Summary
Nous décrivons ici un protocole destiné à générer des cellules souches pluripotentes humaines induites par les synoviocytes de type fibroblaste provenant de patients, en utilisant un système lentiviral sans cellules nourricières.
Abstract
cellules somatiques matures peuvent être inversées dans un état de cellules souches pluripotentes comme l'aide d'un ensemble défini de facteurs de reprogrammation. De nombreuses études ont généré induites-cellules souches pluripotentes (CISP) à partir de différents types de cellules somatiques par transduction quatre Yamanaka facteurs de transcription: Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc. L'étude des CSPi demeure à la fine pointe de la recherche biologique et clinique. En particulier, CSPi spécifiques au patient peuvent être utilisés comme un outil d'avant-garde pour l'étude de pathobiologie de la maladie, puisque CSPi peuvent être induites à partir du tissu de tout individu. La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique, classé par la destruction du cartilage et la structure de l'os dans l'articulation. hyperplasie synoviale est une des raisons majeures ou des symptômes qui conduisent à ces résultats dans la polyarthrite rhumatoïde. Synoviocytes fibroblast-like (SSLF) sont les principales cellules du composant dans la synoviale hyperplasique. FLSS dans l'articulation prolifèrent indéfiniment, finalement envahir le cartil adjacentl'âge et de l'os. À l'heure actuelle, la synoviale hyperplasique peut être enlevé que par une intervention chirurgicale. La membrane synoviale enlevée est utilisée pour la recherche RA comme un matériau qui reflète l'état inflammatoire de l'articulation. En tant qu'acteur majeur dans la pathogenèse de la PR, FLSS peut être utilisé comme un matériau pour générer et étudier les CSPi de patients atteints de PR. Dans cette étude, nous avons utilisé le FLSS d'un patient atteint de PR pour générer CSPi. En utilisant un système lentiviral, nous avons découvert que FLSS peut générer RA spécifique au patient iPSC. Les CSPi générées par FLSS peuvent encore être utilisés comme un outil pour étudier la physiopathologie de la PR dans le futur.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes sont la plate-forme de nouvelle génération dans divers domaines cliniques et biologiques. Ils sont un outil prometteur qui peut être utilisé dans la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et le traitement médical régénérateur. Humaines cellules souches embryonnaires (CSEh) ont été principalement utilisés pour étudier et comprendre les cellules pluripotentes. Cependant, isolé par la destruction du blastocyste humain, CSEh sont associés à plusieurs préoccupations éthiques. En 2007, le Dr Shinya Yamanaka et son équipe inversé le processus de programmation de la cellule et développé des cellules souches à partir de cellules somatiques adultes humaines 1,2. Par conséquent, contrairement à CSEh, induits-cellules souches pluripotentes (CISP) peuvent être générées à partir de cellules somatiques matures, en évitant les obstacles éthiques.
En règle générale, iPSCs sont générés par la fourniture de quatre gènes exogènes: Oct4, Sox2, Klf4, et c-Myc. Ces facteurs sont à l'origine Yamanaka livrés en utilisant des systèmes lentiviraux et rétroviraux. Les premiers CSPi ont été dérivées de la souris somatique caunes 3. Par la suite, la technique a été appliquée sur des fibroblastes dermiques humains 1,2. Des études ultérieures ont généré avec succès iPSCs provenant de diverses sources, telles que l' urine 4, le sang 5,6 kératinocytes 7 et plusieurs autres types de cellules. Cependant, il y a des cellules somatiques qui ne sont pas utilisés dans la reprogrammation et le dépistage des capacités de reprogrammation de différents types de tissus spécifiques dans l'état de la maladie de cellules, est encore nécessaire.
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie qui peut frapper toutes les articulations et entraîner des maladies auto-immunes dans d'autres organes. La polyarthrite rhumatoïde touche environ 1% des adultes dans le monde développé. Il est une maladie assez courante et son incidence augmente chaque année 8. Cependant, RA est difficile d'identifier dans les premiers stades et oncebone destruction se produit il n'y a pas de traitement qui peut récupérer les dommages. De plus, l'efficacité du médicament diffère d'un patient à, et il est difficile de prédire le médecinine qui est nécessaire. Par conséquent, la mise au point d'une méthode de dépistage de drogue est nécessaire, et un matériau cellulaire qui peut refléter les conditions de la polyarthrite rhumatoïde est nécessaire.
Synoviocytes fibroblast-like (SSLF) sont un participant cellulaire actif dans la pathogenèse de la PR 9,10. FLSS existent dans la paroi de l'intima synoviale entre la capsule et la cavité articulaire, qui est également désigné sous le nom synoviale. En soutenant la structure commune et fournissant des éléments nutritifs au cartilage environnant, FLSS jouent généralement un rôle crucial dans la fonction articulaire et la maintenance. Cependant, FLSS dans la PR ont un phénotype invasif. RA FLSS ont un phénotype de cancer comme, éventuellement détruire l'os environnant par une prolifération infinie 10. Grâce à cette caractéristique unique FLSS peut être utilisé en tant que matériau prometteur qui peut refléter la pathobiologie de la polyarthrite rhumatoïde. Cependant, ces cellules sont rarement réalisées, ainsi que les phénotypes cellulaires modifient que les cellules passent par plusieurs passages in vitro
Théoriquement, RA CSPi patient dérivé (RA-CSPi) peuvent devenir un outil idéal pour le dépistage de drogues et d'autres recherches. CSPi générées ont l' auto-renouvellement et la capacité peuvent être maintenues et développées in vitro. Avec pluripotence, ces cellules peuvent être différenciées en chondrocytes et ostéocytes lignées matures, qui peuvent contribuer matériel cellulaire pour la recherche spécifique dans la polyarthrite rhumatoïde et d' autres maladies liées à l' os 11.
Dans cette étude, nous montrons comment isoler et développer FLSS d'un synoviale enlevé chirurgicalement, et comment générer RA-CSPi de FLSS utilisant des lentivirus contenant des facteurs Yamanaka.
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Protocol
Déclaration éthique: Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC12TISI0861).
1. synoviocytes Isolement et expansion
- synoviocytes Isolation
- Stériliser deux paires de ciseaux chirurgicaux et une paire de pinces.
- Transférer le tissu synovial à 100 mm plat et on lave avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1% de pénicilline / streptomycine.
- Coupez les résidus jaunâtres de tissu adipeux et des os. Transférer le tissu coupé à un puits d'une plaque à 6 puits et on ajoute 5 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 20% de sérum bovin fœtal (FBS).
- Hacher les tissus avec des ciseaux jusqu'à ce que les pièces sont suffisamment petites pour pénétrer dans une pipette jetable.
- Transférer le support du tissu contenant un tube conique de 50 ml. Récolter la matière restante en ajoutant 5 ml de DMEM avec 20% de FBS à la plaque de 6 puits, puis les transférer dans le tube. </ Li>
- collagénase Thaw sur la glace. Ajouter la collagénase à une concentration finale de 0,01% et sceller le tube avec du parafilm. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C sous agitation pendant 4 heures.
- Après incubation, remplir le tube avec du DMEM avec 20% de FBS jusqu'à ce que le volume total soit de 50 ml et centrifuger à 300 x g, RT pendant 10 min.
- Retirer le surnageant sans perturber le culot et ajouter 40 ml de médias pour remettre le culot.
- Répétez les étapes 1.1.10-1.1.11.
- Reprendre le culot dans 25 ml de DMEM avec 20% de FBS et d'attendre les grosses touffes de tissu à couler au fond.
- Transférer le surnageant dans une boîte de 100 mm et incuber à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 14 jours.
- Synoviocytes Maintenance et extension
- Jeter les médias utilisés à partir de la plaque et laver les cellules avec 5 ml de PBS.
- Ajouter 1 ml de PBS / EDTA 1 mM et on incube à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 2 min.
- Appuyez sur le plat en douceur et transfer les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 250 x g, température ambiante pendant 2 min.
- Retirer le surnageant sans perturber le culot et resuspendre le culot dans 30 ml de DMEM avec 20% de FBS.
- Transférer les cellules à 3 x 100 mm plats, sans laisser de matériau restant visible.
- Remplacez le support avec un milieu frais tous les 3 d. Fractionner les cellules à 80% de confluence en utilisant 1 ml de PBS / EDTA 1 mM. Maintenir jusqu'au passage 3 avant utilisation. Divisez chaque plat de cellules en 3 plats dans chaque division.
NOTE: Après avoir atteint le passage 3, les cellules qui ne vont pas être utilisés immédiatement peuvent être congelés.
2. Reprogrammation FLSS Utilisation de lentivirus codant pour les facteurs Yamanaka
- Transduction (D0)
- Graines 3 × 10 4 cellules par puits d'une plaque à 6 puits dans un milieu de croissance (500 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine). Incuber les cellules O / N à 37 ° C dans 5% de CO2.
- Le lendemain, retirer un flacon de lentivirus contenant 4 Yamanaka facteurs: Oct4, Klf4, Sox2 et c-Myc du congélateur et décongeler à 4 ° C. Note: lentivirus a été produit par la procédure décrite dans notre précédente étude 11.
- Bien que la décongélation du virus, changer les médias aux médias de croissance FLS (20% de FBS, plus des antibiotiques dans DMEM) contenant 10 pg / ml de bromure de hexadimethrine et 50 pg / ml d'acide ascorbique.
- Après avoir changé les médias, ajouter 30 pl de lentivirus aux cellules et mélanger doucement. Pour améliorer l'infection, centrifuger la plaque à 680 xg, 35 ° C pendant 30 min.
- Après centrifugation, incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO2.
- Maintenance Jusqu'à Reprogrammation est visible
- Pour le jour 3, remplacer les médias quotidiens avec les médias de croissance FLS contenant 0,1 mM de butyrate de sodium et 50 pg / ml d'acide ascorbique.
- Le lendemain, remplacer les médias avec un mélange de milieux de croissance et FLSCOPSi support (1: 1 rapport) contenant 0,1 mM de butyrate de sodium et 50 pg / ml d'acide ascorbique.
Remarque: Les composants des médias iPSC est donnée dans la liste des matériaux / équipement.
- Cellules Fractionnement pour la Formation Colony
- Préparer une plaque à 6 puits vitronectine revêtu.
- Ajouter 60 ul de vitronectine à 6 ml de PBS sans Ca 2+ et Mg 2+. Mettez 2 ml de mélange dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h. Remarque: La concentration de travail de la vitronectine est de 5 ug / ml.
- Le D5, laver les cellules avec du PBS.
- Ajouter 1 ml de PBS / 1 mM d' EDTA pour détacher les cellules et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 2 min.
- Récolter les cellules et centrifuger à 250 x g, température ambiante pendant 2 min.
- Fractionner les cellules à 3 rapports différents (1: 3, 1: 6 et 1: 9) pour obtenir différents confluencies. Ajouter 900 ul de milieu pour le culot cellulaire et remettre en suspension. Ajouter 300, 150, et 100 pl du mélange de cellules par puits d'une 6-Plaque puits pour parvenir à un rapport de 1: 3, 1: 6 et 1: 9, respectivement.
- Remplacer les médias tous les jours avec les médias iPSC jusqu'à ce que les colonies apparaissent. Colonies apparaîtront après environ D18. Remarque: A ce stade, les colonies iPSC coexistent avec le SSLF non reprogrammée.
- Préparer une plaque à 6 puits vitronectine revêtu.
- Colony picking
- Préparer une plaque de vitronectine revêtue de 48 puits par addition de 500 ul de la vitronectine aux puits et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
- Placez le microscope sur un banc propre, et retirer la plaque de 6 puits de l'incubateur.
- Retirer la solution de vitronectine de la plaque de 48 puits et ajouter 500 médias iPSC ul supplémenté avec 10 mM Rho-associé, superhélice contenant de la protéine kinase (ROCK) inhibiteur.
- En utilisant une pointe de pipette 10p, couper autour de la colonie. Transférez la colonie choisi pour un puits de la plaque de 48 puits.
- Après la cueillette de plusieurs colonies, incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Maintenir les cellules jusqu'à ce que les colonies sont grandes enough pour le transfert. Note: Nous avons l'habitude déversé les cellules lorsque la colonie sort du champ visible du microscope, lorsqu'on regarde au grossissement 100X.
3. immunofluorescence
- Préparation cellulaire
- Placez un 18 mm couvercle en verre stérile dans une plaque de 12 puits.
- Ajouter 1 ml de PBS pour refroidir et rincer le verre de protection.
- Remplacer par 1 ml d'une / ml de vitronectine solution à 10 pg.
- Incuber la plaque à température ambiante pendant au moins 1 h.
- Jeter la solution de vitronectine et CSPi de plaque dans la plaque de 12 puits vitronectine enduit et de la culture pendant 7 jours à 37 ° C, 5% de CO 2, en changeant les médias tous les jours.
- cellule coloration
- Jeter les milieux de culture et laver les cellules avec du PBS une fois.
- Fixer les cellules dans 0,4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 30 min à température ambiante.
- Perméabiliser les cellules avec 0,1% de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante.
- Retirez le perméabilisationla solution et le bloc avec du PBS contenant 2% d'albumine de sérum bovin (BSA) pendant 30 min à température ambiante.
- Diluer les anticorps dans du PBS contenant du BSA à 2% selon le Tableau 1. Incuber les cellules avec les anticorps primaires pendant 2 heures à température ambiante.
- Ajouter l'anticorps secondaire (dilution 1: 200) et on incube les cellules pendant 1 heure à température ambiante, en évitant la lumière.
- Traiter les cellules avec 1 pl / ml de DAPI pendant 10 min.
- Placer le couvercle en verre sur le dessus de la lame de verre avec antifade réactif et incuber à température ambiante pendant 24 heures, en évitant la lumière.
- Vérifier l'expression d'un microscope à fluorescence.
4. temps réel Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
- Extraire l' ARNm à partir du culot cellulaire en utilisant le thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme , la méthode d'extraction 11.
- Amplifier ADNc à partir de 2 pg d'ARNm totaux en utilisant la transcription inverse 11.
- Mélanger les composants nécessaires pour la PCR en utilisant 2 pi d'ADNc de systèmeplaque 11.
- Effectuer RT-PCR et de vérifier les résultats par électrophorèse sur gel 11.
5. phosphatase alcaline (AP) Coloration
- IPSCs de culture pendant 5-7 jours à 37 ° C, 5% de CO 2 avant la coloration.
- Aspirer les médias et fixer les cellules avec 4% de PFA pendant 1 min.
- Jeter le fixateur et rincer les cellules avec le tampon de rinçage 1X.
- Préparer les réactifs pour AP coloration. Mélanger les réactifs dans le rapport suivant: Fast Red Violet: solution de phosphate de naphtol AS-BI: eau = 2: 1: 1.
- Incuber les cellules avec la solution de coloration à la température ambiante pendant 15 minutes, en évitant la lumière.
- Jeter la solution de coloration et de rinçage des cellules avec un tampon de rinçage.
- Couvrir les cellules avec du PBS pour éviter le dessèchement et vérifier l'expression en utilisant un microscope à champ clair.
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Representative Results
Dans cette étude, nous décrivons un protocole pour générer CSPi de FLSS en utilisant un système lentiviral. La figure 1A montre un schéma simple du protocole d'isolement FLS. À la suite de l'ablation chirurgicale de la synovie, le tissu a été haché en petits morceaux avec des ciseaux chirurgicaux. Collagénase a été ajouté à isoler les cellules à partir des amas de tissu. Les cellules ont été mises en incubation pendant 14 jours avant le traitement ultérieur. La Figure 1B montre la morphologie de l'isolement FLSS. Les cellules ont été maintenues pendant 3 passages avant de l'utiliser. FLSS partagent une caractéristique similaire avec des fibroblastes généraux. Notre isolé FLSS exprimé les marqueurs fibrotiques, vimentine et fibronectine. L'isolement RA FLSS a également montré une faible expression du synoviocytes marqueur de type macrophage, CD68 (figure 1C).
FLSS ont été récoltées et transduction avec lentivirus contenant 4 Yamanaka facteurs de reprogrammation. Après avoir partagé les cellules à différents rapports (D7), les petites colonies ont commencé à apparaître. Colonies visibles, comme le montre la figure 2A, sont apparus à D8-11. Les colonies peuvent être récupérés à partir de ce point. La figure 2B montre une image d'une colonie ramassé et amplifié.
CSPi ont été étendus jusqu'à ce passage 5-10, puis utilisés dans divers essais. CES indifférenciées sont caractérisés par un niveau élevé de AP. Les cellules ont été colorées pour AP pour confirmer l'état indifférencié. RA-CSPi exprimé AP (figure 2C), ce qui indique qu'ils sont indifférenciées. L' expression des marqueurs pluripotentes a été examiné (figure 2D, E). L'expression des marqueurs tels que pluripotentes Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28, et DPPB5 TDGF1 a été confirmée par RT-PCR (figure 2D). L'expression de la Oct3 / 4, Sox2 a également été confirmée par une immunofluorescencenalyse avec des marqueurs supplémentaires tels que SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 et Klf4. TRA-1-60, qui est actuellement considéré comme le marqueur le plus important iPSC, a été fortement exprimé dans nos CSPi générées.
