Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen van de patiënt afgeleid fibroblast-achtige synoviocyten, met behulp van een lentivirale systeem zonder feeder-cellen.
Abstract
Volwassen somatische cellen kan worden teruggedraaid in een pluripotente stamcel-achtige toestand met behulp van een gedefinieerde set van herprogrammering factoren. Talrijke studies hebben geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) uit diverse somatische celtypen gegenereerd door transduceren vier Yamanaka transcriptiefactoren: Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc. De studie van iPSCs blijft op het snijvlak van biologisch en klinisch onderzoek. In het bijzonder kunnen patiëntspecifieke iPSC worden gebruikt als baanbrekend instrument voor de studie van ziekten pathobiology aangezien iPSC kan worden geïnduceerd door het weefsel van een individu. Reumatoïde artritis (RA) is een chronische ontstekingsziekte, geclassificeerd door de vernietiging van kraakbeen en botten in het gewricht. Synoviale hyperplasie is een van de belangrijkste redenen of symptomen die leiden tot deze resultaten in RA. Fibroblast-achtige synoviocyten (FLSS) zijn de belangrijkste component cellen in de hyperplastische synovium. FLSS in de joint onbeperkt vermenigvuldigen, uiteindelijk invasie van de aangrenzende cartilleeftijd en bot. Momenteel kan de hyperplastische synovium alleen worden verwijderd door een chirurgische ingreep. De verwijderde synovium wordt gebruikt voor RA onderzoek als een materiaal dat de ontsteking van het gewricht weerspiegelt. Als een belangrijke speler in de pathogenese van RA, kan FLSS worden gebruikt als materiaal voor het genereren en onderzoeken van de iPSCs van RA-patiënten. In deze studie gebruikten we de FLSS van een RA patiënt iPSCs te genereren. Met behulp van een lentivirale systeem, ontdekten we dat FLSS RA patiënt-specifieke iPSC kan genereren. De iPSCs gegenereerd FLSS kan verder worden gebruikt als een instrument om de pathofysiologie van RA bestuderen in de toekomst.
Introduction
Pluripotente stamcellen zijn de volgende generatie platform in verschillende klinische en biologisch gebied. Ze zijn een veelbelovend hulpmiddel dat kan worden gebruikt in ziektemodel, drug screening en regeneratieve medische therapie. Menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) werden voornamelijk gebruikt om te studeren en te begrijpen pluripotente cellen. Echter geïsoleerd door de vernietiging van de menselijke blastocyst, hESCs worden geassocieerd met verschillende ethische overwegingen. In 2007, Dr. Shinya Yamanaka en zijn team een ommekeer in de cel programmering en stamcellen ontwikkeld op basis van humane volwassen lichaamscellen 1,2. Anders dan bij hESCs, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) kunnen uit volwassen lichaamscellen, het vermijden van de ethische obstakels.
Gewoonlijk worden iPSCs gegenereerd door levering van vier exogene genen: Oct4, Sox2, Klf4, en c-Myc. Deze Yamanaka factoren zijn oorspronkelijk geleverd met behulp van lentivirale en retrovirale systemen. De eerste iPSCs werden afgeleid uit muizen somatische cells 3. Daarna werd de techniek toegepast op humane dermale fibroblasten 1,2. Daaropvolgende studies met succes gegenereerd iPSCs uit verschillende bronnen, zoals urine 4, bloed 5,6, 7 keratinocyten, en verschillende andere celtypen. Er zijn echter een aantal somatische cellen die niet zijn gebruikt herprogrammering en screening van de herprogrammering capaciteiten van verschillende celtypen van specifieke weefsels in ziektetoestand, nog steeds vereist.
Reumatoïde artritis (RA) is een ziekte die alle verbindingen kan vallen; leiden tot auto-immuunziekten in andere organen. RA treft ongeveer 1% van de volwassenen in de ontwikkelde wereld. Het is een vrij veel voorkomende ziekte en de incidentie neemt jaarlijks 8. Echter, RA is moeilijk te identificeren in de vroege stadia en oncebone vernietiging treedt er geen behandeling die de schade kan herstellen. Bovendien werkzaamheid van het geneesmiddel verschilt van patiënt tot patiënt, en het is moeilijk om de dokter voorspellenine die nodig is. Daarom is de ontwikkeling van een geneesmiddel-screeningsmethode nodig, en celmateriaal dat de voorwaarden van RA kan weerspiegelen vereist.
Fibroblast-achtige synoviocyten (FLSS) een actieve mobiele deelnemer in de pathogenese van RA 9,10. FLSS bestaan in de synoviale intimale voering tussen het gewrichtskapsel en holte, die ook wordt aangeduid als het synovium. Door ondersteuning van de gezamenlijke structuur en verschaffen voedingsstoffen naar de omringende kraakbeen, FLSS meestal spelen een cruciale rol in gewrichtsfunctie en onderhoud. Echter, FLSS in RA een invasief fenotype. RA FLSS hebben een kanker-achtige fenotype, uiteindelijk vernietigen van de omliggende bot door oneindige proliferatie 10. Met deze unieke eigenschap kan FLSS worden gebruikt als een veelbelovend materiaal dat pathobiologie van RA kan reflecteren. Toch zijn deze cellen zelden geproduceerd, en de cel fenotypes veranderen als de cellen gaan door middel van een aantal passages in in vitro
Theoretisch kan RA-patiënten afkomstig iPSCs (RA-iPSCs) een ideaal hulpmiddel voor drug discovery en verder onderzoek. Gegenereerde iPSCs hebben zelfvernieuwing capaciteit en kan worden gehandhaafd en uitgebreid in vitro. Met pluripotentie, kunnen deze cellen worden onderscheiden in volwassen chondrocyten en osteocyt geslachten, die celmateriaal kan een bijdrage leveren voor specifiek onderzoek in RA en andere bot-gerelateerde ziekten 11.
In deze studie laten we zien hoe te isoleren en uit te breiden FLSS vanuit een operatief verwijderd synovium, en hoe RA-iPSCs genereren uit FLSS gebruik lentivirussen bevatten Yamanaka factoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Deze studie protocol werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC12TISI0861).
1. synoviocyt Isolatie en uitbreiding
- synoviocyt Isolation
- Steriliseren twee paar chirurgische schaar en een pincet.
- Breng de synoviale weefsel een 100 mm schaal en was met 5 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1% penicilline / streptomycine.
- Snijd de gelige vetweefsel en bot residuen. Breng de bijgesneden weefsel een putje van een 6-well plaat en voeg 5 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 20% foetaal runderserum (FBS).
- Hak de weefsels met de schaar tot stukken klein genoeg om een wegwerp pipet penetreren.
- Breng de weefsel-bevattende media met een 50 ml conische buis. Oogst de resterende materiaal door toevoeging van 5 ml DMEM met 20% FBS aan de 6-well plaat en breng aan de buis. </ Li>
- Dooi collagenase op ijs. collagenase aan een eindconcentratie van 0,01% en sluit de buis met parafilm. Incubeer in een waterbad bij 37 ° C onder schudden gedurende 4 uur.
- Na incubatie, vul de buis met DMEM met 20% FBS, totdat het totale volume 50 ml en centrifugeer bij 300 xg, kamertemperatuur 10 min.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en voeg 40 ml van media om de pellet te resuspenderen.
- Herhaal stap 1.1.10-1.1.11.
- Resuspendeer de pellet in 25 ml DMEM met 20% FBS en wacht op de grote brokken weefsel zinken naar de bodem.
- Breng de bovenstaande een 100 mm schaal en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 14 dagen.
- Synoviocyt onderhoud en uitbreiding
- Gooi de inhoud van de plaat en was de cellen met 5 ml PBS.
- Voeg 1 ml PBS / 1 mM EDTA en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 2 min.
- Tik op de schotel voorzichtig en transfer de cellen om een 15 ml conische buis. Centrifugeer de cellen bij 250 xg, kamertemperatuur 2 min.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de pellet in 30 ml DMEM met 20% FBS.
- Breng de cellen tot 3 x 100 mm gerechten, zonder dat er zichtbaar restmateriaal.
- Vervang de media met verse media elke 3 d. Splits de cellen bij 80% confluentie onder toepassing van 1 ml PBS / 1 mM EDTA. Handhaven tot passage 3 voor gebruik. Verdeel elk gerecht van de cellen in 3 gerechten in elke fractie.
LET OP: Na het bereiken van passage 3, kunnen cellen die niet zullen onmiddellijk worden gebruikt, worden bevroren.
2. Herprogrammering FLSS behulp Lentivirussen-coderend Yamanaka Factors
- Transductie (D0)
- Zaad 3 x 10 4 cellen per putje van een 6-wells plaat in groeimedia (500 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine). Incubeer de cellen O / N bij 37 ° C in 5% CO2.
- De volgende dag, verwijder dan één flacon lentivirus met 4 Yamanaka factoren: Oct4, Klf4, Sox2 en c-Myc uit de vriezer en ontdooien bij 4 ° C. Opmerking: Lentivirus werd geproduceerd door het in onze vorige studie 11 beschreven procedure.
- Terwijl thawing virus, afdrukmateriaal met FLS groeimedium (20% FBS plus antibiotica in DMEM) dat 10 ug / ml hexadimethrinebromide en 50 ug / ml ascorbinezuur.
- Nadat de media, voeg 30 ul van lentivirus de cellen en meng voorzichtig. Om besmetting te verbeteren, centrifuge de plaat bij 680 xg, 35 ° C gedurende 30 minuten.
- Na centrifugatie Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2.
- Onderhoud Tot herprogrammeren is Visible
- Voor 3 dagen de media vervangen daags met FLS groeimedium bevattende 0,1 mM natriumbutyraat en 50 ug / ml ascorbinezuur.
- De volgende dag, de media vervangen met een mengsel van FLS groeimedia eniPSC media (1: 1 verhouding) met 0,1 mM natriumbutyraat en 50 ug / ml ascorbinezuur.
Opmerking: De componenten van de iPSC media in de lijst materialen / apparatuur.
- Splitting Cellen voor Colony Formation
- Bereid een vitronectine beklede 6-well plaat.
- Voeg 60 ul vitronectine aan 6 ml PBS zonder Ca2 + en Mg2 +. Zet 2 ml mengsel in elk putjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur. Opmerking: De werkende concentratie van vitronectine is 5 ug / ml.
- Op D5, was de cellen met PBS.
- Voeg 1 ml PBS / 1 mM EDTA om de cellen los en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 2 min.
- Oogst de cellen en centrifugeer bij 250 xg, kamertemperatuur 2 min.
- Splits de cellen bij 3 verschillende verhoudingen (1: 3, 1: 6 en 1: 9) om verschillende confluencies bereiken. Voeg 900 ul van media om de celpellet en resuspendeer. Voeg 300, 150, en 100 pl van het celmengsel per putje van een 6-3, 1: 6 en 1: putjesplaat een verhouding van 1 bereiken 9 resp.
- Vervang de media dagelijks met iPSC media tot kolonies verschijnen. Kolonies zal verschijnen na ongeveer D18. Opmerking: In dit stadium iPSC kolonies bestaan naast de niet-FLSS geherprogrammeerd.
- Bereid een vitronectine beklede 6-well plaat.
- kolonie picking
- Bereid een 48-well-vitronectine beklede plaat door toevoeging van 500 pi vitronectine aan de putjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
- Plaats de microscoop op een schone bank, en verwijder de 6-well plaat uit de incubator.
- Verwijder de vitronectine oplossing uit de 48-well plaat en voeg 500 ul iPSC medium aangevuld met 10 mM Rho-geassocieerde, coiled-coil met proteïne kinase (ROCK) remmer.
- Met behulp van een 10p pipetpunt, snijd rond de kolonie. Transfer het opgenomen kolonie één putje van de 48-well plaat.
- Na het plukken verscheidene kolonies Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2.
- Handhaving van de cellen tot de kolonies zijn grote enough voor de overdracht. Let op: We meestal gemorst de cellen wanneer de kolonie komt uit het zichtbare gebied van de microscoop, wanneer bekeken bij 100X vergroting.
3. immunofluorescentiekleuring
- celbereiding
- Plaats een steriele 18 mm dekglas in een 12-wells plaat.
- Voeg 1 ml PBS afkoelen en het dekglas.
- Vervangen door 1 ml van een 10 ug / ml vitronectine oplossing.
- Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
- Gooi de vitronectine oplossing en plaat iPSCs in de vitronectine gecoate 12-well plaat en kweek gedurende 7 dagen bij 37 ° C, 5% CO2, het veranderen van de media dagelijks.
- cel kleuring
- Gooi het kweekmedium en was de cellen eenmaal met PBS.
- Fixeer de cellen in 0,4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Permeabilize de cellen met 0,1% Triton X-100 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de permeabilisatieoplossing en blokkeren met PBS met 2% runderserumalbumine (BSA) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verdun de antilichamen in PBS met 2% BSA volgens tabel 1. Incubeer de cellen met de primaire antilichamen gedurende 2 uur bij KT.
- Voeg het secundaire antilichaam (verdund 1: 200) en incuberen van de cellen gedurende 1 uur bij KT, het vermijden licht.
- Behandel de cellen met 1 ul / ml DAPI gedurende 10 min.
- Plaats het deksel glas bovenop het objectglaasje met antifade reagens en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 24 uur, het vermijden van licht.
- Expressie te verifiëren met een fluorescentiemicroscoop.
4. Real-time PCR (RT-PCR)
- Uittreksel mRNA uit de celpellet met de guanidinium thiocyanaat-fenol- chloroform extractie methode 11.
- CDNA amplificeren van 2 ug totaal mRNA middels reverse transcriptie 11.
- Meng de voor de PCR waarbij gebruik wordt 2 pi cDNA templaat 11.
- Voer RT-PCR en controleer de resultaten door gelelektroforese 11.
5. alkalisch fosfatase (AP) kleuring
- IPSCs kweek gedurende 5-7 dagen bij 37 ° C, 5% CO 2 voor de kleurreactie.
- Aspireren de media en zet de cellen met 4% PFA gedurende 1 minuut.
- Gooi het fixeermiddel en spoel de cellen met 1X spoelbuffer.
- Bereid de reagentia voor AP kleuring. Meng de reagentia in de volgende verhouding: Fast Red Violet: naftol AS-BI-oplossing: water = 2: 1: 1.
- Incubeer de cellen met de kleuroplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 min, het vermijden licht.
- Gooi de kleuroplossing en spoel de cellen met spoeling buffer.
- Bedek de cellen met PBS om uitdroging te voorkomen en expressie te verifiëren met behulp van een helder-veld microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie beschrijven we een protocol om iPSCs van FLSS genereren met behulp van een lentivirale systeem. Figuur 1A toont een eenvoudige schema van de FLS isolatie protocol. Na chirurgische verwijdering van het synovium, werd het weefsel in kleine stukjes gesneden met behulp chirurgische schaar. Collagenase werd toegevoegd om de cellen te isoleren van de klompjes weefsel. De cellen werden gedurende 14 dagen voor verdere verwerking. Figuur 1B toont de morfologie van de geïsoleerde FLSS. Cellen werden gedurende 3 doorgangen voor gebruik. FLSS delen een soortgelijke karakteristiek algemene fibroblasten. Onze geïsoleerde FLSS sprak de fibrotische markers, vimentine en fibronectine. De geïsoleerde RA FLSS toonde ook lage expressie van de macrofaag-achtige synoviocyt marker, CD68 (figuur 1C).
FLSS werden geoogst en getransduceerd met lentivirussen met 4 Yamanaka factoren voor herprogrammering. Na splitsing van de cellen bij verschillende verhoudingen (D7), kleine kolonies begonnen te verschijnen. Zichtbare kolonies, zoals getoond in figuur 2A, verscheen D8-11. Kolonies kunnen worden opgehaald van dit punt. Figuur 2B toont een afbeelding van een opgepikt en versterkt kolonie.
iPSCs werden uitgebreid tot passage 5-10 en vervolgens gebruikt in diverse testen. Ongedifferentieerde SER's worden gekenmerkt door een hoge mate van AP. De cellen werden gekleurd voor AP om de ongedifferentieerde staat te bevestigen. RA-iPSCs uitgedrukt AP (figuur 2C), wat aangeeft dat ze zijn ongedifferentieerd. Pluripotente marker expressie werd onderzocht (Figuur 2D, E). De expressie van pluripotente merkers zoals Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Lin28, DPPB5 en TDGF1 werd bevestigd met RT-PCR (Figuur 2D). De expressie van Oct3 / 4, werd Sox2 ook bevestigd door een immunofluorescentieNALYSE met extra markers zoals SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 en Klf4. TRA-1-60, die momenteel wordt beschouwd als de belangrijkste iPSC marker, was sterk tot expressie gebracht in onze gegenereerd iPSCs.
