Summary
之前的任何其他纯化步骤三个换热沉淀方法都能够有效地除去90%以上的烟草宿主细胞蛋白质(医疗专业人员)的提取物。植物医疗专业人员不可逆聚合在温度高于60℃。
Abstract
植物不仅对人类提供食物,饲料和原料,但也已经被开发作为一种经济的生产系统,用于生物制药的蛋白质,如抗体,疫苗候选和酶。这些必须从植物生物质进行纯化,但色谱法步骤是由高浓度的植物提取液中宿主细胞蛋白(医疗专业人员)的阻碍。然而,大多数医疗专业人员不可逆聚合在温度高于60℃,促进靶蛋白的随后的纯化。这里,被呈现给实现烟草医疗专业人员的热沉淀在任一完整叶片或提取物的三种方法。完整叶片的热烫可以容易地纳入现有过程,但可能对随后的过滤步骤产生负面影响。相反的是一种用于在搅拌容器叶片提取物的热析出,从而可以提高下游操作的性能虽然有在工艺设备设计的重大变化,如真均质几何。最后,一个热交换器设置是公特征的传热条件方面和易于规模,但清洗可能是困难和可能存在于过滤器的能力造成负面影响。设计的-实验的方法可以被用来识别影响HCP去除和产物回收最相关的工艺参数。这有利于在其他平台上的表达每一种方法和最合适的方法鉴定为给定的纯化策略的应用。
Introduction
现代医疗保健系统越来越依赖于生物制药蛋白质1。在植物中生产这些蛋白质相比于常规表达系统2-4由于低病原体负担和更大的可扩展性是有利的。然而,植物性药物下游处理(DSP)是很有挑战性的,因为颠覆性的提取程序导致高粒子负担,与浊度超过5000浊度单位(NTUs)和宿主细胞蛋白(HCP)含量往往超过95 %[M / M] 5,6。
精细澄清过程需要以除去分散颗粒7-9,但色谱仪器是如果存在用于高效医疗专业人员去除10,11较早步骤初始产物回收过程中结合和洗脱模式运行成本更低。这可以通过沉淀使用floccul靶蛋白可以实现任蚂蚁12或低pH 13,14,以及通过使医疗专业人员聚集。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco),最丰富的HCP在绿色植物如烟草( 烟草 ),所述的选择性汇聚可以通过添加聚乙二醇15来促进,但是这是昂贵且具有大不相容-scale制造。热处理已显示变性和沉淀烟草医疗专业人员的超过95%,而蛋白质疟疾疫苗候选物如Vax8留在溶液中16-18稳定。
三种不同的方法被用来实现烟草医疗专业人员的热诱导析出:(ⅰ)热烫, 即,完整叶片在热液体的浸入,(ⅱ)一个温度受控的搅拌容器,和(iii)的热交换器( 图1)16。对于完整叶片,漂烫实现医疗专业人员的快速,高效的降水,也容易扩大规模,并与现有的大型的制造工艺,其中包括一个初始步骤洗植物生物质19兼容。与此相反,温度控制的容器已经在一些工艺可用,并且可以用于植物的热处理提取20,但其可扩展性和能量转移率是有限的,因为罐的表面-体积比逐渐减少,并变得不适合于生产规模。的热交换器是一个在技术上明确替代加热搅拌容器,但需要加热和冷却介质, 例如,蒸汽和冷水的供应充足,以及其适合于热交换器的几何形状的严格控制的体积流动速率和媒体属性, 例如 ,比热容量。本文显示了所有三种方法可如何用于在普通烟草医疗专业人员和植物医疗专业人员的热诱导沉淀。建立和EAC的操作在实验室设置h方法可用于评估其对于大规模的工艺的适用性。主要的挑战是确定适当尺度缩小的模型和运行条件类似于过程大规模生产过程中使用的设备和条件的每个操作。此处呈现的数据是指与表达的疟疾疫苗候选Vax8和荧光蛋白DsRed的16转基因烟草植物进行的实验,但该方法也已成功地应用到N.植物本生瞬时表达等生物制药蛋白21。
一个设计-的-实验(DOE)接近22可促进过程发展,絮凝剂23也可以是在这种情况下有益的,如前所述8。热烫,加热的容器和热交换器之间的主要区别是,热烫施加到完整叶片在过程的早期,而OT她的被施加到植物提取物( 图1)。
图 1: 工艺流程图图解三种不同方法进行烟草HCP热沉淀实施植物材料洗净,澄清和纯化前均化。用于漂白步骤(红色)的设备可以很容易地添加到现有的机械。相比之下,使用搅拌容器(橙色)和特别是换热器(蓝色)需要一个或几个额外的设备和管道。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Protocol
1.培育烟草的研究
- 冲洗的去离子水1〜2升,随后每矿棉块用1L 0.1%[w / v的]肥料溶液。将在每个矿棉块的一个烟草种子和0.25升的肥料溶液冲洗轻轻没有洗去种子16。
- 培育7周的烟草植株中,用70%相对湿度的温室中,16小时的光周期(180微摩尔仲丁基- 1米 - 2;λ= 400 - 700 nm),而一个25/22℃的光照/黑暗温度制度。
- 收获所有树叶以外的四个子叶叶子,分别位于在植物茎的基部。
2.可选:热沉淀通过热烫
注:执行,以便通过热烫沉淀烟草医疗专业人员在步骤2.1中所述2.12的步骤。跳过整个部分2,如果医疗专业人员将沉淀在加热的容器(部分4)或使用热交换器(部分5)。
- 抛开50克植物材料并进行提取不热烫(第3节)。以这种提取物的样本为后续分析(第7条)过程中的内部控制。
- 设置一个8-L工作体积水浴, 例如 ,50×40×40厘米,在绝热发泡聚苯乙烯桶或类似。安装在水浴用于随后的温度控制(步骤2.7)的可调节的恒温器。
- 整个组件转移到磁性搅拌盘,并放置在水浴磁力搅拌棒。确保磁场足够强的旋转搅拌棒。
- 至少有四个支撑砖在其聚丙烯篮(步骤2.6)将被漂白过程中放置后环绕搅拌棒。确保支承瓦片由非磁性材料( 例如 ,不锈钢合金含有镍)制成,它们比搅拌棒( 图2)更高。
- 8升的去离子水加入到水浴中。
注意:使用的缓冲液, 例如 ,50mM磷酸钠(pH7.5)中,可以提高靶蛋白的产量,如果低pH沉淀是一 个问题。 - 放置一个23×23×23 5cm聚丙烯篮子在支撑瓷砖和确保篮不与搅拌棒旋转干扰,并且它是在液体中完全浸没。如果有必要,添加额外的水/缓冲,直到篮完全浸入,然后再取出篮筐。
注意:所有的后续步骤高达2.12涉及热液体的处理。包括佩戴隔热手套适当的个人防护装备。 - 使用可调节的恒温器以使水浴至70℃(或用于实验所需的温度)。等待至少15分钟达到后所要求的温度,以确保整个组件已经达到热表面升平衡。
- 准备从收获的烟草簧片150克一份。将一个等份在篮下,同时避免不可逆压缩和叶片损伤, 例如,通过撕裂。避免过量填充以植物材料或后者的致密填料篮筐。
- 小心,但很快淹没在篮下的热的液体,并将其放置在支撑瓷砖。放置在篮下,以防止漂浮顶部的不锈钢块。
- 孵育5分钟的叶子在漂白液,或选择时间相适应的实验设计。显示器在整个孵化期液体温度。
- 小心地从漂白液篮筐,让从叶子残留的液体排出,持续30秒。然后把植物的叶子筐而出,他们转移到搅拌机并立即开始提取(第3节)。
注:植物可以热烫后和第开始前保持延长的时间段ê提取, 例如,在冰上超过30分钟或在-20℃冷冻几个星期已经成功地测试。然而,产品稳定性可能随储存时间,因此建议立即处理下滑。 - 直到整个收获的生物质进行处理,重复步骤2.8至2.11与新鲜叶材料。
3.从烟叶中提取的蛋白质
注意:以下步骤涉及与旋转叶片搅拌机。而它安装在搅拌器马达在搅拌器桶不工作。
- 放置收获(步骤1.3)或热烫(步骤2.11)150克(湿质量)叶在搅拌器和添加450毫升提取缓冲液(50mM磷酸钠,500mM的氯化钠,10mM的亚硫酸氢钠,pH值8.0)。
注意:提取缓冲液组成取决于要提取的蛋白上,并因此可能需要调整, 例如 ,另一个pH值的使用或缓冲组分,如TR是。 - 30秒穿插场所均质叶片3×30秒脉冲。确保叶子混匀后,不堵塞果汁桶。停止搅拌器并提起叶如有必要,以防止堵塞,然后继续同质化。
- 就拿这对于后续的分析(第7条)生产的每提取1毫升样品。如果该植物材料烫,继续部分6。否则,在一个容器中热沉淀(第4节)或热交换器(部分5)继续,这取决于所选择的实验方法。
4.可选:热火降水搅拌槽内
注:进行,以便在搅拌容器沉淀烟草医疗专业人员在4.2节到4.11描述的步骤。跳过整个部分4中,如果医疗专业人员已热烫(第2部分)中沉淀或将使用热交换器(第5部分)中沉淀。
- 设置了两个8-L工作体积的水浴, 例如,50×40×40厘米,在热绝缘聚苯乙烯泡沫塑料或类似。在第一次洗澡,挂载为后续的温度控制(步骤4.6)的可调恒温。在第二个中,添加5升去离子水和2kg冰随后的冷却(步骤4.9)的。
- 传送所述第一水浴上磁性搅拌板,以及2升不锈钢容器中放入水浴,使得容器的中心对准到搅拌板的中心。
- 放置在不锈钢容器中的磁性搅拌棒。确保磁场足够强的旋转搅拌棒。
- 填充去离子水的水浴中以5厘米的不锈钢容器的上边缘的下方。然后填充提取缓冲液的容器中。放置在容器的聚苯乙烯泡沫盖。
注意:所有的后续步骤高达4.9涉及热液体的处理。包括穿热插件适当的个人防护装备ulated手套。 - 通过在聚苯乙烯泡沫盖的西装料孔插入温度计入不锈钢容器中。设置水浴温度至78℃,并培育整个组件15分钟以达到热平衡。保证在容器中的温度为70℃,约8℃下的水浴的设定点以下。
- 如果在不锈钢容器中的温度从70℃不同,相应地调整水浴的温度,并让系统平衡另一个15分钟。重复此步骤直到在容器中的温度为70℃或根据需要进行实验,并清空不锈钢容器中。
- 倾300毫升提取物(步骤3.2)的入不锈钢容器中,而它仍然在水浴并启动计时器。搅拌该提取物在150rpm和孵育5分钟。确保了提取在此潜伏期达到70℃至少2分钟的温度。
- 除去从磁性搅拌器热水浴,取出不锈钢容器中,并将其放置在冰冷的桶。放置后者上磁力搅拌器和除去聚苯乙烯泡沫盖。
- 确保植物匀浆以150rpm充分搅拌,放置温度计提取物中孵育,直到达到20℃的温度下或通过实验设计规定的温度。
- 重复步骤所有等分4.7至4.9。取每个热的1ml样品沉淀提取一旦达到最终温度,然后与第6条进行。
5.可选:热火降水热交换器
注:进行以沉淀用热交换器烟草医疗专业人员在节5.2至5.12所述的步骤。跳过整节5,如果医疗专业人员已被漂白(第2节),或在加热容器(第4节)沉淀。
- 设置了两个8-L工作体积水浴, 例如,50×40×40厘米,在热绝缘聚苯乙烯泡沫塑料桶或相似。在第一次洗澡,挂载为后续的温度控制(步骤5.3)的可调恒温。在第二个中,添加5升去离子水和2kg冰随后的冷却(步骤5.10)的。
注意:所有的后续步骤高达5.9涉及热液体的处理。包括佩戴隔热手套适当的个人防护装备。 - 填用8L去离子水的第一水浴中。使用温控器温度设定为74.5℃。孵育组装15分钟才能达到热平衡。
- 通过将0.5升塑料烧杯到1升塑料烧杯制备绝缘储存容器和填充用脱脂棉的空白。或者,使用专用的隔热容器用0.5升工作体积。
- 热交换器连接到蠕动泵在一端,并在水净化的出口软管- [R结束使用L / S 24管子。放置两管道在隔热存储容器温度计端沿着并用300ml提取缓冲液( 图2)填充。
- 放置热交换器进入热水浴中,以300ml分钟-1的速度启动蠕动泵。保证在容器中产生的温度为70℃,水浴的设定点低于约4.5℃,3分钟后,
- 如果在绝缘容器中的温度由70℃的不同,相应地调整水浴的温度,并让系统平衡另外15分钟重复此步骤直至从环境提取缓冲液的温度上升至70℃,在不到3分钟,或等于该所需的实验,并清空不锈钢容器中。
- 从绝热容器丢弃提取缓冲液和制备的植物提取物的300ml等分试样。一个等分填充绝热容器。
- 泵通过热交换器的植物提取物(第3.3节)以300ml分钟-1 5分钟。确保该萃取温度为70℃3分钟后,或等于在实验设计中定义的温度。
- 5分钟后,将热交换器入冰冷水浴而提取仍在泵送。孵育在此设置,直到温度达到正好是20℃,或在实验设计中定义的温度。
- 移除连接到从绝缘容器中的蠕动泵的入口软管和继续泵送以从热交换器内收集余热沉淀植物提取物。然后停泵。
- 重复步骤所有等分5.7至5.10。每次取热沉淀提取物1毫升样品一旦达到最终温度,然后通过对提取物的袋式过滤(第6条)。
注意:在第一循环通过步骤5.7至5.10将没有提取缓冲液对丢弃在步骤5.7。
6.植物提取物的袋式除尘
- 装入袋滤器成装配到过滤器壳体,并提供了灵活的过滤材料的机械支撑的相应支撑篮。放置1升容器中的篮的下方,并在150毫升分钟-1的速率应用提取等分试样(3.3节,4.10或5.11,这取决于所选热处理)到袋。
- 过滤后,用浊度计测量1:10稀释滤液的浊度在提取缓冲液。
- 取1毫升样品和处理袋滤液作为在实验设计中定义, 例如,深度过滤和层析7,10。
7.样品分析
- 测量总可溶性蛋白(TSP)的使用Bradford方法24,25的数量。
- 一式三份,吸取2.5微升各样品成一个单一的孔96孔板中。包括一式三份8牛血清白蛋白(BSA)标准覆盖范围0 - 2000微克毫升-1。
- 加入200μlBradford试剂至各孔,并通过上下抽吸调匀而是轻轻足以避免形成气泡。
- 孵育10分钟,在22℃下并测量在分光光度计在595nm处的吸光度。计算基于通过BSA参考点的标准曲线对样品中的TSP浓度。
- 通过表面等离子体共振光谱26量化Vax8。
- 设置的表面等离子体共振仪器与4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)运行缓冲液(10mM HEPES,3mM的乙二胺四乙酸(EDTA),1500 5mM氯化钠,0.05%体积/体积的聚山梨醇酯20, pH为7.4),并装入羧甲基葡聚糖表面芯片到设备中。使用的主要功能冲洗系统和启动手动运行具有30的流速微升分钟-1以上流动池1和用25mM氢氧化钠60秒穿插注射2注入的30mM氯化氢60秒两次。
- 制备200微升的500微克毫升-1单克隆抗体5.2的10mM乙酸钠(pH 4.0)溶液。解冻1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的小瓶中,并以16,000 xg离心离心他们1分钟。混合70微升的EDC用70微升的NHS的和传送到7毫米的塑料小瓶中。
- 通过以10微升分钟-1的流速注入10分钟的EDC / NHS混合物在流动池1和2活化羧甲基化的葡聚糖表面芯片表面。
- 设置流仅小区2的流动路径。夫妇单抗5.2通过在10微升分钟-1的速度注入它为15分钟。
- 切换流路中流动单元1和2,并在5微升分钟-1停用的表面的速率注入乙醇胺7分钟。 ŧ母鸡注入30mM的氯化氢两次60秒用25mM氢氧化钠60秒穿插注射。
- 注入样品和MSP1 - 19标准,在30微升min的速率为 180秒。确保Vax8浓度为50 - 1000毫升纳克-1。制备预稀释液在HEPES缓冲的含有EDTA和聚山梨醇酯20(HBSEP)如有必要,盐水。
- 从流通池2中减去流通池1中的峰值信号,并使用差来计算基于所述MSP 1的信号在采样Vax8浓度- 19注射用500纳克毫升-1的已知蛋白质浓度。
- 再生各样品或MSP 1后的芯片表面- 19喷射通过暴露于30mM的氯化氢60秒在30微升min的流速-1。
- 通过量化荧光光谱红色荧光蛋白
- 一式三份,吸管将50μl各样品的成黑色半芳的单个孔EA 96孔板。包括六个红色荧光蛋白标准覆盖范围0 - 225微克毫升-1。
