Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die menschliche Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen von Patienten stammenden Fibroblasten-ähnlichen Synoviozyten, ein lentiviraler System ohne Feeder-Zellen.
Abstract
Reife somatische Zellen in eine pluripotente Stammzelle ähnlichen Zustand mit einem definierten Satz von Reprogrammierungsfaktoren rückgängig gemacht werden. Zahlreiche Studien haben induzierte pluripotente Stammzellen erzeugt Zellen (iPS-Zellen) aus verschiedenen Zelltypen, die von vier Yamanaka Transkriptionsfaktoren transduzierenden: Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc. Die Studie von iPS-Zellen bleibt auf dem neuesten Stand der biologischen und klinischen Forschung. Insbesondere patientenspezifische iPSCs kann als Pionier Werkzeug für die Untersuchung von Krankheits Pathobiologie verwendet werden kann, da iPSCs aus dem Gewebe eines Individuums induziert werden. Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die durch die Zerstörung von Knorpel und Knochenstruktur in dem gemeinsamen klassifiziert. Synoviale Hyperplasie ist einer der wichtigsten Gründe, oder Symptome, die zu diesen Ergebnissen bei RA führen. Fibroblast-wie Synoviozyten (FLSS) sind die Hauptkomponentenzellen in der hyperplastischen Synovium. FLSS in der gemeinsamen unbegrenzt vermehren, schließlich das benachbarte cartil eindringendenAlter und Knochen. Derzeit kann der hyperplastischen Synovium nur durch einen chirurgischen Eingriff entfernt werden. Das entfernte Synovium ist für RA Forschung als Material verwendet, die die entzündliche Erkrankung des Gelenks widerspiegelt. Als wichtiger Akteur in der Pathogenese der RA kann FLSS als Material verwendet werden, um die iPS-Zellen von RA-Patienten zu erzeugen und zu untersuchen. In dieser Studie verwendeten wir die FLSS eines RA Patienten iPSCs zu erzeugen. Verwendung eines lentiviralen System entdeckten wir, dass FLSS kann RA patientenspezifische iPSC erzeugen. Die iPSCs erzeugt aus FLSS kann weiter als ein Werkzeug verwendet werden, um die Pathophysiologie der RA in der Zukunft zu studieren.
Introduction
Pluripotente Stammzellen sind die Plattform der nächsten Generation in verschiedenen klinischen und biologischen Bereichen. Sie sind ein vielversprechendes Werkzeug, das in Krankheitsmodelle verwendet werden können, Wirkstoff-Screening, und regenerative medizinische Therapie. Humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) wurden vor allem verwendet, um zu studieren und pluripotenten Zellen zu verstehen. Doch durch die Zerstörung des menschlichen Blastozysten isoliert, hESCs sind mit mehreren ethischen Bedenken verbunden. Im Jahr 2007 kehrte Dr. Shinya Yamanaka und sein Team die Zelle Programmierprozess und entwickelt Stammzellen aus menschlichen adulten somatischen Zellen 1,2. Deshalb, im Gegensatz zu hES, induziert-pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) können aus reifen somatischen Zellen erzeugt werden, die ethischen Hürden zu vermeiden.
Üblicherweise iPSCs werden durch die Lieferung von vier exogenen Gene erzeugt: Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc. Diese Yamanaka Faktoren sind ursprünglich mit Lentiviren und retrovirale Systeme geliefert. Die ersten iPSCs wurden aus Maus somatischen c abgeleitetells 3. Danach wurde die Technik , um humane dermale Fibroblasten 1,2 angewendet. Nachfolgende Studien erzeugten erfolgreich iPSCs aus verschiedenen Quellen, wie beispielsweise Urin 4, Blut 5,6, Keratinozyten 7 und mehrere andere Zelltypen. Es gibt jedoch einige somatische Zellen sind, die nicht in Umprogrammierung verwendet haben, und Screening der Umprogrammierung Fähigkeiten verschiedener Zelltypen von spezifischen Geweben in Krankheitszustand, ist immer noch erforderlich.
