접근 방법은 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 정렬 및 수초를 강화하는

Summary

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Abstract

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Introduction

신경 손상에서, 근위 및 원위 신경 그루터기는 종종 인해 병변 사이트에 ^1-2로 신경 다발의 직접 재배치 방지 할 수있다. 일반적으로, 축삭 책자는 연결의 복잡한 네트워크를 형성 축삭의 높은 순서 정렬 번들로 구성된다. 그러나, 신경 재생이 제대로 구성 축삭 정렬 ^3-4으로 인해 혼란스러운 과정이다. 따라서, 병변 부위를 해소 축삭 재생의 충분한 수를 생성하는 것이 아니라 축삭 조직 배향을 유도 할 필요가있다. 또한, 탈수 초화는 부상 사이트에서 myelinating 세포의 죽음으로 인한 신경 손상을 수반. 탈수 초화가 강하게 축삭 생존의 도전 능력을 손상 때문에, 탈수 초화를 대상으로 또는 재유 수화를 촉진 치료는 신경 손상 ⁽⁵⁾ 후 기능 회복을 위해 중요하다. 따라서이 프로토콜의 목적은 두 가지 문제를 해결하는 설계 방법을 예시하는 것이다신경 재생의.

재료의 물리적, 기계적 성질, 상이한 축을 따라 측정 할 때의 차이로 정의되는 표면 이방성은 셀의 배향의 성장 및 이동 ^{6-7 영향을인가하고있다.} 지형뿐만 아니라, 이방성을 유도하는 다른 방법이있다. 이전에, 우리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 멤브레인의 기계적 정적 사전 스트레치에 의해 유도 된 표면 이방성을 조사 하였다. "큰 부과 작은 변형 SUPER"이론은 세포가 연신 방향 감지 유효 강성은 수직 방향과 다른 것을 예측하고 효과적인 강성 차이는 이방성 ^8면에 기인한다. 미리 연신 PDMS 막에서 배양 된 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)을 적극적 표면 당겨 그 결과 이방성을 감지 전 연신 방향 ^(9)으로 정렬 할 수있다. 마찬가지로, 이방성 표면 AR기계 사전 뻗어면에서 유망한 것은 후근 신경절의 정렬뿐만 아니라 성장과 수초 (DRG) ¹⁰ 축삭에 영향을 미칩니다. 여기에서 우리는 축삭 재생 ^(10)을 향상시키기 위해 정적 사전 뻗어 PDMS 기판에 표면 이방성을 유도하기위한 프로토콜을 제공합니다.

축삭 정렬, 원하는 패턴 위상 기능을 유도하기 위해 정렬 섬유 및 채널 ^6,11-12를 통해 연락처 지침을 제공하는 것으로보고, 축삭 정렬 ^{11,13을 용이하게} 입증되었다. 그러나, 섬유, 채널 및 패턴 등의 위상 기능을 통해 축삭 정렬을 유도하는 기술을보고, 길게과 축삭의 두께를 증가 할 수 없습니다. 반면에, 기계는 점진적 스트레치 ^(14)의 크기를 증가 길고 두꺼운 축색과 스트레칭 방향으로 정렬 축삭 연신되었다. 그러나, 생체 내에서 모터 구동 장치를 포함하는 것은 아니다실행할 수 있는. 반대로, 정적 프리 연신 유도 이방성은 덜 복잡하고보다 용이하게 생체 내 응용 프로그램의 장래 지지체 디자인에 혼입 될 수있다.

이 프로토콜에서, 고정 전 신장 세포 배양 시스템은 위상 기능이없는 표면 이방성을 유도하기 위해 사용된다. 막 프레임 상에 고정되고 소정의 스트레칭 정도는 연신 단계에 적용 그러자 예비 연신 배양 시스템하는 PDMS 막, 신축성 프레임 및 연신 단계로 구성된다. 최대 21 일간 전 배양 연신 표면에 갓 절연 DRG 신경 세포 축삭 정렬 및 두께에 대해 모니터링된다. 그 후, 슈반 세포 (희주) 수초에 대한 모니터링 정렬 된 축삭와 공동 배양. 사전 스트레칭에 의한 표면 이방성을 통합함으로써 우리는 중간 엽 줄기 세포 및 DRG 뉴런 각각 ^{9 ~ 10의} 세포 정렬 분화 및 축삭 정렬 성장을 향상 할 수 있었다.

Protocol

세포의 분리에 관한 모든 절차는 미시간 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 사전 뻗어 이방성 표면의 1. 준비 베이스와 경화제의 1 용액과 조직 배양 접시 (12cm 직경)로 혼합물을 부어 : 10을 섞는다. 4,900 mg의베이스와 총 가교 혼합물에 대한 경화제 490 mg을 사용합니다. 기포를 제거하기 위해 20 분 동안 진공 하에서 겔 혼합물을 유지한다. …

Representative Results

사전 신장 세포 배양 시스템 DRG 축삭 배향 (10)을 추진. DRG 뉴런 12 일 동안 사전 뻗어 미연 신 표면에 배양 하였다. 축삭은 정렬을 입증하는 β-III-tubulin에 대한 염색 하였다. (2) 문화의 12 일 후 사전 뻗어 미연 신 PDMS 기판에 축삭 방향을 비교 한 그림. 그들은 임의의 배향을 보여 미연 신 PDMS 기판상의 상호 연결된 네트워크를 형성하는 반면, …

Discussion

사전 뻗어 표면에 축삭 배향을 유도하기 위해 두 가지 중요한 단계가 있습니다 : 1) PDMS 막을와 균일 한 두께의 평면이어야합니다 2) 신경 교세포가 DRG로부터 제거되어야한다. PDMS의 가교제와 혼합하고 오븐에서 경화 후, PDMS 가교 겔 평평한 작업대 위에 보관 및 틸팅을 피하기 위해주의 깊게 취급되어야한다. 플라즈마 처리 후 (세포 부착을 위해 요구되는) 표면의 친수성이 시간에 감쇠 이후 PDMS 막?…

Materials

Polydimethylsiloxane （PDMS)	Dow Corning	SYLGARD 184
Neurobasal Medium 1X	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50X	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100X	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X,
			2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml).
FDU and Uridine stock solution			FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC.
			Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC.
			Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration,
			then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.