo invasivo. RA FLSs tienen un fenotipo similar al cáncer, finalmente destruir el hueso circundante por la proliferación infinita 10. Con esta característica única, FLSs se puede utilizar como un material prometedor que puede reflejar la patobiología de la AR. Sin embargo, estas células son rara vez se producen, y los fenotipos celulares alteran medida que las células pasan por varios pasajes de in vitro
En teoría, RA células iPS derivadas de pacientes (RA-iPSCs) pueden convertirse en una herramienta ideal para la detección de drogas y una mayor investigación. IPSCs generadas tienen la capacidad de auto-renovación y se pueden mantener y expandir in vitro. Con la pluripotencia, estas células pueden diferenciarse en condrocitos y osteocitos linajes maduros, que pueden contribuir material celular para la investigación específica en la AR y otras enfermedades relacionadas con los huesos 11.
En este estudio, se demuestra cómo aislar y expandir FLSs de una membrana sinovial extraído quirúrgicamente, y cómo generar RA-iPSCs de FLSs utilizando lentivirus que contenían factores Yamanaka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaración de Ética: Este protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (KC12TISI0861).
1. Aislamiento de sinoviocitos y Expansión
- El aislamiento de sinoviocitos
- Esterilizar dos pares de tijeras quirúrgicas y un par de fórceps.
- Transferir el tejido sinovial a un plato de 100 mm y se lava con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1% de penicilina / estreptomicina.
- Cortar los residuos en los tejidos de grasa y huesos amarillentos. Transferir el tejido recortado a un pocillo de una placa de 6 pocillos y añadir 5 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 20% (FBS).
- Picar los tejidos con las tijeras hasta que las piezas son lo suficientemente pequeñas como para penetrar una pipeta desechable.
- Transferir el medio que contiene el tejido a un tubo cónico de 50 ml. Se recoge el material restante mediante la adición de 5 ml de DMEM con 20% de SFB a la placa de 6 pocillos y luego transferir al tubo. </ Li>
- colagenasa deshielo en hielo. Añadir la colagenasa hasta una concentración final de 0,01% y sellar el tubo con parafilm. Incubar en un baño de agua a 37 ° C con agitación durante 4 hr.
- Después de la incubación, llenar el tubo con DMEM con 20% de SFB, hasta que el volumen total es de 50 ml y se centrifuga a 300 xg, ta durante 10 min.
- Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento y añadir 40 ml de medio para volver a suspender el sedimento.
- Repita los pasos 1.1.10-1.1.11.
- Resuspender el precipitado en 25 ml de DMEM con 20% de FBS y esperar a que las grandes masas de tejido a hundirse hasta el fondo.
- Transferir el sobrenadante a un plato de 100 mm y se incuba a 37 ° C en 5% de CO2 durante 14 días.
- Sinoviocitos Mantenimiento y Expansión
- Desechar los medios utilizados a partir de la placa y se lavan las células con 5 ml de PBS.
- Añadir EDTA 1 ml de PBS / 1 mM y se incuba a 37 ° C en 5% de CO2 durante 2 min.
- Toque suavemente el plato y transfer las células a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células a 250 g, la temperatura ambiente durante 2 min.
- Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento y volver a suspender el sedimento en 30 ml de DMEM con 20% de SFB.
- Transferir las células a 3 x 100 mm platos, sin dejar ningún material sobrante visible.
- Reemplazar los medios de comunicación por medio nuevo cada 3 d. Dividir las células en confluencia del 80% usando EDTA 1 ml de PBS / 1 mM. Mantener hasta el paso 3 antes de su uso. Dividir cada placa de células en 3 platos en cada división.
NOTA: Después de alcanzar el paso 3, las células que no se van a utilizarse inmediatamente se pueden congelar.
2. La reprogramación FLSs El uso de lentivirus que codifican factores de Yamanaka
- Transducción (D0)
- Seed 3 × 10 4 células por pocillo de una placa de 6 pocillos en medio de crecimiento (500 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina). Se incuban las células O / N a 37 ° C en 5% de CO2.
- Al día siguiente, eliminar un vial de lentivirus que contenía 4 Yamanaka factores: Oct4, Klf4, Sox2 y c-Myc del congelador y descongelar a 4 ° C. Nota: Lentivirus fue producido por el procedimiento descrito en nuestro estudio anterior 11.
- Mientras descongelación del virus, cambiar los medios de comunicación a los medios de crecimiento FLS (20% de FBS más antibióticos en DMEM) que contiene 10 mg / ml de bromuro de hexadimetrina y ácido ascórbico 50 mg / ml.
- Después de cambiar los medios de comunicación, añadir 30 l de lentivirus a las células y mezclar suavemente. Para mejorar la infección, centrifugar la placa a 680 xg, 35 ° C durante 30 min.
- Después de la centrifugación, se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2.
- Mantenimiento Hasta La reprogramación es visible
- Para 3 días, reemplazar los medios de comunicación a diario con medio de crecimiento que contiene 0,1 FLS mM de butirato de sodio y ácido ascórbico 50 mg / ml.
- Al día siguiente, en lugar de los medios de comunicación con una mezcla de medios de cultivo y FLSmedios IPSC (relación 1: 1) que contiene 0.1 mM de butirato de sodio y ácido ascórbico 50 mg / ml.
Nota: Los componentes de los medios de comunicación IPSC se da en la lista de materiales / equipos.
- Las células de división para la formación de colonias
- Preparar una placa de 6 pocillos recubiertos con vitronectina.
- Añadir vitronectina 60 l a 6 ml de PBS sin Ca2 + y Mg2 +. Poner 2 ml de mezcla en cada uno de los pozos y se incuban en RT durante al menos 1 hr. Nota: La concentración de trabajo de la vitronectina es 5 mg / ml.
- En D5, se lavan las células con PBS.
- Añadir 1 ml de EDTA PBS / 1 mM para separar las células y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 2 min.
- Recoger las células y centrifugar a 250 xg, TA durante 2 min.
- Dividir las células a 3 proporciones diferentes (1: 3, 1: 6, y 1: 9) para lograr diferentes confluencies. Añadir 900 l de medios de comunicación para el sedimento celular y resuspender. Añadir 300, 150, y 100 l de la mezcla de células por pocillo de una 6-así placa para lograr una proporción de 1: 3, 1: 6, y 1: 9, respectivamente.
- Reemplazar los medios de comunicación diaria con los medios de IPSC hasta que aparezcan las colonias. Las colonias van a aparecer después de unos D18. Nota: En esta etapa, las colonias IPSC coexistir con el FLSs no reprogramado.
- Preparar una placa de 6 pocillos recubiertos con vitronectina.
- recogida de colonia
- Preparar una placa de vitronectina recubierto de 48 pocillos mediante la adición de 500 l de vitronectina a los pocillos, e incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 hr.
- Coloque el microscopio sobre una mesa de trabajo limpia, y retire la placa de 6 pocillos de la incubadora.
- Eliminar la solución de vitronectina de la placa de 48 pocillos y añadir 500 l de IPSC medios suplementados con 10 mM de Rho-asociado, espiral de la bobina que contiene inhibidor de la proteína quinasa (ROCK).
- Con una punta de pipeta de 10 peniques, corte alrededor de la colonia. La transferencia de la colonia recogido a un pocillo de la placa de 48 pocillos.
- Después de recoger varias colonias, se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Mantener las células hasta que las colonias son grandes enouf para la transferencia. Nota: Por lo general, se le cayó de las células cuando la colonia se sale del campo visible del microscopio, cuando se ve con un aumento de 100X.
3. La tinción de inmunofluorescencia
- Preparación de la célula
- Coloque una cubierta de vidrio estéril de 18 mm en una placa de 12 pocillos.
- Añadir 1 ml de PBS para enfriar y enjuagar la cubierta de vidrio.
- Reemplazar con 1 ml de una solución de 10 mg / ml de vitronectina.
- Se incuba la placa a temperatura ambiente durante al menos 1 hora.
- Desechar la solución vitronectina y iPSCs placa en la placa de 12 pocillos recubiertos con vitronectina y la cultura durante 7 días a 37 ° C, 5% de CO 2, el cambio de los medios de comunicación todos los días.
- la tinción de células
- Descartar el medio de cultivo y se lavan las células una vez con PBS.
- Fijar las células en 0,4% de paraformaldehído (PFA) durante 30 min a RT.
- Permeabilizar las células con 0,1% Triton X-100 durante 5 min a RT.
- Retire la permeabilizaciónsolución y de bloque con PBS que contiene 2% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 30 min a TA.
- Diluir los anticuerpos en PBS que contenía 2% de BSA de acuerdo con la Tabla 1. Se incuban las células con los anticuerpos primarios durante 2 horas a RT.
- Añadir el anticuerpo secundario (diluido 1: 200) y se incuban las células durante 1 hora a temperatura ambiente, evitando la luz.
- Tratar las células con 1 l / ml DAPI para 10 min.
- Coloque la cubierta de vidrio en la parte superior de la placa de cristal con antifade reactivo y se incuba a temperatura ambiente durante 24 horas, evitando la luz.
- Verificar la expresión con un microscopio de fluorescencia.
4. tiempo real de reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR)
- Extracto de ARNm del sedimento celular usando el tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo método de extracción 11.
- Amplificar ADNc a partir de 2 g de mRNA total de la transcripción inversa utilizando 11.
- Mezclar los componentes necesarios para la PCR utilizando 2 l de cDNA templaca 11.
- Realizar RT-PCR y verificar los resultados por electroforesis en gel de 11.
5. fosfatasa alcalina (AP) tinción
- IPSCs de cultivo durante 5-7 días a 37 ° C, 5% de CO2 antes de la tinción.
- Aspirar los medios de comunicación y fijar las células con PFA al 4% durante 1 min.
- Desechar el fijador y lavar las células con tampón de lavado 1X.
- Preparar los reactivos para la tinción de AP. Mezcle los reactivos en la siguiente proporción: Fast Red Violet: solución de fosfato de naftol AS-BI: agua = 2: 1: 1.
- Se incuban las células con la solución de tinción a temperatura ambiente durante 15 minutos, evitando la luz.
- Desechar la solución de tinción y lavar las células con tampón de enjuagado.
- Cubrir las células con PBS para evitar el secado y verificar la expresión mediante un microscopio de campo brillante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En este estudio, se describe un protocolo para generar células iPS de FLSs usando un sistema lentiviral. La figura 1A muestra un esquema simple del protocolo de aislamiento FLS. Después de la eliminación quirúrgica de la membrana sinovial, el tejido se corta en trozos pequeños con tijeras quirúrgicas. La colagenasa se añadió para aislar las células de los grupos de tejido. Las células se incubaron durante 14 días antes del procesamiento adicional. La Figura 1B muestra la morfología de la FLSs aislado. Las células se mantuvieron durante 3 pasajes antes de su uso. FLSs comparten una característica similar con fibroblastos generales. Nuestro aislado FLSs expresa los marcadores fibróticos, vimentina y fibronectina. El aislado RA FLSs también mostró una baja expresión del marcador de sinoviocitos tipo macrófago, CD68 (Figura 1C).
FLSs fueron cosechadas y transducidas con lentivirus que contenía 4 YamaNaka factores de reprogramación. Después de la división de las células a diversas relaciones (D7), pequeñas colonias comenzaron a aparecer. Colonias visibles, como se muestra en la Figura 2A, aparecieron en D8-11. Las colonias se pueden recoger a partir de este punto. La Figura 2B muestra una imagen de una colonia recogido y amplificado.
iPSCs se expandieron hasta el paso 5-10 y luego utilizan en diversos ensayos. CES no diferenciadas se caracterizan por un alto nivel de AP. Las células se tiñeron para AP para confirmar el estado indiferenciado. RA-iPSCs expresó AP (Figura 2C), lo que indica que no se diferencian. La expresión de marcadores pluripotentes fue examinado (Figura 2D, E). La expresión de marcadores pluripotentes tales como Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28, DPPB5 y TDGF1 se confirmó mediante RT-PCR (Figura 2D). La expresión de Oct3 / 4, Sox2 también fue confirmada por inmunofluorescencia unanálisis con marcadores adicionales tales como SSEA4, TRA-1-60, 1-81 y TRA-Klf4. TRA-1-60, que se cree actualmente que el marcador de IPSC más importante, fue altamente expresado en nuestras células iPS generadas.
