Summary
ここでは、フィーダー細胞なしでレンチウイルス系を用いて、患者由来の線維芽細胞様滑膜細胞から誘導された多能性ヒト幹細胞を生成するためのプロトコルを説明します。
Abstract
成熟した体細胞を再プログラミング因子の定義されたセットを使用して、多能性幹細胞のような状態に反転させることができます。 Oct4、Sox2、Klf4及びc-Myc：多くの研究は、4つの山中転写因子を形質導入することにより、様々な体細胞型から誘導され、多能性幹細胞（性IPSC）を生成しています。性IPSCの研究は、生物学的および臨床研究の最先端に残ります。 iPS細胞は、任意の個々の組織から誘導することができるので、特に、患者特異的iPS細胞は、疾患の病理生物学の研究のための先駆的なツールとして使用することができます。関節リウマチ（RA）は、関節内の軟骨および骨の構造の破壊によって分類慢性炎症性疾患です。滑膜過形成は、RAにおけるこれらの結果につながる主な理由や症状の一つです。線維芽細胞様滑膜細胞（FLSS）は過形成滑膜における主成分細胞です。関節内のFLSSは限りなく、最終的に隣接cartilに侵入、増殖します年齢や骨。現在、過形成性滑膜は、外科的処置によって除去することができます。削除された滑膜は、関節の炎症状態を反映する材料として、RAの研究のために使用されます。 RAの病因における主要なプレーヤーとして、FLSSは、RA患者の性IPSCを生成し、調査するための材料として使用することができます。本研究では、iPS細胞を生成するために、RA患者のFLSSを使用しました。レンチウイルス系を用いて、我々は、FLSSがRA患者固有のIPSCを生成することができることを発見しました。 FLSSから生成されたiPS細胞は、さらに、将来のRAの病態生理学を研究するためのツールとして使用することができます。
Introduction
多能性幹細胞は、様々な臨床的および生物学分野における次世代プラットフォームです。それらは、疾患モデル、薬物スクリーニング、および再生医療の治療に用いることができる有望なツールです。ヒト胚性幹細胞（hESC）は、主に研究し、多能性細胞を理解するために使用しました。しかしながら、ヒト胚盤胞の破壊により単離し、ヒトES細胞は、いくつかの倫理的な問題と関連しています。 2007年には、博士山中伸弥と彼のチームは、セルプログラミングプロセスを逆転し、ヒト成体の体細胞1,2から幹細胞を開発しました。したがって、ヒトES細胞とは異なり、誘導された多能性幹細胞（iPS細胞）は、倫理的なハードルを回避し、成熟した体細胞から生成することができます。
Oct4、Sox2の、Klf4及びc-Myc：通常、性IPSCは、4つの外因性遺伝子の送達によって生成されます。これらの山中因子は、もともとレンチウイルスおよびレトロウイルス系を使用して配信されます。最初のiPS細胞は、マウスの体細胞cから誘導されましたells 3。その後、技術は、ヒト皮膚線維芽細胞1,2に適用しました。その後の研究に成功し、尿4、血液5,6、ケラチノサイト7、およびいくつかの他の細胞型など、さまざまなソースからのiPS細胞を、生成されました。しかし、いくつかの体細胞再プログラミングに使用されていない細胞、および疾患状態の特定の組織からの種々の細胞型の再プログラミング能力のスクリーニングがあり、依然として必要とされています。
関節リウマチ（RA）は、すべての関節を打つと他の臓器における自己免疫疾患につながる可能性疾患です。 RAは、先進国で成人の約1％に影響を与えます。それはむしろ一般的な疾患であり、その発生率は毎年8増加します。しかし、RAは、初期の段階で特定するのは困難であると破壊onceboneダメージを回復することができない治療法がありませんが発生します。また、薬物の有効性は、患者に、患者は異なり、衛生兵を予測することは困難です必要とされるINE。したがって、薬物スクリーニング方法の開発が必要とされ、RAの状況を反映することができる細胞材料が必要とされます。
線維芽細胞様滑膜細胞（FLSS）は、RA 9,10の病因における積極的なセルラー参加しています。 FLSSはまた、滑膜と呼ばれる関節包とキャビティとの間滑膜内膜ライニング、中に存在します。関節の構造を支持し、周囲の軟骨に栄養を提供することにより、FLSSは通常、関節機能と維持に重要な役割を果たしています。しかし、RAのFLSSは、浸潤性の表現型を持っています。 RA FLSSは、最終的に無限増殖10によって周囲の骨を破壊し、癌様の表現型を持っています。このユニークな特性を有する、FLSSはRAの病理生物学を反映することができる有望な材料として用いることができます。しかし、これらの細胞はほとんど生産されず、細胞がin vitroでのいくつかの通路を通って行くように細胞表現型を変更します
理論的には、RA患者由来のiPS細胞（RA-性IPSC）は、薬物スクリーニング、さらなる研究のための理想的なツールになることができます。生成されたiPS細胞は、自己再生能を有し、 インビトロで維持し、拡張することができます。多能性と、これらの細胞は、RAおよび他の骨関連疾患11の特定の研究のための細胞物質の寄与することができる成熟した軟骨細胞及び骨細胞系統へ分化させることができます。
本研究では、外科的に除去滑膜からFLSSを分離し、展開する方法を示し、そしてどのように山中因子を含むレンチウイルスを用いて、FLSSからRA-iPS細胞を生成します。
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Protocol
倫理に関する声明：本研究プロトコルは、カトリック大学校（KC12TISI0861）の施設内倫理委員会によって承認されました。
1.滑膜細胞の単離と拡大
- 滑膜細胞の単離
- 手術用はさみの2組と鉗子の1ペアを滅菌します。
- 100mmディッシュに滑膜組織を移し、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）5mlで洗浄します。
- 黄色がかった脂肪組織および骨残基を切断。 6ウェルプレートのウェルにトリミングされた組織を移し、20％ウシ胎児血清（FBS）を有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を5ml加えます。
- 作品は使い捨てピペットを貫通するのに十分に小さくなるまでハサミで組織をみじん切りに。
- 50ミリリットルコニカルチューブに組織含有培地を転送します。 6ウェルプレートに20％FBSを含むDMEMの5ミリリットルを追加することで、残りの材料を収穫した後、チューブに移します。</李>
- 氷上で解凍コラゲナーゼ。 0.01％の最終濃度にコラゲナーゼを追加し、パラフィルムでチューブを密封します。 4時間振とうしながら37℃の水浴中でインキュベートします。
- 全量を10分間300×gで、室温で50 mlの遠心分離になるまでインキュベートした後、20％FBSを含むDMEMでチューブを満たします。
- ペレットを乱すことなく上清を除去し、ペレットを再懸濁するためにメディアの40ミリリットルを追加します。
- 繰り返しは1.1.10-1.1.11を繰り返します。
- 20％のFBSを含むDMEM 25mlにペレットを再懸濁し、底に沈むする組織の大きな塊を待ちます。
- 100ミリメートル皿に上清を移し、14日に5％CO 2中で37℃でインキュベートします。
- 滑膜細胞維持・拡大
- プレートから使用されているメディアを捨て、PBS 5mlで細胞を洗浄。
- 1mlのPBS / 1mMのEDTAを添加し、2分間、5％CO 2中、37℃でインキュベートします。
- 静かに皿とtransfeをタップしますR 15 mLコニカルチューブに細胞。 2分間、250×gでRTを、細胞を遠心します。
- ペレットを乱すことなく上清を除去し、20％FBSを含むDMEM 30mlにペレットを再懸濁。
- 目に見える残りの材料を残すことなく、3×100mm皿に細胞を移します。
- 新鮮な培地3日毎に培地を交換してください。 1mlのPBS / 1mMのEDTAを用いて80％の密集度で細胞を分割します。使用前に継代3まで維持します。すべての分割で3皿に細胞の各皿を割ります。
注：通路3に達した後、すぐに使用するつもりはありません細胞を凍結することができます。
レンチウイルスをコードする山中因子を使用して2再プログラミングFLSS
- トランスダクション（D0）
- 増殖培地中の種子6ウェルプレートのウェルあたり3×10 4細胞（DMEM 500mlを、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました）。 5％CO中37℃で細胞O / Nインキュベート2。
- 4℃で冷凍庫と解凍からのOct4、Klf4の、Sox2の、およびc-Mycの次の日、4山中因子を含むレンチウイルスの1つのバイアルを取り外します。注：レンチウイルスは、我々の以前の研究11に記載した手順で製造しました。
- ウイルスを解凍しながら、10 / mlのヘキサジメトリン臭化および50μg/ mlのアスコルビン酸を含有するFLSの増殖培地（DMEM、20％FBSを加えた抗生物質）にメディアを変更します。
- メディアを変更した後、細胞にレンチウイルスの30μlを添加し、穏やかに混合します。感染症を改善するために、30分間680×gで、35℃でプレートを遠心します。
- 遠心分離後、5％CO 2中37℃で細胞をインキュベートします。
- メンテナンス再プログラミングが表示されるまで
- 3日のために、0.1 mMの酪酸ナトリウムおよび50μg/ mlのアスコルビン酸を含有するFLSの増殖培地で毎日メディアを交換。
- 翌日、FLSの増殖培地の混合物を用いてメディアを交換し、IPSC培地：0.1mMの酪酸ナトリウムおよび50μg/ mlのアスコルビン酸を含有する（1：1の比）。
注：IPSC媒体の成分は、材料/機器リストに記載されています。
- コロニー形成のために細胞を分割
- ビトロネクチンでコーティングした6ウェルプレートを準備します。
- Ca 2+およびMg 2+なし6ミリリットルのPBSに60μlのビトロネクチンを追加します。各ウェルに混合物の2ミリリットルを入れ、少なくとも1時間RTでインキュベートします。注：ビトロネクチンの作業濃度は5μg/ mlのです。
- D5で、PBSで細胞を洗浄。
- 細胞を剥離し、2分間、37℃、5％CO 2でインキュベートし1mlのPBS / 1mMのEDTAを追加します。
- 2分間、250×gでRTを細胞や遠心分離機を収穫。
- 別の集密度を達成するために、3つの異なる比（9：3、1：6、および1 1）で細胞を分割します。細胞ペレットを再懸濁へのメディアの900μlのを追加します。 、300を追加し150、及び6-ウェル当たりの細胞混合液100μlそれぞれ、9：3,1：6、および1ウェルプレート1の比を達成します。
- コロニーが出現するまでIPSCメディアで毎日メディアを交換してください。コロニーは約D18の後に表示されます。注：この段階では、IPSCのコロニーは、非再プログラムFLSSと共存。
- ビトロネクチンでコーティングした6ウェルプレートを準備します。
- コロニーピッキング
- ウェルに500μlのビトロネクチンを追加することにより、48ウェルのビトロネクチンでコーティングされたプレートを用意し、少なくとも1時間室温でインキュベートします。
- クリーンベンチに顕微鏡を置き、インキュベーターから6ウェルプレートを取り外します。
- 48ウェルプレートからビトロネクチン溶液を除去し、10mMのRho関連、コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ROCK）阻害剤を補った500μlのIPSCのメディアを追加します。
- 10Pピペットチップを使用して、コロニーの周囲に切断します。 48ウェルプレートの1ウェルに選んだコロニーを転送します。
- いくつかのコロニーを採取した後、37°C、5％CO 2で細胞をインキュベートします。
- コロニーが大きいENOになるまで細胞を維持ぐふ転送のため。注：100X倍率で見た場合、コロニーは、顕微鏡の可視フィールドの外に取得するときに我々は通常、細胞をこぼしました。
3.免疫蛍光染色
- 細胞調製
- 12ウェルプレートに、滅菌18ミリメートルのカバーガラスを置きます。
- カバーガラスを冷却し、すすぐために1mlのPBSを追加します。
- 10μg/ mlのビトロネクチン溶液1mlと交換してください。
- 少なくとも室温で1時間プレートをインキュベートします。
- 毎日メディアを変え、37℃、5％CO 2で7日間ビトロネクチンでコーティングした12ウェルプレートと文化の中でビトロネクチン液とプレートiPS細胞を捨てます。
- 細胞染色
- 培養培地を捨て、PBSで一回細胞を洗浄します。
- RTで30分間、0.4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定してください。
- RTで5分間、0.1％トリトンX-100で細胞を透過性。
- 透過性を削除しますPBSを室温で30分間、2％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する溶液とブロック。
- 表1に記載の2％BSAを含むPBS中の抗体を希釈する。室温で2時間一次抗体で細胞をインキュベートします。
- 二次抗体（希釈1：200）を追加し、光を避け、室温で1時間、細胞をインキュベートします。
- 10分間の1μL/ mLのDAPIで細胞を処理します。
- 退色防止試薬とスライドガラスの上にカバーガラスを配置し、光を避け、室温で24時間インキュベートします。
- 蛍光顕微鏡で式を確認してください。
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
- チオシアン酸グアニジニウム-フェノール-クロロホルム抽出法11を用いて、細胞ペレットからmRNAを抽出します。
- 逆転写11を用いて、全mRNAの2μgのからcDNAを増幅します。
- cDNAテムの2μLを用いたPCRに必要な成分を混合プレート11。
- RT-PCRを行い、ゲル電気泳動11で結果を確認します。
5.アルカリホスファターゼ（AP）染色
- 37℃で5-7日間培養性IPSC、染色前に、5％のCO 2。
- メディアを吸引し、1分間、4％PFAで細胞を固定します。
- 固定液を捨て、1Xリンスバッファーで細胞を洗浄。
- AP染色のための試薬を準備します。ファストレッドバイオレット：ナフトールAS-BIリン酸塩溶液：水= 2：1：以下の比率での試薬を混ぜる1。
- 光を避けて、15分間、室温で染色液で細胞をインキュベートします。
- 染色液を捨て、リンスバッファーで細胞を洗浄。
- 乾燥を防止し、明視野顕微鏡を使用して発現を確認するためにPBSで細胞を覆います。
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Representative Results
本研究では、レンチウイルスシステムを使用してFLSSからiPS細胞を生成するためのプロトコルを記述している。 図1Aは、FLS単離プロトコールの簡単なスキームを示します。滑膜の外科的除去に続いて、組織は、外科用はさみを使用して小片に切断しました。コラゲナーゼは、組織の塊から細胞を単離するために添加しました。細胞は、さらなる処理の前に14日間インキュベートした。 図 1Bは、単離され FLSSの形態を示します。細胞は、使用前に3継代維持しました。 FLSSは、一般的な線維芽細胞と同様の特性を共有しています。私たちの孤立FLSSは線維化マーカー、ビメンチンおよびフィブロネクチンを表明しました。孤立したRA FLSSはまた、マクロファージ様滑膜細胞マーカー、CD68（ 図1C）の低発現を示しました。
FLSSは4山を含むレンチウイルスで回収し、形質導入しました再プログラミングのための那珂要因。種々の比率（D7）で細胞を分割した後、小さなコロニーが出現し始めました。目に見えるコロニーを、 図2Aに示すように、D8-11に現れました。コロニーは、この時点から取り出すことができる。 図2Bは、採取し、増幅されたコロニーの画像を示します。
性IPSCは、通路5~10まで拡張した後、種々のアッセイに使用しました。未分化のESCは、APの高いレベルによって特徴づけられます。細胞が未分化状態を確認するAPについて染色しました。 RA-性IPSCは、彼らが未分化であることを示す、AP（ 図2C）を表明しました。多能性マーカーの発現は、（ 図 2D、E）を調べました。そのようなのOct3 / 4、Sox2の、Nanogの、LIN28、DPPB5とTDGF1などの多能性マーカーの発現は、RT-PCR（ 図2D）を用いて確認しました。 Oct3 / 4、Sox2の発現はまた、免疫Aによって確認しましたこのようなSSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81およびKlf4のような付加的なマーカーとnalysis。 TRA-1-60、現在最も重要なIPSCのマーカーであると考えられ、非常に我々の発生iPS細胞で発現させました。
さらなる分析のために、我々は核型分析および奇形腫アッセイを行いました。 RA-性IPSCは、44 + XY（ 図3A）の正常な染色体パターンを示しました。 SCIDマウスへのRA-iPS細胞の12週間、ポスト噴射は、奇形腫を形成し、そのような腺、脂肪組織および血管（ 図3B）などの多様な組織に、表示されていました。胚葉の分化はまた、免疫蛍光染色により確認しました。外胚葉系細胞を積極OTX2について染色しました。中胚葉細胞が短尾を表明し、内胚葉は、SOX17の陽性染色により確認しました。
図1：ProtocRA患者からのFLSの分離のためのオール。（A）滑膜細胞の単離のために使用される方法の簡単な図。 （B）を単離しFLSSの形態。 FLSSの（C）蛍光顕微鏡画像は、線維化マーカーであるビメンチン、フィブロネクチンおよびマクロファージ様滑膜細胞マーカー、CD68で染色しました。 = 200μmのすべてのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：RA の患者から分離FLSSからのiPS細胞の生成 IPSCコロニーの（A）明視野像ピッキングの前に。 （B）ピッキング後のコロニーのイメージ。 （C）コロニーは、APについて染色しました。 （D）PCR分析OF多能性マーカー。 iPS細胞の（E）蛍光顕微鏡画像。生成されたiPS細胞は、すべての多能性マーカーを発現しました。 = 200μmのすべてのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：核型分析と奇形腫アッセイ （A）高解像度のG-バンド化されたイメージは、iPS細胞の正常なkaryogramsを示します。画像は46XY、通常の二倍体雄の染色体の含有量を表します。奇形腫アッセイおよび免疫蛍光染色の（B）の結果。 = 200μmのすべてのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
iPS細胞の発見前に、科学者たちは、主に分化を通じて幹細胞生物学および他の細胞系譜を研究するためのESCを使用していました。しかし、ESCは、初期段階の胚である胚盤胞の内部塊に由来します。 ESCを単離するために、胚盤胞の破壊を克服することは不可能である倫理的な問題を上げ、避けられません。 ESCは、幹細胞性特性および多分化能を有するがまた、それらは個体から得ることができず、時にはパーソナライズ分析および疾患のスクリーニングのための理想的なツールではありません。
2007年には、高橋ら 。ヒト線維芽細胞2からiPS細胞を生成しました。理論的には、ESCは異なり、性IPSCは、任意の成体の体細胞から生成することができます。この利点により、iPS細胞を自動細胞移植のための理想的なツールであると考えられています。また、エピジェネティックなメモリのコンセプトで、性IPSCは、病原性の条件、 すなわちのシミュレーションのための理想的な電池材料であると考えられています。病気のモデリング。このような血液細胞、尿細胞など多くの細胞の様々なタイプを使用して行われ、多くの研究がなされています。しかし、再プログラミングが行われていないこのようなFLSSなどの多くの細胞型があります。
関節炎疾患は、永久的な障害を引き起こす可能性が主要な免疫疾患です。 RAは、最終的に骨および軟骨損傷にresultimg、関節の慢性炎症によって引き起こされます。軟骨が生体内で再生することはできませんので、特に損傷を治癒または逆することは困難です。 iPS細胞を用いて、そのため再生医療は、RAの治療法のための新しい重要なツールです。骨および軟骨の損失もパンヌス形成をもたらしています。パンヌスは、関節の組織学的画像に見られるホーン状の構造です。パンヌスは、癌細胞のような無限増殖FLSSによって行われます。したがって、FLSSが疾患の病理学的特徴を反映することができると考えられます。本研究では、患者FLを使用しましたssのiPS細胞を生成します。
FLSSは、RAの病因に寄与する主要な細胞型です。ほとんど滑膜関節の内側の炎症性環境に暴露される細胞としては、私たちのグループは、患者の疾患状態を反射する材料として使用することができると考えました。 Oct3 / 4、Sox2、Klf4及びc-Myc - - レンチウイルスによってそのため、最も早く再プログラミング法を使用して、我々は4山中因子の配信を使用して、FLSSからRA固有のiPS細胞を生成しようとしました。 FLSSは削除された滑膜から単離しました。 FLSSを分離する際に滑膜のトリミングが重要でした。骨と脂肪残基は、より複雑な純粋なFLSSを得ることができます。また、コラゲナーゼの使用は、FLSの単離のために不可欠です。通路3-8間の細胞を使用することが重要です。 FLSSが通路3に到達すると、レンチウイルスを含む山中因子は、我々の以前の研究11で述べた手順に従って生成されます。生産レンチウイルスを用いて、、我々が正常にRA FLS由来のiPS細胞（RA-性IPSC）を生成しました。純粋なIPSCクローンをコロニーピッキング法により作製しました。 RA-性IPSCは、すべての多能性転写マーカーを発現し、正常な核型を持っていました。また、RA-iPS細胞は奇形腫アッセイに応じて、3つすべての胚葉に分化することができました。また、我々は、in vitroで骨形成系列に分化時RA-iPS細胞は、より石灰化を示すことを確認した11（データは示さず）。
しかし、この方法にはいくつかの制限があります。レンチウイルスは、再プログラミングのためのゲノム組み込みを必要とします。 KLF-4およびc-Mycのは癌遺伝子であり、これら二つの山中因子は、 インビボでの腫瘍増殖を促進することができます。したがって、臨床応用のための材料を生成するために、これらの要素を使用することが理想的ではないかもしれません。さらに、FLSSや皮膚線維芽細胞は、診療所で入手することは困難ではありません。各種報告書で述べたように、皮膚線維芽細胞（ すなわちダーマL線維芽細胞）は、パンチ生検によって得ることができます。 FLSSは、侵襲的な外科的処置によって単離することができ、この手術は、膝の手術を受けた重度の過形成を有する患者に対して行われます。したがって、非RA IPSCを再プログラミングするときFLSSを使用する必要はありません。さらに、線維芽細胞を再プログラミングのために準備されるプロセスは、困難で時間がかかります。 FLSSは、皮膚線維芽細胞と同じ欠点を共有しています。そのため、取り扱いが容易であり、得られる細胞源が必要とされています。
このため、研究者は、代替細胞源を探索し始めています。現在使用される材料は、血液細胞です。血液を描画するために容易であり、単離プロセスは比較的シンプルで早いのが特長です。さらに、センダイウイルス系、小分子、およびエピソームプラスミドとしてゲノムの統合を必要としないツールへのレンチウイルスの使用からのずれがあります。
FLSSは次のように使用することはできませんが、研究目的のためにRA-iPS細胞を生成する際に、多様な個人のための材料は、それはまだ大きい材料です。今後は、RA患者FLS由来のIPSCバンクを生成するために探しています。 RA患者は、個々の治療のために使用される薬物の多様な反応を示します。 RA iPS細胞のいくつかの行では、我々はRA患者のための薬物スクリーニング細胞バンクを生成するために期待しています。各細胞株のすべての薬物をスクリーニングすることによって、我々は、薬剤が個々する患者に動作するかを予測することができるかもしれません。
結論として、このプロトコルは、リウマチにIPSC技術の応用を説明しています。このプロトコルでは、iPS細胞は、RA患者由来のFLSSから生成され、生成されたiPS細胞は、必要な特性を有することができます。これらのiPS細胞は、RAの生物学のさらなる研究のために臨床研究、薬物スクリーニング、疾患モデル、および再生医療に使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
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