Pour une analyse plus approfondie, nous avons réalisé un caryotype et le dosage de tératome. RA-CSPi ont montré un modèle chromosomique normal de 44 + XY (figure 3A). 12 semaines post injection de RA-CSPi à des souris SCID, tératomes avait formé et affiché divers tissus, tels que la glande, le tissu adipeux et les vaisseaux sanguins (figure 3B). La différenciation de la couche de germe a également été confirmée par immunofluorescence. les cellules de la lignée Ectoderm étaient positivement colorées pour Otx2. cellules mésodermiques exprimé brachyury, et l'endoderme a été confirmée par une coloration positive de Sox17.
Figure 1: Protocol pour FLS Isolement à partir d' un patient de RA. (A) Un schéma simple de la méthode utilisée pour l' isolement de synoviocytes. (B) Morphologie isolé FLSS. (C) Fluorescence microscopie image de FLSS colorées avec des marqueurs fibrotique vimentine, fibronectine et un synoviocytes marqueur de macrophage, CD68. Toutes les barres d'échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Génération de CSPi de FLSS isolées d'un patient de RA image (A) Bright-champ d'une colonie iPSC avant la cueillette.. (B) l' image d'une colonie après la cueillette. (C) Colony colorée pour AP. (D) PCR analyse omarqueurs pluripotentes f. (E) Fluorescence microscopie image de CSPi. Les CSPi générées ont exprimé tous les marqueurs pluripotentes. Toutes les barres d'échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: caryotype Analyse et Teratoma Assay (A) à haute résolution G bagués images montrant Caryogamies normales de CSPi.. L'image représente un contenu chromosomique diploïde mâle normal 46XY. (B) Les résultats des essais de tératome et immunofluorescence. Toutes les barres d'échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Avant la découverte de CSPi, les scientifiques ont utilisé principalement les CES pour étudier la biologie des cellules souches et d'autres lignées cellulaires grâce à la différenciation. Cependant, les CES proviennent de la masse interne d'un blastocyste, qui est un embryon à un stade précoce. Pour isoler les CES, la destruction du blastocyste est inévitable, ce qui soulève des questions éthiques qui sont impossibles à surmonter. En outre, bien que les CES ont des caractéristiques stemness et pluripotence, ils ne peuvent pas être obtenus à partir de personnes et sont parfois pas un outil idéal pour l'analyse personnalisée et le dépistage des maladies.
En 2007, Takahashi et al. CSPi générées à partir de fibroblastes humains 2. Théoriquement, contrairement à CES, CSPi peuvent être générés à partir des cellules somatiques adultes. Avec cet avantage, CSPi sont pensés pour être l'outil idéal pour la transplantation auto-cellule. En outre, avec le concept de mémoire épigénétique, iPSCs sont considérés comme matériau cellulaire idéal pour la simulation des conditions pathogènes, à savoir. Modélisation de la maladie. Il y a eu de nombreuses études effectuées en utilisant divers types de cellules telles que des cellules sanguines, des cellules d'urine et autres. Pourtant, il existe de nombreux types de cellules, comme FLSS, dans lequel la reprogrammation n'a pas été menée.
Les maladies arthritiques sont des troubles immunitaires majeurs qui peuvent causer une invalidité permanente. RA est causée par une inflammation chronique des articulations, éventuellement resultimg dans les os et le cartilage endommagé. Il est difficile de guérir ou inverser les dommages en particulier parce que le cartilage ne peut pas régénérer in vivo. Par conséquent, la médecine utilisant CSPi régénératrices sont un nouvel outil essentiel pour le traitement de la PR. L'os et le cartilage de perte est également conduit à la formation de pannus. Pannus est une structure en forme de corne qui peut être vu dans l'image histologique de l'articulation. Le pannus est faite par FLSS qui prolifèrent limitlessly comme les cellules cancéreuses. Par conséquent, on pense que le FLSS peut refléter les caractéristiques pathologiques de la maladie. Dans cette étude, nous avons utilisé le patient FLSs pour générer CSPi.
