This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.
Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.
In lesioni nervose, i monconi prossimali e distali del nervo sono spesso impedito di riallineamento diretta di fascicoli nervosi a causa del sito della lesione 1-2. Normalmente, tratti di assoni sono composti da fasci altamente ordinate e allineate di assoni, che formano reti complesse di connettività. Tuttavia, la rigenerazione dei nervi è un processo caotico a causa di allineamento degli assoni mal organizzato 3-4. Pertanto, per generare un numero sufficiente di rigenerare assoni che colmano il sito della lesione, è necessario per indurre ben organizzato allineamento assonale. Inoltre, demielinizzazione accompagna lesioni nervose a causa di morte delle cellule mielinizzanti presso il luogo di ferita. Dal momento che demielinizzazione compromette fortemente la capacità conduttiva di sopravvivere assoni, i trattamenti di targeting demielinizzazione o che promuovono la rimielinizzazione sono significativi per il recupero funzionale dopo lesione del nervo 5. Così l'obiettivo di questo protocollo è quello di illustrare un approccio ingegneristico che affronta questi due problemidi rigenerazione nervosa.
Anisotropia di superficie, che è definito come la differenza, quando misurata lungo assi diversi, in proprietà fisiche e meccaniche di un materiale, è stato applicato per influenzare l'allineamento cellulare, la crescita e la migrazione 6-7. Oltre alla topografia, ci sono altri metodi per indurre anisotropia. In precedenza, abbiamo studiato anisotropia superficie indotta dalla meccanica statica pre-tratto di poli-dimetil-silossano (PDMS) membrana. La teoria del "piccolo super-deformazione imposta su grandi", prevede che la rigidezza efficace le cellule percepiscono nella direzione allungata differisce dalla direzione perpendicolare, e questa differenza di rigidità efficace è dovuto alla superficie anisotropia 8. Cellule staminali mesenchimali (MSC) coltivate su una membrana pre-stirato PDMS sono in grado di percepire l'anisotropia tirando attivamente la superficie e, di conseguenza, allineare in direzione prestirato 9. Analogamente, una superficie ar anisotropoising da una superficie pre-stirato meccanico colpisce l'allineamento, così come la crescita e la mielinizzazione dei gangli delle radici dorsali (DRG) assoni 10. Qui forniamo un protocollo per indurre anisotropia di superficie su un substrato di PDMS pre-stirato statico per migliorare la rigenerazione degli assoni 10.
Per suscitare l'allineamento degli assoni, le caratteristiche topologiche con i modelli desiderati, segnalato per fornire una guida contatto attraverso fibre allineate e canali 6,11-12, sono stati dimostrato di facilitare l'allineamento degli assoni 11,13. Tuttavia, le tecniche per indurre l'allineamento assone attraverso le caratteristiche topologiche, come fibre, canali e patterning riportato, erano in grado di allungarsi e aumentare lo spessore degli assoni. Al contrario, graduale stiramento meccanico portato all'allineamento assone nella direzione di stiro con assoni più lunghi e più spessi che aumentano con la grandezza del tratto 14. Tuttavia, incorporante un dispositivo motore alimentato in vivo non èfattibile. Al contrario, statica anisotropia indotta prestirato è meno complicato e può essere più facilmente incorporato in futuri disegni ponteggi per applicazioni in vivo.
In questo protocollo, un sistema di coltura cellulare prestirato statico viene utilizzato per indurre anisotropia superficie senza caratteristiche topologiche. Il sistema di coltura prestirato è composto da una membrana PDMS, un telaio estensibile e una fase di stretching, dopo di che la membrana è fissata sul telaio ed una grandezza tratto predeterminato viene applicato sulla scena stretching. Appena isolate neuroni DRG coltivate sulla superficie prestirato che fino a 21 giorni sono monitorati per l'allineamento assone e spessore. Successivamente, le cellule di Schwann (SC) co-coltura con gli assoni allineati vengono monitorati per mielinizzazione. Incorporando pre-stiro indotta anisotropia superficie siamo stati in grado di migliorare l'allineamento delle cellule-differenziazione e assone allineamento crescita delle cellule staminali mesenchimali e neuroni DRG 9-10, rispettivamente.
Per indurre l'allineamento assone sulla superficie pre-stirato, ci sono due passaggi critici: 1) la membrana PDMS deve essere piana e di spessore omogeneo; e 2) cellule gliali devono essere rimossi dal DRG. Dopo la miscelazione il PDMS e reticolante e cottura in forno, il gel PDMS reticolato dovrebbe essere mantenuto su un banco piana e maneggiato con cura per evitare qualsiasi inclinazione. Il trattamento al plasma di ossigeno della membrana PDMS dovrebbe essere seguita entro 6 ore mediante rivestimento PLL, poich?…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Eric Vasco per la sua assistenza nella preparazione dei substrati PDMS, Dr. Shiyong Wang nel laboratorio del Dr. Marina Mata presso l'Università del Michigan per i suggerimenti e la formazione del isolamento DRG utile, e il dottor Mark Tuszynski e il Dr . W. Marie Campana a UC San Diego per i suggerimenti utili e di protocollo per l'isolamento SC. Questo studio è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation (CBET 0.941.055 e 1.510.895 CBET), il National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866, e R01EB014986).
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
Neurobasal Medium 1X | GibcoBRL | 21103-049 | |
B27 Supplement 50X | GibcoBRL | 17504-044 | |
Glutamax-I 100X | GibcoBRL | 35050-061 | |
Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
Uridine | Sigma | U3003 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
DMEM | Gibco | 11885 | |
Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
BPE | Clonetics | CC-4009 | |
Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X, | ||
2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml). | |||
FDU and Uridine stock solution | FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC. | ||
Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC. | |||
Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration, | |||
then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |