This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.
Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.
En las lesiones nerviosas, los muñones proximal y distal del nervio a menudo no pueden realineación directa de fascículos nerviosos debido a la zona de la lesión 1-2. Normalmente, los tractos de axones se componen de haces altamente ordenados y alineados de los axones, que forman redes complejas de conectividad. Sin embargo, la regeneración nerviosa es un proceso caótico debido a la alineación del axón mal organizada 3-4. Por lo tanto, para generar un número suficiente de regeneración de los axones que unen el sitio de la lesión, es necesario para inducir la alineación axonal bien organizado. Además, desmielinización acompaña a lesiones del nervio debido a la muerte de las células mielinizantes en el sitio de la lesión. Desde desmielinización deteriora fuertemente la capacidad conductora de sobrevivir a los axones, los tratamientos dirigidos desmielinización o promueven la remielinización son significativos para la recuperación funcional tras la lesión del nervio 5. Así, el objetivo de este protocolo es ilustrar un enfoque de ingeniería que se ocupa de estas dos cuestionesde la regeneración nerviosa.
Anisotropía de superficie, que se define como la diferencia, cuando se mide a lo largo de diferentes ejes, en las propiedades físicas o mecánicas de un material, se ha aplicado a influir en la alineación celular, el crecimiento y la migración 6-7. Además de la topografía, hay otros métodos para inducir anisotropía. Anteriormente, se investigó la anisotropía inducida por la superficie mecánica de pre-estiramiento estático de membrana de poli-dimetil-siloxano (PDMS). La teoría de la "pequeña súper deformación impuesta a gran" predijo que la rigidez efectiva de las células sentido en la dirección estirada difiere de la dirección perpendicular, y esta diferencia en la rigidez efectiva se debe a la anisotropía 8 la superficie. Las células madre mesenquimales (MSCs) cultivadas en una membrana de pre-estirado PDMS son capaces de detectar la anisotropía tirando activamente la superficie y, como resultado, alinear en la dirección de pre-estirado 9. Del mismo modo, un ar superficie anisotrópicaising de una superficie pre-estirado mecánico afecta a la alineación, así como el crecimiento y la mielinización de ganglio de la raíz dorsal (DRG) axones 10. Aquí proporcionamos un protocolo para la inducción de la anisotropía de superficie sobre un sustrato pre-estirado estática PDMS para mejorar la regeneración de axones 10.
A fin de obtener la alineación del axón, características topológicas con patrones deseados, reportado por brindar orientación contacto a través de las fibras y los canales 6,11-12 alineados, se demostró para facilitar la alineación axón 11,13. Sin embargo, informó técnicas para la inducción de la alineación del axón a través de características topológicas, tales como fibras, los canales y los patrones, no fueron capaces de alargar y aumentar el grosor de los axones. Por el contrario, gradual estiramiento mecánico llevó a alineación axón en la dirección de estiramiento con axones más largos y más gruesos que el aumento de la magnitud del tramo 14. Sin embargo, la incorporación de un dispositivo de motor alimentado in vivo no esfactible. En contraste, la anisotropía inducida por el pre-estirado estática es menos complicado y se puede incorporar más fácilmente en los futuros diseños de andamios para aplicaciones in vivo.
En este protocolo, un sistema de cultivo de células pre-estirado estático se utiliza para inducir anisotropía superficie sin características topológicas. El sistema de cultivo pre-estirado se compone de una membrana de PDMS, un marco estirable y una etapa de estiramiento, después de lo cual la membrana se fija sobre el marco y una magnitud tramo predeterminado se aplica en la etapa de estiramiento. recién aisladas DRG neuronas cultivadas en la superficie pre-estirado hasta por 21 días son monitoreados para la alineación del axón y grosor. Posteriormente, las células de Schwann (SC) co-cultivadas con los axones alineados están supervisados por la mielinización. Mediante la incorporación inducida de pre-estirado anisotropía superficie hemos sido capaces de mejorar la alineación de células-diferenciación y axón alineación-crecimiento de MSCs y las neuronas DRG 9-10, respectivamente.
Para inducir la alineación axón en la superficie pre-estirado, hay dos pasos críticos: 1) la membrana de PDMS debe ser plana y de un espesor homogéneo; y 2) las células gliales se deben retirar de la DRG. Después de mezclar el PDMS y agente de reticulación y curado en un horno, el gel reticulado PDMS debe mantenerse en la cima de banco plano y manejarla con cuidado para evitar cualquier inclinación. El tratamiento con plasma de oxígeno de la membrana de PDMS se debe seguir dentro de 6 h por recubrimiento de PLL…
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Eric Vasco por su ayuda en la preparación de los sustratos de PDMS, el Dr. Wang Shiyong en el laboratorio del Dr. Mata Marina de la Universidad de Michigan para sugerencias y la formación del aislamiento DRG votos, y el Dr. Mark Tuszynski y el Dr. . W. Marie Campana en UC San Diego por sus útiles sugerencias y protocolo para el aislamiento SC. Este estudio fue apoyado en parte por la National Science Foundation (CBET 0941055 y 1510895 EBNC), el Instituto Nacional de Salud (R21CA176854, R01GM089866, y R01EB014986).
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
Neurobasal Medium 1X | GibcoBRL | 21103-049 | |
B27 Supplement 50X | GibcoBRL | 17504-044 | |
Glutamax-I 100X | GibcoBRL | 35050-061 | |
Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
Uridine | Sigma | U3003 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
DMEM | Gibco | 11885 | |
Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
BPE | Clonetics | CC-4009 | |
Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X, | ||
2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml). | |||
FDU and Uridine stock solution | FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC. | ||
Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC. | |||
Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration, | |||
then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |