This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.
Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.
In Nervenverletzungen sind die proximalen und distalen Nervenstümpfe oft von der direkten Neuausrichtung Nervenfaszikel verhindert aufgrund der Läsionsstelle 1-2. Normalerweise werden Axon Striche hoch geordnete und ausgerichtete Bündel von Axonen zusammen, die komplexe Netzwerke von Konnektivität bilden. Allerdings ist die Nervenregeneration ein chaotischer Prozess wegen schlecht organisiert Axon Ausrichtung 3-4. Um daher eine ausreichende Anzahl von regenerierenden Axonen zu erzeugen, das der Läsionsstelle brücken, ist es notwendig, gut organisierte axonalen Ausrichtung zu induzieren. Darüber hinaus begleitet Demyelinisierung Nervenverletzungen durch Tod der myelinisierende Zellen an der Verletzungsstelle. Da Demyelinisierung stark beeinträchtigt die leitende Kapazität Axone zu überleben, Behandlungen Targeting Demyelinisierung oder Remyelinisierung fördern sind bedeutsam für die funktionelle Erholung nach einer Nervenverletzung 5. So ist das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Engineering-Ansatz zu verdeutlichen, die diese beiden Fragen behandeltder Nervenregeneration.
Oberflächenanisotropie, die als Differenz definiert, wenn sie entlang verschiedenen Achsen gemessen, in einem Material der physikalischen oder mechanischen Eigenschaften, wurde angewendet Zellausrichtung zu beeinflussen, das Wachstum und die Migration 6-7. Neben Topographie, gibt es andere Methoden Anisotropie zu induzieren. Bisher untersuchten wir Oberflächenanisotropie durch mechanische statische Vorstreckung von Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) Membran induziert. Die Theorie der "kleinen super Verformung auf großen auferlegt" vorausgesagt , daß die effektive Steifigkeit der Zellen in der gedehnten Richtung erfassen von der senkrechten Richtung abweicht, und diese Differenz der effektiven Steifigkeit aufgrund Anisotropie 8 an die Oberfläche. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) , kultiviert auf einem vorgedehnten PDMS – Membran können die Anisotropie zu erfassen , indem aktiv die Oberfläche gezogen und als Ergebnis, richten in der vorgedehnten Richtung 9. In ähnlicher Weise eine anisotrope Oberflächen arising von einer mechanischen Oberflächenvorgedehnten wirkt sich auf die Ausrichtung, 10 Axone sowie das Wachstum und die Myelinisierung von dorsal root ganglion (DRG). Hier stellen wir ein Protokoll zur Induktion Oberflächenanisotropie auf einer statischen vorgedehnten PDMS Substrat 10 Axonregeneration zu verbessern.
Zu axon Ausrichtung, topologische Merkmale mit gewünschten Mustern hervorzurufen, berichtet Kontaktführung durch die ausgerichteten Fasern zu schaffen und Kanäle 6,11-12 wurden nachgewiesen axon Ausrichtung 11,13 erleichtern. Jedoch zum Induzieren axon Ausrichtung durch topologische Merkmale Techniken berichtet, wie Fasern, Kanäle und Strukturieren, waren nicht imstande, zu verlängern und um die Dicke der Axone erhöhen. Im Gegensatz dazu Reckung mechanischen graduellen zu axon Ausrichtung in Dehnungsrichtung geführt mit längeren und dickeren Axone , die mit der Größe der Dehnung 14 erhöht. Jedoch ist eine angetriebene Motor Vorrichtung in vivo nicht enthältmöglich. Im Gegensatz dazu ist statisch vorgedehnten induzierte Anisotropie weniger kompliziert und leichter in Zukunft Gerüst Entwürfe für in vivo – Anwendungen integriert werden können.
In diesem Protokoll wird eine statische vorgedehnten Zellkultursystem wird verwendet Oberflächenanisotropie ohne topologische Eigenschaften zu induzieren. Die vorgedehnten Kultursystem besteht aus einem PDMS-Membran zusammengesetzt ist, einem dehnbaren Rahmen und einer Streckstufe, wobei die Membran an dem Rahmen befestigt ist und eine vorbestimmte Strecke Größe auf der Streckstufe zugeführt wird. Frisch isolierte DRG auf der vorgedehnten Oberfläche kultivierten Neuronen für bis zu 21 Tage für axon Ausrichtung und Dicke überwacht. Anschließend Schwann-Zellen (SCs) co-kultiviert mit den ausgerichteten Axone werden Myelinisierung überwacht. Vorstreckung induzierte Oberflächenanisotropie Durch die Integration konnten wir Ausrichtung der Zellen-Differenzierung und Axon Ausrichtung Wachstum von MSCs und DRG – Neuronen 9-10 bzw. zu verbessern.
Zur Induktion Axon Ausrichtung auf vorgedehnte Oberfläche gibt es zwei wichtige Schritte: 1) die PDMS-Membran muss flach sein und homogener Dicke; und 2) Gliazellen müssen aus dem DRG entfernt werden. Nach dem Mischen in einem Ofen die PDMS und Vernetzer und der Härtung sollte das vernetzte PDMS Gel sorgfältig ein Verkanten zu vermeiden, auf einer flachen Tischplatte und behandelt gehalten werden. Die Sauerstoffplasmabehandlung der PDMS Membran sollte innerhalb von 6 h von PLL-Beschichtung eingehalten werden, da die…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten sich Eric Vasco für seine Unterstützung bei der Vorbereitung der PDMS-Substrate, Dr. Shiyong Wang in Dr. Marina Mata Labor an der University of Michigan für hilfreiche Anregungen und Ausbildung des DRG-Isolation und Dr. Mark Tuszynski und Dr. danken W. Marie Campana an der UC San Diego. für hilfreiche Anregungen und das Protokoll für die SC-Isolation. Diese Studie wurde teilweise von der National Science Foundation (CBET 0.941.055 und CBET 1.510.895), das National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866 und R01EB014986) unterstützt.
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
Neurobasal Medium 1X | GibcoBRL | 21103-049 | |
B27 Supplement 50X | GibcoBRL | 17504-044 | |
Glutamax-I 100X | GibcoBRL | 35050-061 | |
Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
Uridine | Sigma | U3003 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
DMEM | Gibco | 11885 | |
Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
BPE | Clonetics | CC-4009 | |
Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X, | ||
2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml). | |||
FDU and Uridine stock solution | FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC. | ||
Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC. | |||
Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration, | |||
then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |