Summary
Burada besleyici hücreler olmadan lentiviral sistemi kullanılarak, hastaya türetilmiş fibroblast benzeri sinoviyositler insan kaynaklı-pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.
Abstract
Olgun somatik hücre yeniden programlama faktörleri tanımlanmış bir dizi kullanarak pluripotent kök hücre benzeri duruma ters çevrilebilir. Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc: Çeşitli çalışmalar, dört Yamanaka transkripsiyon faktörlerini transducing çeşitli somatik hücre tiplerinden kaynaklı-pluripotent kök hücreleri (iPSCs) yarattı. iPSCs çalışma, biyolojik ve klinik araştırmaların kesme kenarında kalır. iPSCs herhangi bir bireyin dokusundan indüklenebilir yana Özellikle, hastaya özel iPSCs, hastalık patobiyolojisi çalışma için öncü bir araç olarak kullanılabilir. Romatoid artrit (RA) eklem kıkırdak ve kemik yapısının bozulmasına sınıflandırılan kronik bir enflamatuar hastalığıdır. Sinovyal hiperplazi RA'da bu sonuçlara yol önemli nedenlerinden veya belirtilerden biridir. Fibroblast benzeri sinoviyositler (FLSs) hiperplastik sinovyumda ana bileşeni hücrelerdir. eklemde FLSs limitlessly sonunda komşu cartil işgal prolifereyaş ve kemik. Şu anda, hiperplastik sinovyum, sadece cerrahi bir prosedür ile çıkarılabilir. Kaldırılan sinovya ortak inflamatuar durumunu yansıtan bir malzeme olarak RA araştırma için kullanılmıştır. RA patogenezinde önemli bir oyuncu olarak, FLSs oluşturmak ve RA hastalarının iPSCs araştırmak için bir malzeme olarak kullanılabilir. Bu çalışmada, iPSCs oluşturmak için bir RA hastanın FLSs kullanılır. lentiviral sistemi kullanarak, FLSs RA hastaya özgü IPSC oluşturabilir keşfetti. FLSs oluşturulan iPSCs gelecekte daha da RA patofizyolojisinin incelemek için bir araç olarak kullanılabilir.
Introduction
Pluripotent kök hücreler çeşitli klinik ve biyolojik alanlarda yeni nesil platform vardır. Bu hastalığın modelleme, ilaç tarama, ve rejeneratif tıbbi tedavide kullanılabilir gelecek vaat eden bir araçtır. İnsan Embriyonik Kök Hücreler (hESC) esas çalışma ve pluripotent hücreler anlamak için kullanıldı. Bununla birlikte, insan blastosist imha ile izole edilmiş, HESC çok etik kaygılar ile ilişkilidir. 2007 yılında, Dr. Shinya Yamanaka ve ekibi hücre programlama sürecini tersine insan yetişkin somatik hücre 1,2 kök hücre geliştirdi. Bu nedenle, HESC farklı olarak, indüklenen-kök hücreleri (iPSCs) etik engel kaçınarak olgun somatik hücrelerinden üretilebilir.
Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc: Genellikle, iPSCs dört ekzojen genlerin verilmesi ile elde edilir. Bunlar Yamanaka faktörleri aslında lentiviral ve retroviral sistemler kullanılarak teslim edilir. İlk iPSCs fare somatik C elde edilmiştirarşın 3. Daha sonra, bu teknik, insan dermal fibroblastlarında 1,2 uygulanmıştır. Daha sonraki çalışmalar başarıyla idrar 4 kan 5,6 gibi çeşitli kaynaklardan iPSCs üretilen 7 keratinositler, ve çeşitli diğer hücre türleri. Bununla birlikte, bazı somatik yeniden programlama kullanılan edilmemiş hücreler ve hastalık durumunda özel dokularda çeşitli hücre tiplerinin yeniden programlama yetenekleri tarama vardır hala gereklidir.
Romatoid artrit (RA), tüm eklemleri grev ve diğer organlarda otoimmün koşullara yol açabilecek bir hastalıktır. RA gelişmiş dünyada erişkinlerin yaklaşık% 1'ini etkiler. Bu oldukça yaygın bir hastalıktır ve görülme sıklığı her yıl 8 artar. Ancak, RA erken evrelerde tespit etmek zordur ve yıkım oncebone zarar kurtarabilirsiniz hiçbir tedavi yoktur oluşur. Ayrıca, ilacın yararını hastadan hastaya farklılık gösterir ve Medic tahmin etmek zorgereklidir ine. Bu nedenle, bir ilaç-tarama yönteminin geliştirilmesi gereklidir ve RA şartlarını yansıtacak bir hücre malzeme gereklidir.
Fibroblast benzeri sinoviyosit (FLSs) RA 9,10 patogenezinde aktif bir hücresel katılımcı vardır. FLSs de sinovyumdaki olarak adlandırılır eklem kapsülü ve oyuk arasındaki eklem iç yüzeyi bulunmaktadır. eklem yapısını destekleyen ve çevreleyen kıkırdak besinleri sağlayarak, FLSs genellikle eklem fonksiyon ve bakım önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, RA'da FLSs invaziv bir fenotip var. RA FLSs sonunda sonsuz çoğalması 10 çevreleyen kemik yok, bir kanser gibi fenotip vardır. Bu eşsiz özelliği ile FLSs RA patobiyolojisi yansıtabilir umut verici bir madde olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu hücreler nadiren üretilir, ve hücreler, in vitro çok geçitler geçmesi gibi hücre fenotipleri değiştirebilir
Teorik olarak, RA hasta kaynaklı iPSCs (RA-iPSCs) ilaç tarama ve ileri araştırmalar için ideal bir araç haline gelebilir. Oluşturulan iPSCs kendini yenileme yeteneğine sahip ve tutulan ve in vitro genişletilebilir. Pluripotensin, bu hücreler, RA ve diğer kemik ile ilgili hastalıklar 11 özel araştırma için hücre materyalini katkıda olgun kondrosit ve osteosit soy, ayırt edilebilir.
Bu çalışmada, biz izole etmek ve Yamanaka faktörleri içeren lentiviruses kullanarak FLSs RA-iPSCs oluşturmak için bir ameliyatla çıkarıldı sinovyum ve nasıl dan FLSs genişletmek için nasıl gösterilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Bu çalışma protokolü Kore Katolik Üniversitesi (KC12TISI0861) kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Sinoviyosit İzolasyon ve Genişleme
- sinoviyosit İzolasyon
- cerrahi makas iki çift ve forseps bir çift sterilize edin.
- 100 mm çanak sinoviyal doku transferi ve% 1 penisilin / streptomisin içeren fosfat tamponlu tuz, 5 ml (PBS) ile yıkanır.
- sarımsı yağ dokusu ve kemik kalıntılarını kesti. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı içinde% 20 Fetal büyükbaş hayvan serumu (DMEM) (FBS) 5 ml 6 yuvalı bir plaka iyi kesilmiş doku transferi ekleyin.
- adet tek kullanımlık pipet nüfuz kadar küçük olana kadar makas ile dokuları doğrayın.
- 50 ml'lik bir konik tüp doku içeren medya aktarın. 6-çukurlu plaka% 20 FBS ile 5 ml DMEM ilave edilerek kalan malzemenin Hasat ve tüpe aktarın. </ Li>
- buz üzerinde Çözülme kollajenaz. % 0.01'lik bir nihai konsantrasyona kadar kolajenaz ekleyin ve parafilm ile tüp mühür. 4 saat çalkalanarak 37 ° C'de bir su banyosu içinde inkübe edin.
- Toplam hacim, 10 dakika boyunca 300 x g'de 50 ml ve santrifüj RT kadar inkübe edildikten sonra,% 20 FBS DMEM ile tüp doldurun.
- pelet bozmadan Süpernatantı ve pelet tekrar süspansiyon medya 40 ml ekleyin.
- Yineleyin 1.1.10-1.1.11 adımları.
- % 20 FBS DMEM, 25 ml pelet yeniden süspanse edin ve dibe çökmesi için doku büyük topaklar bekleyin.
- 100 mm tabak süpernatantı aktarın ve 14 gün için% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
- Sinoviyosit Bakım ve Genişletme
- plaka kullanılan ortam atın ve 5 ml PBS ile yıkama hücreleri.
- 1 ml PBS / 1 mM EDTA ekleyin ve 2 dakika için% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
- yavaşça çanak ve transfe dokununR 15 ml konik bir tüp hücre. 2 dakika boyunca 250 xg'de RT hücreleri santrifüjleyin.
- Pelet bozmadan süpernatantı ve% 20 FBS ile DMEM, 30 ml pelletini.
- görünür bir artık materyal bırakmadan, 3 x 100 mm yemekleri hücreleri aktarmak.
- taze medya her 3 d ile değiştirin. 1 ml PBS / 1 mM EDTA kullanılarak% 80 birleşme hücreleri Böl. Kullanmadan önce geçiş 3 kadar koruyun. Her bölünmüş 3 yemeklerin içine hücrelerin her yemeğin bölün.
NOT: geçit 3 ulaştıktan sonra, hemen kullanılmalıdır gidiş değildir hücreler dondurularak muhafaza edilebilir.
Lentiviruses kodlayan Yamanaka Faktörler kullanma 2. yeniden programlanması FLSs
- İletimi (D0)
- Büyüme ortamı içinde bir 6-yuvalı plaka oyuk başına tohum 3 x 10 4 hücreleri (DMEM 500 mi,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş). % 5 CO, 37 ° C'de hücreler O / N inkübe2.
- 4 ° C'de derin dondurucu ve çözülme ile ilgili Oct4, Klf4 Sox2 ve c-Myc: Ertesi gün, 4 Yamanaka faktörleri içeren lentivirüs bir vial çıkarın. Not: lentivirüs önceki çalışmamızda 11'de tarif edilen prosedüre göre hazırlanır.
- virüs cozundururken, 10 ug / ml heksadimetrin bromür ve 50 ug / ml askorbik asit ihtiva eden (DMEM içinde% 20 FBS artı antibiyotikler) FLS büyüme ortamında bir ortam.
- medya değiştirdikten sonra, hücrelere lentivirüs 30 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın. enfeksiyon geliştirmek için, 680 x g'de, 30 dakika süre ile 35 ° C 'de plaka santrifüj.
- Santrifüj işleminden sonra,% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- Yeniden programlanması kadar bakım Görünür olduğunu
- 3 gün için, 0.1 mM sodyum bütirat ve 50 ug / ml askorbik asit içeren FLS büyüme ortamı ile günlük olarak ortamı değiştirin.
- Sonraki gün, FLS büyüme ortamı içeren bir karışım ile değiştirin ve0.1 mM sodyum bütirat ve 50 ug / ml askorbik asit içeren (1 oranında 1) iPSC ortam.
Not: iPSC ortamının bileşenleri malzemeleri / ekipman listesi verilmiştir.
- Koloni Formasyonu için Yarma Hücreleri
- Bir vitronektin kaplı 6 oyuklu plaka hazırlanması.
- Ca 2+ ve Mg 2+ olmadan 6 ml PBS 60 ul vitronektini ekleyin. Her bir kuyu, karışımın 2 ml koyun ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe. Not: vitronektin çalışma konsantrasyonu 5 ug / mL'dir.
- D5, hücrelerin PBS ile yıkayın.
- Hücreleri ayırmak ve 2 dakika için 37 ° C,% 5 CO2 inkübe 1 ml PBS / 1 mM EDTA.
- 2 dakika boyunca 250 xg'de RT hücreleri ve santrifüj hasat edilir.
- (9: 3, 1: 6 ve 1: 1), farklı confluencies elde etmek için, 3 farklı oranlarda hücreleri Böl. Hücre pelet ve tekrar süspansiyon Medyanın 900 ul ekleyin. Bir 6- oyuk başına hücre karışımı 300, 150, ve 100 ul eklesırasıyla 9: 3, 1: 6 ve 1 oyuklu plaka 1 oranının elde edilmesi için.
- koloniler görünene kadar iPSC medya ile günlük medya değiştirin. Koloniler hakkında D18 sonra görünecektir. Not: Bu aşamada, iPSC koloniler olmayan yeniden programlanması FLSs ile birlikte bulunmaktadır.
- Bir vitronektin kaplı 6 oyuklu plaka hazırlanması.
- koloni toplama
- oyuklara 500 ul vitronektin ekleyerek 48 oyuklu vitronektin kaplı plaka hazırlanması ve en az 1 saat süre ile oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Temiz bir bankta mikroskop yerleştirin ve inkübatör 6-plaka çıkarın.
- 48 oyuklu plaka vitronektin çözüm çıkarın ve 10 mM Rho-bağlantılı sarmal bobin ihtiva eden bir protein kinaz (rock) inhibitörü ile takviye edilmiş 500 ul iPSC ortamı eklenir.
- Bir 10p pipet kullanarak, koloni çevresinde kesti. 48 oyuklu plakanın bir oyuğuna aldı koloni aktarın.
- Birkaç koloniler seçmek sonra, 37 ° C,% 5 CO 2 inkübe hücreleri.
- koloniler büyük eno kadar hücreleri korumakUh transferini. Not: koloni 100X büyütmede inceledi mikroskop görünür alanının, dışarı çıktığında genellikle hücrelerin döktü.
3. İmmünofloresan Boyama
- Hücre hazırlanması
- 12 oyuklu bir plakaya steril 18 mm kapak camı.
- serin ve cam kapak durulama PBS 1 ml ekleyin.
- 10 ug / ml, vitronektin çözeltinin 1 ml'si ile değiştirin.
- en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe plakası.
- Günlük ortamının değiştirilmesi, 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde 7 gün vitronektin kaplı 12 oyuklu plaka ve kültürde vitronektin çözeltisi ve plaka iPSCs atın.
- Hücre boyama
- Kültür ortamı atın ve bir kez PBS ile hücreleri yıkayın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile% 0.4 paraformaldehid (PFA) hücreleri saptamak.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 hücreleri geçirgenliği.
- permeabilization kaldırPBS, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 2 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden çözelti ve blok.
- . PBS Tablo 1 'e göre% 2 BSA içeren antikorlar seyreltilir, oda sıcaklığında 2 saat süre ile primer antikorlar ile inkübe hücreleri.
- ikincil antikoru (1 seyreltilmiştir: 200) ilave edin ve ışık kaçınarak, oda sıcaklığında 1 saat inkübe hücreleri.
- 1 ul / 10 dakika boyunca mL DAPI ile hücrelerin tedavi edin.
- antifade reaktif ile kayıcı camın üst kapak camı ve ışığı kaçınarak 24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- Bir floresan mikroskop ile ifade edin.
4. Gerçek zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR)
- Guanidinyum tiosianat-fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi 11 kullanılarak hücre pelletinden mRNA ekstrakte edin.
- Ters transkripsiyon 11 kullanılarak toplam mRNA 2 ug cDNA yükseltmek.
- cDNA tem 2 ul kullanılarak PCR için gerekli bileşenleri karıştırınPlaka 11.
- RT-PCR gerçekleştirin ve jel elektroforezi 11 ile sonuçları doğrulayın.
5. Alkali Fosfataz (AP) Boyama
- 37 ° C'de 5-7 gün süre ile kültür iPSCs, boyamadan önce% 5 CO2.
- medya aspire ve 1 dakika boyunca% 4 PFA hücreleri saptamak.
- fiksatif atın ve 1X durulama tamponu ile hücrelerin yıkayın.