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Erkrankung, die alle Gelenke treffen können und zu Autoimmunerkrankungen in anderen Organen führen. RA betrifft etwa 1% der Erwachsenen in der entwickelten Welt. Es ist eine ziemlich häufige Erkrankung und ihre Häufigkeit steigt jedes Jahr 8. Jedoch ist RA hart in den frühen Stadien und oncebone Zerstörung zu identifizieren auftritt gibt es keine Behandlung, die den Schaden erholen kann. Darüber hinaus unterscheidet sich die Arzneimittelwirksamkeit von Patient zu Patient, und es ist schwer, die Sanitäter zu prognostizierenine, die erforderlich ist. Daher wird die Entwicklung eines Medikaments-Screening-Verfahren benötigt wird, und ein Zellmaterial, das die Bedingungen von RA erforderlich reflektieren kann.
Fibroblast-like Synoviozyten (FLSS) sind eine aktive Mobilteilnehmer in der Pathogenese der RA 9,10. FLSS existieren in der synovialen intimale Auskleidung zwischen der Gelenkkapsel und den Hohlraum, der auch als das Synovium bezeichnet wird. Durch die gemeinsame Trägerstruktur und Nährstoffe zu den umgebenden Knorpel Bereitstellung FLSS in der Regel eine entscheidende Rolle bei der Gelenkfunktion und Wartung spielen. Allerdings FLSS in RA haben einen invasiven Phänotyp. RA FLSS haben einen Krebs-ähnlichen Phänotyp, was schließlich den umgebenden Knochen 10 durch unendliche Vermehrung zu zerstören. Mit dieser einzigartigen Charakteristik kann FLSS als vielversprechendes Material verwendet werden, das die Pathobiologie von RA reflektieren kann. Doch werden diese Zellen nur selten hergestellt und die Zelle Phänotypen verändern , wenn die Zellen durch mehrere Passagen in in vitro gehen
Theoretisch RA-Patienten stamm iPSCs (RA-iPS-Zellen) kann ein ideales Werkzeug für Wirkstoff-Screening und weitere Forschung. Erzeugte iPSCs haben Selbsterneuerungsvermögen und aufrecht erhalten und in vitro erweitert werden. Mit Pluripotenz, können diese Zellen in reife Chondrozyten und Osteozyten Abstammungslinien unterschieden werden, die Zellmaterial für spezifische Forschung in RA und anderen Knochen bedingte Krankheiten 11 beitragen kann.
In dieser Studie zeigen wir, wie FLSS von einem chirurgisch entfernt Synovium zu isolieren und zu erweitern, und wie RA-iPS-Zellen aus FLSS mit Lentiviren enthält Yamanaka Faktoren zu erzeugen.
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Protocol
Ethik-Erklärung: Diese Studienprotokoll vom Institutional Review Board der Katholischen Universität von Korea (KC12TISI0861) genehmigt wurde.
1. Synoviocyte Isolierung und Expansion
- Synoviocyte Isolation
- Sterilisieren zwei Paare von chirurgische Scheren und ein Paar Zangen.
- Übertragung der synovialen Gewebe zu einer 100 mm-Schale und wasche mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 1% Penicillin / Streptomycin.
- Schneiden Sie die gelbliche Fettgewebe und Knochenreste aus. Bringen Sie das zugeschnittene Gewebe auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 5 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 20% fötalem Rinderserum (FBS).
- Hacken Sie die Gewebe mit der Schere bis die Stücke sind klein genug, um eine Einweg-Pipette eindringen.
- Übertragen, um das Gewebe enthaltende Medium zu einem 50 ml konischen Röhrchen. Ernten Sie die verbleibende Material durch Zugabe von 5 ml DMEM mit 20% FBS auf die 6-Well-Platte und dann übertragen auf das Rohr. </ Li>
- Thaw Kollagenase auf Eis. Hinzufügen Kollagenase bis zu einer Endkonzentration von 0,01% und dichten das Rohr mit Parafilm. Inkubieren in einem Wasserbad bei 37 ° C mit 4 h schütteln.
- Nach der Inkubation Füllen des Röhrchens mit DMEM mit 20% FBS, bis das Gesamtvolumen 50 ml und Zentrifuge bei 300 xg ist, RT für 10 min.
- Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie 40 ml Medium, das Pellet zu resuspendieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.1.10-1.1.11.
- Resuspendieren des Pellets in 25 ml DMEM mit 20% FBS und warten auf die großen Klumpen von Gewebe auf den Boden zu versenken.
- Den Überstand auf eine 100 mm - Schale und inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 für 14 Tage.
- Synoviocyte Wartung und Erweiterung
- Entsorgen Sie die Medien von der Platte und die Zellen werden mit 5 ml PBS.
- 1 ml PBS / 1 mM EDTA und Inkubation bei 37 ° C in 5% CO 2 für 2 min.
- Tippen Sie auf die Schale sanft und transfer die Zellen einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 · g, RT für 2 min.
- Entfernen Sie den Überstand ohne das Pellet zu stören und das Pellet in 30 ml DMEM mit 20% FBS resuspendiert.
- Übertragen Sie die Zellen bis 3 x 100-mm-Schalen, ohne sichtbare Überbleibsel Material zurückbleibt.
- Ersetzen Sie die Medien durch frische Medien alle 3 d. Aufgeteilt, die Zellen bei 80% Konfluenz unter Verwendung von 1 ml PBS / 1 mM EDTA. Pflegen bis Passage 3 vor dem Gebrauch. Teilen Sie jedes Gericht von Zellen in drei Gerichte in jedem Split.
HINWEIS: Nach dem Durchgang Erreichen 3, Zellen, die nicht sofort eingefroren werden können, verwendet werden werden.
2. Reprogrammierung FLSS Mit Lentiviren kodierenden Yamanaka Faktoren
- Transduction (D0)
- Seed 3 × 10 4 Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen in Wachstumsmedium (500 ml DMEM , supplementiert mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin). Inkubiere die Zellen O / N bei 37 ° C in 5% CO2.
- Am nächsten Tag, entfernen Sie ein Fläschchen von Lentiviren, die 4 Yamanaka Faktoren: Oct4, Klf4, Sox2 und c-Myc aus dem Gefrierschrank und Tauwetter bei 4 ° C. Hinweis: Lentivirus wurde durch das Verfahren hergestellt , beschrieben in unserer früheren Studie 11.
- Während das Virus Auftauen, ändern Sie die Medien zu FLS Wachstumsmedien (20% FBS und Antibiotika in DMEM) 10 ug / ml Hexadimethrinbromid und 50 ug / ml Ascorbinsäure enthält.
- Nach den Medienwechsel, fügen Sie 30 ul Lentiviren zu den Zellen und vorsichtig mischen. Zur Verbesserung der Infektion, Zentrifuge die Platte bei 680 · g, 35 ° C für 30 min.
- Nach der Zentrifugation inkubiert , die Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2.
- Wartung Bis Reprogrammierung ist sichtbar
- Für 3 Tage, ersetzen Sie die Medien täglich mit FLS Wachstumsmedium 0,1 mM Natriumbutyrat und 50 ug / ml Ascorbinsäure enthält.
- Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Medium mit einer Mischung aus FLS Wachstumsmedien undiPSC Medien (Verhältnis 1: 1), enthaltend 0,1 mM Natriumbutyrat und 50 ug / ml Ascorbinsäure.
Hinweis: Die Komponenten der iPSC Medien in der Materialien / Ausstattungsliste gegeben.
- Teilen von Zellen für die Koloniebildung
- Bereiten Sie eine Vitronectin beschichteten 6-Well-Platte.
- Werden 60 & mgr; l Vitronectin bis 6 ml PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+. Setzen Sie 2 ml Mischung in den einzelnen Wells und Inkubation mindestens 1 Stunde in RT. Hinweis: Die Arbeitskonzentration von Vitronectin beträgt 5 & mgr; g / mL.
- Auf D5, waschen Sie die Zellen mit PBS.
- 1 ml PBS / 1 mM EDTA , die Zellen abzulösen und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2 min inkubieren.
- Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge bei 250 xg, RT für 2 min.
- Aufgeteilt, die Zellen bei 3 verschiedenen Verhältnissen (1: 3, 1: 6 und 1: 9) an unterschiedliche confluencies erzielen. Hinzufügen, 900 & mgr; l Medium zu dem Zellpellet und resuspendieren. Hinzufügen von 300, 150 und 100 & mgr; l der Zellmischung pro Vertiefung einer 6-3, 1: 6 und 1: 9, jeweils Well-Platte ein Verhältnis von 1 zu erreichen.
- Ersetzen Sie die Medien täglich mit iPSC Medien bis Kolonien erscheinen. Die Kolonien werden nach etwa D18 erscheinen. Anmerkung: In diesem Stadium iPSC Kolonien koexistieren mit dem nicht umprogrammiert FLSS.
- Bereiten Sie eine Vitronectin beschichteten 6-Well-Platte.
- Colony Kommissionierung
- Bereiten Sie eine 48-Well Vitronectin beschichteten Platte durch Zugabe von 500 ul Vitronectin an den Brunnen, und bei RT inkubieren mindestens 1 Stunde für.
- Stellen Sie das Mikroskop auf eine saubere Bank, und entfernen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator.
- Entfernen Sie die Vitronectin-Lösung aus der 48-Well-Platte und fügen 500 ul iPSC Medien, ergänzt mit 10 mM Rho-assoziierten, Coiled-Coil-containing protein kinase (ROCK) -Inhibitor.
- Mit Hilfe eines 10p-Pipettenspitze, schneiden um die Kolonie. Übertragen Sie die gepflückt Kolonie zu einer Vertiefung der 48-Well-Platte.
- Mehrere Kolonien Nach der Kommissionierung, Inkubation der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Pflegen Sie die Zellen, bis die Kolonien groß eno sindPfui für die Übertragung. Hinweis: Wir in der Regel die Zellen verschüttet, wenn die Kolonie aus dem sichtbaren Bereich des Mikroskops wird, wenn bei 100-facher Vergrößerung betrachtet.
3. Immunfluoreszenzanfärbung
- Zellpräparation
- Legen Sie eine sterile 18 mm Deckglas in eine 12-Well-Platte.
- 1 ml PBS des Deckglases abkühlen lassen und abspülen.
- Ersetzen mit 1 ml einer 10 ug / ml Vitronectin Lösung.
- Die Platte bei RT für mindestens 1 Stunde.
- Entsorgen Sie die Vitronectin - Lösung und Platte iPSCs in den Vitronectin beschichteten 12-Well - Platte und Kultur für 7 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2, täglich die Medienwechsel.
- Zellfärbung
- Entsorgen Sie die Kulturmedien und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
- Fixieren Sie die Zellen in 0,4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei RT.
- Permeabilisierung der Zellen mit 0,1% Triton X-100 für 5 min bei RT.
- Entfernen Sie die PermeabilisierungLösung und Block mit PBS 2% Rinderserumalbumin (BSA) für 30 min bei RT enthält.
- Verdünne die Antikörper in PBS , enthaltend 2% BSA gemäß Tabelle 1. Inkubieren der Zellen mit den primären Antikörpern für 2 h bei RT.
- Fügen Sie den sekundären Antikörper (1: 200 verdünnt) und Inkubation der Zellen für 1 h bei RT, Licht zu vermeiden.
- Behandeln Sie die Zellen mit 1 & mgr; l / ml DAPI für 10 min.
- Legen Sie das Deckglas auf dem Glasobjektträger mit Antifade-Reagenz und Inkubation bei RT für 24 h, Vermeidung von Licht.
- Stellen Sie sicher, Ausdruck mit einem Fluoreszenzmikroskop.
4. Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
- Extrahieren von mRNA aus dem Zellpellet unter Verwendung des Guanidinium - Thiocyanat-Phenol-Chloroform - Extraktionsverfahren 11.
- Amplify cDNA von 2 ug Gesamt - mRNA unter Verwendung der reversen Transkription 11.
- Mischen Sie die Komponenten für die PCR benötigten mit 2 ul cDNA temPlatte 11.
- Führen Sie RT-PCR und überprüfen Sie die Ergebnisse durch Gelelektrophorese 11.
5. Alkalische Phosphatase (AP) Staining
- Kultur iPSCs für 5-7 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2 vor der Färbung.
- Absaugen Medien und fixieren die Zellen mit 4% PFA für 1 min.
- Entsorgen Sie die Fixiermittel und spülen Sie die Zellen mit 1X Spülpuffer.
- Bereiten Sie die Reagenzien für die AP-Färbung. Mischen Sie die Reagenzien in folgendem Verhältnis: Fast Red Violet: Naphthol AS-BI-Phosphat-Lösung: Wasser = 2: 1: 1.
- Inkubieren der Zellen mit der Färbelösung bei RT für 15 min, leicht vermieden werden.
- Entsorgen Sie die Farblösung und spülen Sie die Zellen mit Spülpuffer.
- Decken Sie die Zellen mit PBS Austrocknen zu verhindern und sicherzustellen, Ausdruck einer Hellfeld-Mikroskop.
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Representative Results
In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll iPSCs von FLSS Verwendung eines lentiviralen System zu erzeugen. 1A zeigt ein einfaches Schema des FLS Isolierungsprotokoll. Verwendung von chirurgischen Scheren nach der chirurgischen Entfernung der Synovia wurde das Gewebe in kleine Stücke zerhackt. Kollagenase wurde zugegeben, um die Zellen aus den Gewebeklumpen zu isolieren. Die Zellen wurden für 14 Tage vor der weiteren Verarbeitung inkubiert. 1B zeigt die Morphologie des isolierten FLSS. Zellen wurden für 3 Passagen vor der Verwendung gehalten. FLSS teilen eine ähnliche Charakteristik mit allgemeinen Fibroblasten. Unsere isoliert FLSS ausgedrückt die fibrotische Marker, Vimentin und Fibronectin. Die isolierte RA FLSS zeigte auch geringe Expression des Makrophagen-ähnlichen synoviocyte Marker CD68 (Abbildung 1C).
FLSS wurden geerntet und transduziert mit Lentiviren, die 4 YamaNaka Faktoren für eine Neuprogrammierung. Nach Abspaltung der Zellen in verschiedenen Verhältnissen (D7), begann kleine Kolonien zu erscheinen. Sichtbare Kolonien, wie in 2A gezeigt ist , erschien bei D8-11. Kolonien können von diesem Punkt abgeholt werden. 2B zeigt ein Bild eines aufgenommenen und verstärkt Kolonie.
iPS-Zellen wurden bis Passage 5-10 expandiert und dann in verschiedenen Tests verwendet. Undifferenzierte WSR sind durch ein hohes Maß an AP gekennzeichnet. Die Zellen wurden für AP gefärbt, um die undifferenzierten Zustand zu bestätigen. RA-iPSCs ausgedrückt AP (2C), was sie undifferenziert sind. Pluripotenten Markerexpression wurde untersucht (Figur 2D, E). Die Expression von pluripotenten Marker wie Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28, DPPB5 und TDGF1 wurde unter Verwendung von RT-PCR (2D) bestätigt. Die Expression von Oct3 / 4 wurde Sox2 auch durch Immun ein bestätigtnalyse mit zusätzlichen Markern wie SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 und Klf4. TRA-1-60, die derzeit vermutlich die wichtigste iPSC Marker zu sein, wurde in unserem erzeugten iPS-Zellen stark exprimiert.
Zur weiteren Analyse führten wir karyotyping und Teratom-Assay. RA-iPSCs zeigte eine normale chromosomale Muster von 44 + XY (3A). 12 Wochen post Injektion von RA-iPSCs in SCID - Mäuse hatten Teratome gebildet und angezeigt verschiedenen Geweben, wie gland, Fettgewebe und Blutgefäße (3B). Die Keimschicht Differenzierung wurde auch durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Ektoderm Linie Zellen wurden für Otx2 positiv gefärbt. Mesodermalen Zellen exprimiert brachyury und endoderm wurde durch positive Färbung von SOX17 bestätigt.
Abbildung 1: Protocol für FLS Isolation von einem RA Patienten. (A) Ein einfaches Diagramm des Verfahrens zur synoviocyte Isolierung verwendet. (B) Morphologie der isolierten FLSS. (C) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von FLSS gefärbt mit fibrotischen Marker Vimentin, Fibronektin und Makrophagen-ähnlichen synoviocyte Marker CD68. Alle Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Erzeugung von iPS - Zellen aus FLSS von einem RA Patienten isoliert (A) Hellfeld - Bild eines iPSC Kolonie vor Kommissionierung.. (B) Bild einer Kolonie nach der Ernte. (C) Colony für AP gefärbt. (D) PCR - Analyse of pluripotenten Marker. (E) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von iPS - Zellen. Die erzeugten iPS-Zellen exprimiert alle pluripotenten Marker. Alle Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Karyotypanalyse und Teratoma Assay (A) mit hoher Auflösung G- mit einem Band versehenen Bilder normalen Karyogramme von iPS - Zellen zeigen.. Das Bild stellt ein 46XY normalen diploiden männlichen Chromosomengehalt. (B) Ergebnisse der teratoma Assays und Immunfluoreszenzanfärbung. Alle Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Vor der Entdeckung von iPS-Zellen, vor allem Wissenschaftler verwendeten WSR Stammzellbiologie und andere Zelllinien durch Differenzierung zu untersuchen. Allerdings stammen WSR von der inneren Masse eines Blastozyste, die eine im Frühstadium Embryo ist. WSR, Zerstörung der Blastozyste zu isolieren, ist unvermeidlich, die Erhöhung ethische Fragen, die zu überwinden sind unmöglich. Darüber hinaus, obwohl WSR stemness Eigenschaften und Pluripotenz haben, können sie nicht von Personen gewonnen werden und sind manchmal nicht ein ideales Werkzeug für die personalisierte Analyse und Krankheit Screening.
Im Jahr 2007 al Takahashi et. erzeugt iPSCs aus humanen Fibroblasten 2. Theoretisch, im Gegensatz zu WSR kann iPSCs von allen erwachsenen Körperzellen erzeugt werden. Mit diesem Vorteil sind gedacht iPSCs das ideale Werkzeug für die automatische Zelltransplantation zu sein. Auch mit dem Konzept der epigenetischen Speicher iPSCs sind gedacht die ideale Zellmaterial für die Simulation von Krankheitsbedingungen, dh. Krankheitsmodelle. Es wurden viele Studien verschiedene Arten von Zellen, wie Blutzellen, Urin Zellen und mehr durchgeführt werden. Dennoch gibt es viele Zelltypen, wie FLSS, in denen eine Anpassung nicht durchgeführt.
Arthritischen Erkrankungen sind wichtige Immunstörungen, die dauerhafte Behinderung führen kann. RA wird durch eine chronische Entzündung in den Gelenken verursacht, schließlich in Knochen und Knorpelschäden resultimg. Es ist schwer , den Schaden vor allem zu heilen oder umkehren , weil Knorpel in vivo nicht regenerieren kann. Daher regenerative Medizin mit iPS-Zellen sind ein neues wichtiges Werkzeug für die Heilung von RA. Der Knochen und Knorpelverlust wird auch in pannus Bildung geführt haben. Pannus ist eine hornähnliche Struktur, die im histologischen Bild des Gelenks zu sehen ist. Der Pannus wird von FLSS gemacht, die grenzenlos wie Krebszellen vermehren. Daher wird angenommen, dass die FLSS die pathologischen Merkmale der Erkrankung widerspiegeln. In dieser Studie haben wir Patienten FLSs iPSCs zu erzeugen.
FLSS sind der Hauptzelltyp, der an der Pathogenese der RA beitragen. Als eine Zelle, die meist auf die Entzündungs Umgebung innerhalb des Synovialgelenk ausgesetzt ist, dachte unserer Gruppe, dass sie als Material verwendet werden kann, dass der Krankheitszustand des Patienten widerspiegelt. Daher ist die früheste Umprogrammierung Methode haben wir versucht, RA-spezifische iPSCs von FLSS zu erzeugen, die Lieferung der 4 Yamanaka Verwendung Faktoren - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc - von Lentivirus. FLSS wurden von dem entfernten Synovium isoliert. Das Trimmen von Synovia war kritisch, wenn FLSS zu isolieren. Knochen und Fettrückstände können machen es komplizierter reine FLSS zu erhalten. Auch ist die Verwendung von Kollagenase unvermeidlich für FLS Isolation. Es ist wichtig, 3-8-Zellen zwischen den Passagen zu verwenden. Wenn FLSS Passage erreichen 3, der Faktor Yamanaka enthält Lentiviren werden nach dem Verfahren 11 erzeugt in unseren früheren Arbeiten erwähnt. Unter Verwendung der erzeugten LentivirenWir RA FLS abgeleitete iPSCs (RA-iPS-Zellen) erfolgreich generiert. Reine iPSC Klone wurden durch die Kolonie Kommissioniermethode erzeugt. Der RA-iPS-Zellen exprimiert alle pluripotenten Transkription Marker und hatte einen normalen Karyotyp. Weiterhin wurden die RA-iPSCs in allen drei Keimschichten zu differenzieren können nach dem Teratom-Assay. Außerdem haben wir bestätigt , dass die RA-iPSCs mehr Mineralisierung zeigten , wenn sie in osteogenen Abstammungslinien in vitro differenzierten (Daten nicht gezeigt) 11.
Es gibt jedoch einige Einschränkungen auf dieses Verfahren. Lentiviren erfordern genomische Integration für eine Neuprogrammierung. KLF-4 und c-Myc sind Onkogene und diese beiden Yamanaka Faktoren können das Tumorwachstum in vivo zu erleichtern. Daher kann es nicht ideal sein, diese Faktoren zu verwenden, Materialien für klinische Anwendungen zu erzeugen. Darüber hinaus sind FLSS und Fibroblasten der Haut nicht schwer, in Kliniken zu erhalten. Wie in verschiedenen Berichten erwähnt, Haut - Fibroblasten (dh Dermal Fibroblasten) kann nur durch Stanzbiopsien erhalten werden. FLSS kann nur durch eine invasive chirurgische Verfahren isoliert werden und diese Operation wird bei Patienten mit schwerer Hyperplasie durchgeführt, die sich einer Knieoperation unterzogen haben. Daher gibt es keine Notwendigkeit FLSS zu verwenden, wenn eine nicht-RA iPSC Neuprogrammierung. Zusätzlich sind die Verfahren, durch die Fibroblasten zur Umprogrammierung vorbereitet ist schwierig und zeitaufwendig. FLSS teilen die gleichen Mängel wie Fibroblasten der Haut. Daher Zellquellen, die einfacher zu handhaben und zu erhalten, sind erforderlich.
Aus diesem Grund haben Forscher nach einer alternativen Zellquelle zu suchen begonnen. Eine gegenwärtig verwendete Material ist Blutzellen. Es ist leicht, Blut zu zeichnen und die Isolationsprozess ist relativ einfach und schnell. Weiterhin gibt es eine Verschiebung von der Verwendung von Lentiviren zu Werkzeugen, die, wie beispielsweise Sendai virale Systeme, kleine Moleküle und episomalen Plasmiden nicht Genom-Integration erfordern.
Obwohl FLSS kann nicht verwendet werden, wieein Material für verschiedene Personen, es ist immer noch ein großartiges Material, wenn für Forschungszwecke RA-iPS-Zellen zu erzeugen. In Zukunft suchen wir einen RA Patienten FLS abgeleitete iPSC Bank zu generieren. RA-Patienten zeigen, individuell unterschiedlichen Reaktionen auf Medikamente, die zur Behandlung verwendet werden. Mit mehreren Linien von RA iPSCs, hoffen wir, eine Drogen-Screening-Zell-Bank für RA-Patienten zu erzeugen. Durch das Screening alle Medikamente auf jede Zelllinie, können wir in der Lage sein, um vorherzusagen, welche Arzneimittel auf die einzelnen Patienten zu arbeiten.
Abschließend beschreibt dieses Protokoll die Anwendung von iPS-Technologie Rheumatologie. Mit diesem Protokoll kann iPSCs von RA-Patienten stamm FLSS erzeugt werden und die erzeugten iPSCs haben die geforderten Eigenschaften. Diese iPS-Zellen können in der klinischen Forschung, Drug-Screening verwendet werden, Krankheitsmodelle und die regenerative Medizin für weitere Untersuchungen der Biologie von RA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
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