Para un análisis más detallado, se realizó un ensayo de determinación del cariotipo y teratoma. RA-iPSCs mostraron un patrón cromosómico normal de 44 + XY (Figura 3A). Inyección de 12 semanas post del RA-iPSCs en ratones SCID, los teratomas se había formado y se muestran diversos tejidos, como la glándula, tejido adiposo y vasos sanguíneos (Figura 3B). La diferenciación capa germinal también se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia. ectodermo células de linaje se tiñeron positivamente para Otx2. Las células del mesodermo expresan brachyury, y el endodermo se confirmó mediante tinción positiva de SOX17.
Figura 1: protocol para FLS Aislamiento de un paciente RA. (A) A simple diagrama del método utilizado para el aislamiento de sinoviocitos. (B) Morfología de FLSs aisladas. (C) la microscopía de fluorescencia de imagen de FLSs tiñó con marcadores fibróticos vimentina, fibronectina y un marcador de sinoviocitos tipo macrófago, CD68. Todas las barras de escala = 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Generación de iPSCs de FLSs aisladas de un paciente RA (A) Imagen de campo brillante de una colonia de IPSC antes de recoger.. (B) Imagen de una colonia después de la recolección. (C) la colonia tiñó para AP. (D) o PCR análisismarcadores pluripotentes f. (E) Microscopía de fluorescencia de imagen de iPSCs. Las células iPS generadas expresan todos los marcadores pluripotentes. Todas las barras de escala = 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de cariotipo y teratoma Ensayo (A) de alta resolución G-congregado imágenes que muestran karyograms normales de células iPS.. La imagen representa un contenido cromosómico diploide normal de sexo masculino 46XY. (B) Los resultados de los ensayos de teratoma y tinción de inmunofluorescencia. Todas las barras de escala = 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antes del descubrimiento de iPSCs, los científicos utilizan principalmente los CES para estudiar la biología de células madre y otros linajes celulares a través de la diferenciación. Sin embargo, los CES originan a partir de la masa interna de un blastocisto, que es un embrión en etapa temprana. Para aislar los CES, la destrucción del blastocisto es inevitable, plantea cuestiones éticas que son imposibles de superar. Por otra parte, aunque los CES tienen características stemness y pluripotencia, no pueden ser obtenidos a partir de los individuos y, a veces no son una herramienta ideal para el análisis personalizado y detección de enfermedades.
En 2007, Takahashi et al. iPSCs generadas a partir de fibroblastos humanos 2. En teoría, a diferencia de los CES, iPSCs se pueden generar a partir de las células somáticas adultas. Con esta ventaja, se cree que iPSCs ser la herramienta ideal para el trasplante de células de automóviles. Además, con el concepto de memoria epigenética, se cree que iPSCs ser el material celular ideal para la simulación de condiciones patógenas, es decir,. Modelado enfermedad. Ha habido muchos estudios realizados usando varios tipos de células, tales como células sanguíneas, células de orina y más. Sin embargo, hay muchos tipos de células, tales como FLSs, en los que no se ha llevado a cabo la reprogramación.
enfermedades artríticas son los principales trastornos inmunes que pueden causar discapacidad permanente. RA es causada por la inflamación crónica en las articulaciones, con el tiempo resultimg daños hueso y cartílago. Es difícil de curar o revertir el daño del cartílago sobre todo porque no puede regenerarse in vivo. Por lo tanto el uso de la medicina regenerativa células iPS son una nueva herramienta crítica para la cura de la artritis reumatoide. La pérdida de hueso y cartílago también se dio lugar a la formación de pannus. Pannus es una estructura de cuerno que se puede ver en la imagen histológica de la articulación. El pannus se hace por FLSs que proliferan ilimitadamente como las células cancerosas. Por lo tanto, se piensa que el FLSs puede reflejar las características patológicas de la enfermedad. En este estudio, hemos utilizado paciente FLSs para generar células iPS.
FLSs son el principal tipo de células que contribuyen a la patogénesis de la AR. Como una célula que es principalmente expuesta al medio ambiente inflamatoria dentro de la articulación sinovial, nuestro grupo pensó que se puede utilizar como un material que refleja la condición de la enfermedad del paciente. Por lo tanto, utilizando el método de reprogramación más temprana, se intentó generar células iPS-RA específica de FLSs, mediante la entrega de los 4 factores Yamanaka - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-Myc - por lentivirus. FLSs fueron aisladas de la membrana sinovial eliminado. La guarnición de la membrana sinovial fue crítico al aislar FLSs. residuos de hueso y grasa puede hacer que sea más complicado para obtener pura FLSs. Además, el uso de la colagenasa es inevitable para el aislamiento FLS. Es importante utilizar células entre los pasajes 3-8. Cuando llegan FLSs paso 3, el factor Yamanaka que contiene los lentivirus se generan siguiendo el procedimiento mencionado en nuestro trabajo anterior 11. El uso de los lentivirus producidos, Hemos generado con éxito células iPS derivadas de RA FLS (AR-iPSCs). IPSC clones puros fueron generados por el método de recogida de colonia. El RA-iPSCs expresado todos los marcadores de transcripción pluripotentes y tenía un cariotipo normal. Por otra parte, los RA-iPSCs fueron capaces de diferenciarse en las tres capas germinales de acuerdo con el ensayo de teratoma. Además, hemos confirmado que los RA-iPSCs mostraron una mayor mineralización cuando diferenciarse en linajes osteogénicos in vitro (datos no mostrados) 11.
Sin embargo, existen algunas limitaciones a este método. Los lentivirus requieren integración genómica para la reprogramación. Klf-4 y c-Myc son oncogenes y estos dos factores Yamanaka pueden facilitar el crecimiento del tumor in vivo. Por lo tanto, puede que no sea ideal para utilizar estos factores para generar materiales para aplicaciones clínicas. Además, FLSs y fibroblastos de la piel no son difíciles de obtener en las clínicas. Como se ha mencionado en varios informes, los fibroblastos de la piel (dermis es decir,l fibroblastos) sólo se pueden obtener por biopsias por punción. FLSs se puede aislar solamente por un procedimiento quirúrgico invasivo y esta cirugía se realiza en pacientes con hiperplasia severa que han sido sometidos a una cirugía de rodilla. Por lo tanto, no hay necesidad de utilizar FLSs cuando la reprogramación de un no-RA IPSC. Además, el proceso por el que los fibroblastos se preparan para la reprogramación es difícil y consume mucho tiempo. FLSs comparten las mismas deficiencias que los fibroblastos de la piel. Por lo tanto, se requieren fuentes de células que son más fáciles de manejar y obtienen.
Por esta razón, los investigadores han comenzado a buscar una fuente alternativa célula. Un material usado actualmente es células de la sangre. Es fácil de extraer la sangre y el proceso de aislamiento es relativamente sencillo y rápido. Además, hay un cambio del uso de los lentivirus de herramientas que no requieren genoma-integración, como los sistemas Sendai virales, moléculas pequeñas, y los plásmidos episomales.
Aunque FLSs no se puede utilizar comoun material para diversos individuos, todavía es un gran material cuando se genera la AR-iPSCs para fines de investigación. En el futuro, estamos buscando para generar un banco de IPSC derivado del paciente con AR FLS. los pacientes con AR muestran individualmente diversas reacciones a las drogas que se utilizan para el tratamiento. Con varias líneas de células iPS RA, tenemos la esperanza de generar una célula de banco de selección de fármacos para los pacientes con AR. Mediante el cribado de todos los medicamentos en cada línea celular, podemos ser capaces de predecir qué medicamento funcionará en la que cada paciente.
En conclusión, este protocolo se describe la aplicación de la tecnología de IPSC de reumatología. Con este protocolo, células iPS pueden ser generados a partir de FLSs derivada de paciente con AR, y las células iPS generadas tienen las características requeridas. Estas células iPS pueden ser utilizados en la investigación clínica, la detección de drogas, el modelado de la enfermedad, y la medicina regenerativa para futuras investigaciones sobre la biología de la AR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