- AP lekelenmesi için reaktifler hazırlayın. Aşağıdaki oranda reaktifler karışımı: Fast Red Violet: naftol AS-BI fosfat çözeltisi: su = 2: 1: 1 arasındadır.
- ışık kaçınarak 15 dakika boyunca oda sıcaklığında boyama solüsyonu ile inkübe hücreleri.
- boyama çözüm atın ve durulama tamponu ile hücrelerin yıkayın.
- kurumasını önlemek ve parlak alan mikroskop kullanılarak ifadesini doğrulamak için hücrelerin PBS ile örtün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, bir lentiviral sistemi kullanılarak FLSs gelen iPSCs oluşturmak için bir protokol açıklar. Şekil 1A FLS izolasyon protokolü basit bir şemasını gösterir. sinovyanın cerrahi olarak çıkarılması ardından, doku cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde doğranmış edildi. Kollajenaz doku kümeleri hücreleri izole etmek için ilave edildi. Hücreler, daha sonraki işlemlerden önce 14 gün boyunca inkübe edilmiştir. Şekil 1B izole FLSs morfolojisini gösterir. Hücreler kullanımdan önce 3 geçişleri için muhafaza edilmiştir. FLSs genel fibroblastlar ile benzer bir özelliği paylaşmaktadır. Bizim izole FLSs fibrotik işaretçileri, vimentin ve Fibronektin dile getirdi. İzole RA FLSs da makrofaj benzeri sinoviyosit marker, CD68 (Şekil 1C) düşük ekspresyonu gösterdi.
FLSs toplanır ve lentivirüsler Yama 4 içeren kalıtnaka yeniden programlama için faktörler. çeşitli oranlarda (D7) hücreleri ayrıldıktan sonra, küçük koloniler ortaya çıkmaya başladı. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, görünür koloniler, D8-11 çıktı. Koloniler bu noktadan alınabilir. Şekil 2B bir aldı ve güçlendirilmiş koloninin bir görüntü gösterir.
iPSCs geçit 5-10 kadar genişletilmiş ve daha sonra, çeşitli deneylerde kullanılmıştır. Ayrım EKH AP yüksek düzeyde ile karakterize edilir. Hücreler farklılaşmamış durumunu doğrulamak için AP için boyandı. RA-iPSCs onlar farklılaşmamış olan belirten AP (Şekil 2C) olarak ifade edilmiştir. Pluripotent işaretleyici ifade (Şekil 2B, E) incelenmiştir. Bu Oct3 / 4, Sox2 Nanog, Lin28, DPPB5 ve TDGF1 olarak pluripotent markerlerinin ifadesi RT-PCR (Şekil 2B) kullanılarak teyit edilmiştir. Oct3 / 4 ifadesi, Sox2 da immünofloresan a ile teyit edilmiştirBu SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 ve Klf4 gibi ek işaretleri ile nalysis. TRA-1-60, şu anda en önemli iPSC işaretleyici olduğu düşünülür, yüksek eden oluşturulan iPSCs cinsinden ifade edildi.
Daha fazla analiz için, karyotiplemesi ve teratom tahlil yapıldı. RA-iPSCs 44 + XY (Şekil 3A) normal kromozomal paterni gösterdi. SCID farelerine RA-iPSCs 12 hafta sonrası enjeksiyonu, teratom oluşturulmuş ve bezi, adipoz doku ve kan damarları (Şekil 3B) gibi çeşitli dokular, sergiledi. germ tabakası farklılaşma da immünofloresan boyama yoluyla teyit edilmiştir. Ektoderm kökenli hücreler pozitif Otx2 için boyandı. Mezodermal hücrelerin brachyury ifade edilir ve endoderm SOX17 pozitif boyama ile teyit edilmiştir.
Şekil 1: ProtocBir RA Hasta gelen FLS İzolasyon için ol. (A) Sinoviyosit izolasyonu için kullanılan yöntemin basit bir diyagram. İzole FLSs (B) Morfoloji. FLSs (C) Floresans mikroskopi görüntü fibrotik belirteçler vimentin, fibronektin ve makrofaj benzeri sinoviyosit işaretleyici CD68 ile lekelenmiştir. Tüm Ölçek çubukları 200 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: RA Hasta izole FLSs gelen iPSCs Üretimi almadan önce bir iPSC kolonisinin (A) Parlak alan görüntüsü.. Kaldırdıktan sonra koloni (B) Görüntü. (C) Koloni AP için boyandı. (D) PCR analizi of pluripotent belirteçler. IPSCs (E) floresan mikroskobu görüntüsü. oluşturulan iPSCs Tüm pluripotent işaretlerini ifade edilmiştir. Tüm Ölçek çubukları 200 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Karyotip Analizi ve Teratoma Deneyi (A) Yüksek çözünürlüklü G-bantlı görüntüleri iPSCs normal karyograms gösteren.. görüntü 46 XY, normal diploid erkek kromozomal içeriği temsil eder. Teratom deneyleri ve immünofloresan boyama (B) Sonuçları. Tüm Ölçek çubukları 200 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSCs keşfinden önce, bilim adamları başta farklılaşma ile kök hücre biyolojisi ve diğer hücre soyları incelemek için EKH kullanılır. Ancak, EKH bir erken evre embriyo bir blastosist, iç kitle kaynaklanır. EKH izole etmek için, blastosist tahrip üstesinden gelinemez etik sorunlar yükselterek, kaçınılmazdır. EKH stemness özellikleri ve pluripotensini olsa Ayrıca, bu bireylerden elde edilemez ve bazen de kişisel analizleri ve hastalık taranması için ideal bir araç bulunmaktadır.
2007 yılında, Takahashi ve ark. insan fibroblastlarında 2 elde iPSCs. Teorik olarak, EKH aksine iPSCs herhangi bir yetişkin somatik hücrelerinden üretilebilir. Bu avantaj, iPSCs otomatik hücre transplantasyonu için ideal bir araç olduğu düşünülmektedir. Ayrıca, epigenetik bellek kavramı ile, iPSCs patojenik durumda örneğin, simülasyonu için ideal bir cep malzemesi olduğu düşünülmektedir. Hastalık modellemesi. Bu kan hücreleri, idrar hücreler ve hücrelerin çeşitli tipleri kullanılarak yapılan birçok çalışma yapılmıştır. Bununla birlikte, yeniden programlama yapılmamıştır olduğu gibi FLSs gibi birçok hücre, vardır.
Romatizmalı hastalıklar kalıcı sakatlığa neden olabilir önemli bağışıklık bozuklukları vardır. RA Sonuç olarak kemik ve kıkırdak hasarı ile resultimg, eklemlerde kronik inflamasyona neden olur. Kıkırdak in vivo olarak yeniden edemez özellikle çünkü tedavi veya hasarı tersine çevirmek için zordur. Bu nedenle rejeneratif tıp kullanarak iPSCs RA tedavisi için yeni bir eleştirel bir araçtır. Kemik ve kıkırdak kaybı da pannus oluşumu kaynaklanmaktadır. Pannus eklem histolojik görüntüde görülebilir boynuz benzeri bir yapıdır. pannus kanseri hücreleri gibi limitlessly çoğalan FLSs ile yapılır. Bu nedenle, FLSs hastalığın patolojik özelliklerini yansıtır olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmada, hasta FL kullanılanSs iPSCs üretir.