FLSS sont les principaux types de cellules qui contribuent à la pathogenèse de la PR. Comme une cellule qui est essentiellement exposé à l'environnement inflammatoire dans l'articulation synoviale, notre groupe a pensé qu'il peut être utilisé comme un matériau qui reflète l'état de la maladie du patient. Par conséquent, en utilisant la méthode de reprogrammation plus tôt, nous avons tenté de générer des CSPi spécifiques à la PR de FLSS, en utilisant la livraison du 4 Yamanaka facteurs - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 et c-Myc - par lentivirus. FLSS ont été isolés à partir de la synovie enlevé. La coupe de la synoviale était critique lors de l'isolation FLSS. résidus d'os et de graisse peut rendre plus compliqué à obtenir pur FLSS. En outre, l'utilisation de la collagénase est inévitable pour l'isolement du SEF. Il est important d'utiliser des cellules entre les passages 3-8. Lorsque FLSS atteignent passage 3, le facteur Yamanaka contenant les lentivirus sont générés en suivant la procédure mentionnée dans nos travaux antérieurs 11. En utilisant les produits lentivirus, Nous avons généré avec succès CSPi RA FLS-dérivés (RA-CSPi). Les clones purs iPSC ont été générés par la méthode des colonies de prélèvement. Le RA-CSPi exprimé tous les marqueurs de transcription pluripotentes et avait un caryotype normal. En outre, les RA-CSPi ont pu se différencier en tous les trois couches germinales selon le dosage de tératome. En outre, nous avons confirmé que les RA-CSPi ont montré plus d'une minéralisation quand différenciées en lignées ostéogéniques in vitro (données non présentées) 11.
Cependant, il y a des limites à cette méthode. Les lentivirus exigent l'intégration génomique pour la reprogrammation. KLF-4 et c-Myc sont oncogènes et ces deux facteurs Yamanaka peuvent faciliter la croissance tumorale in vivo. Par conséquent, il peut ne pas être optimal pour utiliser ces facteurs pour produire des matériaux pour des applications cliniques. En outre, FLSS et des fibroblastes de peau ne sont pas difficiles à obtenir dans les cliniques. Comme mentionné dans divers rapports, les fibroblastes de la peau (c. -à- dermal fibroblastes) ne peuvent être obtenues par des biopsies poinçonnées. FLSS peut être isolé que par une intervention chirurgicale invasive et cette chirurgie est effectuée sur des patients atteints d'hyperplasie sévère qui ont subi une intervention chirurgicale au genou. Par conséquent, il n'y a pas besoin d'utiliser FLSS lors de la reprogrammation d'un non-RA iPSC. En outre, le processus par lequel les fibroblastes sont préparés pour une reprogrammation est difficile et prend du temps. FLSS partagent les mêmes défauts que les fibroblastes de la peau. Par conséquent, les sources de cellules qui sont plus faciles à manipuler et obtiennent sont nécessaires.
Pour cette raison, les chercheurs ont commencé à chercher une source de cellules de remplacement. Un matériau couramment utilisé est constitué de cellules sanguines. Il est facile de prélever du sang et le processus d'isolement est relativement simple et rapide. En outre, il y a un changement de l'utilisation de lentivirus à des outils qui ne nécessitent pas l'intégration du génome, tels que les systèmes viraux Sendai, de petites molécules et des plasmides épisomiques.
Bien que FLSS ne peut pas être utilisé en tant queun matériau pour divers individus, il est encore un grand matériel lors de la génération RA-CSPi à des fins de recherche. À l'avenir, nous cherchons à générer une banque iPSC RA patients FLS dérivés. patients atteints de PR montrent individuellement diverses réactions aux médicaments qui sont utilisés pour le traitement. Avec plusieurs lignes de RA CSPi, nous espérons générer une cellule-banque de drogue dépistage des patients atteints de PR. En criblant tous les médicaments sur chaque lignée cellulaire, nous pouvons être en mesure de prédire quel médicament fonctionnera sur lequel chaque patient.
En conclusion, ce protocole décrit l'application de la technologie iPSC à rhumatologique. Avec ce protocole, CSPi peuvent être générés par FLSS RA patients dérivés, et les CSPi générées ont les caractéristiques requises. Ces CSPi peuvent être utilisés dans la recherche clinique, le dépistage des drogues, la modélisation des maladies, et la médecine régénérative pour d'autres recherches sur la biologie de la PR.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
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