Voor verdere analyse voerden we karyotypering en teratoom assay. RA-iPSCs vertoonden een normaal chromosomaal patroon van 44 + XY (Figuur 3A). 12 weken na de injectie-RA-iPSC in SCID muizen was teratomas gevormd en weergegeven diverse weefsels, zoals klier, vetweefsel en bloedvaten (Figuur 3B). De kiemlaag differentiatie werd ook bevestigd door de immunofluorescentiekleuring. Ectoderm lineage cellen werden positief gekleurd voor Otx2. Mesodermale cellen brachten brachyury en endoderm werd bevestigd door positieve kleuring van Sox17.
Figuur 1: Protocol voor FLS Isolatie van een RA patiënt. (A) Een eenvoudige schema van de methode die wordt gebruikt voor het synoviocyt isolement. (B) morfologie van geïsoleerde FLSS. (C) Fluorescentie microscopie beeld van FLSS gekleurd met fibrotische markers vimentine, fibronectine en een macrofaag-achtige synoviocyt marker, CD68. Alle Schaal bars = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Generatie van iPSCs van FLSS geïsoleerd van een RA patiënt (A) Helder-veld beeld van een iPSC kolonie voordat plukken.. (B) Afbeelding van een kolonie na het plukken. (C) Colony gekleurd voor AP. (D) PCR analyse of pluripotent markers. (E) Fluorescentie microscopie beeld van iPSCs. De gegenereerde iPSCs uitgedrukt alle pluripotente markers. Alle Schaal bars = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karyotype Analyse en Teratoma Assay (A) Hoge resolutie G-gestreepte beelden die normaal karyograms van iPSCs.. Het beeld vertegenwoordigt een 46XY normale diploïde mannelijke chromosomale inhoud. (B) De resultaten van teratoma assays en immunofluorescentiekleuring. Alle Schaal bars = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vóór de ontdekking van iPSCs, wetenschappers vooral gebruikt SER om stamcel biologie en andere cellijnen te bestuderen door differentiatie. Echter, SER afkomstig uit de binnenste massa van een blastocyst, dat een vroeg stadium embryo. Om SER isoleren, vernietiging van de blastocyst is onvermijdelijk, het verhogen van ethische kwesties die niet te overwinnen zijn. Ofschoon SER hebben stemness kenmerken en pluripotentie, ze kunnen niet worden verkregen uit individuen en soms niet een ideaal instrument voor gepersonaliseerde analyse en screening ziekte.
In 2007, Takahashi et al. iPSCs gegenereerd uit humane fibroblasten 2. Theoretisch tegenstelling SER, iPSC kunnen uit volgroeide somatische cellen. Met dit voordeel, zijn iPSCs gedacht dat de ideale tool voor auto-celtransplantatie zijn. Ook met het begrip epigenetische geheugen iPSCs wordt gedacht dat het ideale celmateriaal voor de simulatie van pathogene aandoeningen, dat wil zeggen. Ziektemodel. Er zijn veel studies uitgevoerd met verschillende soorten cellen zoals bloedcellen, cellen en urine meer geweest. Toch zijn er veel celtypen, zoals FLSS, waarbij herprogrammering is niet uitgevoerd.
Artritis en vaatziekten zijn de belangrijkste immune aandoeningen die blijvende invaliditeit kan veroorzaken. RA wordt veroorzaakt door chronische ontsteking in de gewrichten, uiteindelijk resultimg in bot- en kraakbeenschade. Het is moeilijk te genezen of omkeren van de schade vooral omdat kraakbeen niet kan regenereren in vivo. Daarom regeneratieve geneeskunde met behulp van iPSCs zijn een nieuw instrument van cruciaal belang voor de behandeling van RA. Het bot en kraakbeen verlies wordt ook geleid tot pannus formatie. Pannus een hoornachtige structuur die kan worden gezien in de histologische beeld van het gewricht. De pannus wordt gemaakt door FLSS dat onbeperkt vermenigvuldigen, zoals kankercellen. Derhalve wordt gedacht dat de FLSS de pathologische kenmerken van de ziekte weerspiegelen. In deze studie gebruikten we geduldig FLSs te iPSCs te genereren.