FLSs RA patogenezine katkıda başlıca bir hücre türüdürler. Çoğunlukla sinoviyal eklem içinde enflamatuar ortama maruz kalacağı bir hücre olarak, grup, hastanın hastalık durumunun yansıtan bir malzeme olarak kullanılabilir olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, erken yeniden programlama yöntemi kullanılarak, biz 4 Yamanaka teslim kullanarak, FLSs RA özgü iPSCs üretmek için çalıştı faktörleri - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-Myc - lentivirüs. FLSs Kaldırılan sinovyum izole edilmiştir. FLSs izole edilirken Sinoviyumun düzeltme kritik oldu. Kemik ve yağ artıkları daha karmaşık saf FLSs elde etmek yapabilirsiniz. Ayrıca, kollajenaz kullanımı FLS izolasyonu için kaçınılmazdır. Geçitler 3-8 arasında hücre kullanılması önemlidir. FLSs geçişini 3 ulaştığınızda, lentiviruses içeren Yamanaka faktörü daha önceki çalışmalarında 11'de belirtilen prosedür takip edilerek oluşturulur. üretilen lentiviruses kullanmaBaşarıyla RA FLS türetilmiş iPSCs (RA-iPSCs) oluşturulur. Saf iPSC klonları koloni toplama yöntemi ile üretilmiştir. RA-iPSCs tüm pluripotent transkripsiyon işaretlerini dile ve normal karyotip vardı. Ayrıca, RA-iPSCs teratom tahlil göre her üç germ içine ayırt başardık. Ayrıca in vitro osteojenik soy ayrışmıştır RA-iPSCs fazla mineralizasyon gösterdi doğruladı 11 (veriler gösterilmemiştir).
Bununla birlikte, bu yöntem için bazı kısıtlamalar vardır. Lentiviruses yeniden programlama için genomik entegrasyon gerektirir. Klf-4 ve C-myc onkogenler ve bu iki Yamanaka faktörleri, in vivo tümör büyümesini kolaylaştırır. Dolayısıyla, klinik uygulamalar için malzeme oluşturmak için bu faktörlerin kullanmak için ideal olmayabilir. Ayrıca, FLSs ve cilt fibroblastlar kliniklerinde elde etmek zor değildir. (Çeşitli raporlar, cilt fibroblastlar de belirtildiği gibi, yani dermal fibroblastlar) Sadece punch biyopsi ile elde edilebilir. FLSs invaziv cerrahi ile sadece izole edilebilir ve bu ameliyat diz ameliyatı geçirmiş şiddetli hiperplazi olan hastalarda uygulanır. Bu nedenle, bir sigara RA IPSC yeniden programlarken FLSs kullanmaya gerek yoktur. Buna ek olarak, fibroblastlar yeniden programlama için hazır olan süreç zor ve zaman alıcıdır. FLSs cilt fibroblastlar aynı eksiklikleri paylaşıyoruz. Bu nedenle, daha kolay işlenebilir ve elde hücre kaynakları gerekmektedir.
Bu nedenle, araştırmacılar alternatif hücre kaynağı aramak için başladı. Bir anda kullanılan malzeme kan hücreleridir. Kan çizmek kolaydır ve izolasyon süreci nispeten basit ve hızlı. Ayrıca, bu tür Sendai viral sistemleri, küçük moleküller ve epizomal plazmidler olarak genom entegrasyon gerekmez araçlar, Lentivirüslerden kullanımından bir kayma var.
FLSs olarak kullanılamaz, ancakaraştırma amaçlı RA-iPSCs oluştururken farklı bireyler için bir malzeme, hala büyük bir malzemedir. Gelecekte, bir RA hasta FLS türetilmiş iPSC banka oluşturmak için arıyoruz. RA hastaları tek tek tedavisinde kullanılan ilaçlar için çeşitli reaksiyonlar gösterir. RA iPSCs birkaç satır ile, RA hastaları için ilaç tarama hücre bankası oluşturmak için umut ediyor. her bir hücre hattı ile ilgili tüm ilaçların taranması, biz bu, hastaya çalışacak madde tahmin etmek mümkün olabilir.
Sonuç olarak, bu protokol romatoloji için iPSC teknolojisinin uygulanması anlatılmaktadır. Bu protokol ile, iPSCs RA hastalarının türevi FLSs üretilen ve oluşturulan iPSCs gerekli özelliklere sahip olabilir. Bu iPSCs klinik araştırma, ilaç tarama, hastalığın modelleme ve RA biyoloji daha ileri araştırmalar için rejeneratif tıpta kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