FLSS zijn de belangrijkste celtype die bijdragen aan de pathogenese van RA. Als een cel die meestal wordt blootgesteld aan de omgeving binnen de inflammatoire synoviale gewricht, onze fractie vond dat het kan worden gebruikt als een materiaal dat ziektetoestand van de patiënt weerspiegelt. Daarom worden bij de vroegste herprogrammering methode, hebben we geprobeerd RA-specifieke iPSCs van FLSS genereren via de afgifte van de 4 Yamanaka factoren - Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-Myc - door lentivirus. FLSS werden geïsoleerd uit de verwijderde synovium. Het trimmen van synovium was kritisch wanneer het isoleren FLSS. Bot en vetresten kan het ingewikkelder om pure FLSS verkrijgen. Ook het gebruik van collagenase is onvermijdelijk voor FLS isolatie. Het is belangrijk om cellen tussen passages 3-8 gebruikt. Wanneer FLSS bereiken passage 3, de Yamanaka factor met lentivirussen worden gegenereerd naar aanleiding van de in ons eerdere werk 11 genoemde procedure. Met de geproduceerde lentivirussenHebben we met succes gegenereerd RA FLS afgeleid iPSCs (RA-iPSCs). IPSC zuivere klonen werden gegenereerd door de kolonie picking methode. De RA-iPSCs expressie van alle markers pluripotente transcriptie en had een normaal karyotype. Bovendien is de RA-iPSCs konden differentiëren naar alle weefsels volgens de teratoma assay. Ook hebben we bevestigd dat de RA-iPSCs vertoonden meer mineralisering bij onderverdeeld in osteogene geslachten in vitro (gegevens niet getoond) 11.
Er zijn echter een aantal beperkingen aan deze methode. Lentivirussen nodig genomische integratie voor herprogrammering. KLF-4 en c-Myc zijn oncogenen en deze twee factoren Yamanaka tumorgroei in vivo te vergemakkelijken. Daarom kan het niet ideaal om deze factoren te gebruiken om voor klinische toepassingen genereren. Verder FLSS en huidfibroblasten niet moeilijk te verkrijgen in klinieken. Zoals vermeld in diverse rapporten, huidfibroblasten (dwz dermal fibroblasten) kan alleen worden verkregen door de punch biopsieën. FLSS kan alleen worden geïsoleerd door een invasieve chirurgische procedure en deze operatie wordt uitgevoerd bij patiënten met ernstige hyperplasie die knie-operatie hebben ondergaan. Daarom is er geen noodzaak om FLSS gebruiken met het herprogrammeren van een niet-RA iPSC. Bovendien, het proces waardoor fibroblasten worden bereid herprogrammering is moeilijk en tijdrovend. FLSS delen dezelfde tekortkomingen als de huid fibroblasten. Daarom celbronnen die gemakkelijker te hanteren zijn en het verkrijgen vereist.
Daarom hebben onderzoekers begonnen met zoeken naar een alternatieve bron van cellen. Een momenteel gebruikte materiaal bloedcellen. Het is gemakkelijk om bloed en de isolatiewerkwijze is relatief eenvoudig en snel. Verder is er een verschuiving van het gebruik van lentivirussen hiermee uitrusten genoom-integratie vereisen, zoals Sendai virale systemen, kleine moleculen en episomale plasmiden.
Hoewel FLSS niet kan worden gebruikt alseen materiaal voor diverse individuen, het is nog steeds een groot materiaal bij het genereren van RA-iPSCs voor onderzoeksdoeleinden. In de toekomst zijn wij op zoek naar een RA patiënt FLS-afgeleide iPSC bank te genereren. RA patiënten individueel verschillende reacties op geneesmiddelen die worden gebruikt voor de behandeling tonen. Met verschillende lijnen van de RA iPSCs, hopen we een drug screening cell-bank voor de RA-patiënten te genereren. Door screening van alle medicijnen op elke cellijn kunnen we kunnen voorspellen welk medicijn werkt waarop individuele patiënt.
Tot slot, dit protocol beschrijft de toepassing van iPSC technologie voor reumatologie. Met dit protocol, kan iPSCs worden gegenereerd uit RA patiënt-afgeleide FLSS, en de gegenereerde iPSCs hebben de vereiste kenmerken. Deze iPSC kunnen worden gebruikt in klinisch onderzoek, drug screening, ziektemodel en regeneratieve geneeskunde voor verder onderzoek van de biologie van RA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mlL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 ml) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/ml) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/ml) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde (PFA) | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