- 使用530±30nm的激发滤光器和分光光度计590±35 nm的发射滤光器测量一式两份的荧光。计算基于通过DsRed的参考点的标准曲线对样品中的红色荧光蛋白浓度。
- 粒度分布的测定
- 洗试管用1毫升异丙醇中,然后用2ml的去离子水以去除灰尘粒子。吸管850微升样品放入试管。
- 放置反应杯插入ζ电位和粒度分析仪。打开“软件”,并开始与“蛋白质”的物质和“PBS”作为分散剂手动测量。选择25℃的温度下和180秒的平衡时间。
- 选择在173°的反向散射“DTS0012”细胞与措施。选中“自动”FUNCT离子的测量持续时间和选择三个测量与没有散布的延迟。
- 调查粒度分布峰轮廓一次测量是通过选择在实验视图样品的三次测量完成。选择“音量PSD”标签。
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Representative Results
由热烫烟草宿主细胞蛋白质热沉淀
在第2节中描述的漂白过程已成功用于从烟草与70℃的叶,96±1%减少对TSP沉淀医疗专业人员(N = 3),而回收到的Vax8靶蛋白的51%,从而增加了它的为0.1%至1.2%的纯度的色谱分离16之前。它也可以恢复荧光蛋白DsRed的83±1%(N = 3),从3.3%增加其纯度64.1%。热烫步骤容易地集成到一个标准的提取和澄清方案包括生物量洗涤,均质,包过滤和深度过滤的( 图1)7。制备预煮设备( 图2)中加入约5分钟到建立时间的澄清设备,这通常需要20分钟。另7分钟内需要执行完整叶片的除了45分钟的典型提取和澄清时间热烫。然而,只有2分钟的额外7分钟是实际的“动手”的时间。此外,小于1分钟的时间较短的温育时间是可能的,减少了热烫时间从7分钟到约3分钟。因此,热烫不仅增加在粗植物提取物的产品的初始纯度,但也迅速,没有额外的工艺设备完成,从而提供了替换的至少一个初始层析步骤的潜力。热烫浴温度保持不变, 即 ,<0.2℃的波动,在此期间即使是除了收获的叶其是在环境温度后,立即全部实验。这确保了过程是可重复的, 即 ,17%的变化的平均系数(24),在TSP减少,产品的产率和过滤能力在后续澄清步骤而言( 图3 9,它可以恢复甚至提高过滤能力后,加入絮凝剂蛋白提取8和助滤剂后加以解决。的60℃的温度足以除去80±3%(n = 3时)医疗专业人员的和增加Vax8纯度2.6±0.1倍(N = 3),而不会影响滤波器的容量。因此,HCP去除热烫是与具有适度的热稳定性, 即,熔融温度低于70℃27,28靶蛋白相容。然而,温度上升到70℃以上,可能导致一个HCP除去超过95%( 图3)。因为这允许最r的快速鉴定它是使用统计方法22进行的实验的相应集合中一个精心设计的方式有用elevant工艺参数, 即,加热时间和温度。同时,美国能源部方法生成的预测模型来促进过程优化16。
图2: 三种方法示意图设置沉淀烟草医疗专业人员在其 A.热烫是在与恒温器(T),其中被淹没包含完整叶片篮子加热的水浴中进行了完整叶片或摘录。的水浴搅拌以确保均匀和恒定的温度。B.将含有磁搅拌棒和叶提取物容器浸入水浴中。提取物中的温度监测,以确保所需要的温度达到了。C.一个热交换器(H)被连接到泵(P)和一个隔热存储媒体含有植物提取物ê船只。热交换器在水浴加热提取物监测的温度淹没。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3: 热火三沉淀方法展示他们的工艺性能的影响和两个靶蛋白的提纯的比较 。支撑去除医疗专业人员的90%以上的条件下,确定了热烫,一个搅拌容器和热交换器设置,所有这些都通过一个最小2.5倍的增加的靶蛋白Vax8和红色荧光蛋白的纯度和最多19倍,具有漂白效果最好的。相比之下,只有搅拌容器设置增加了subseq的容量用于澄清的热处理过的植物或提取物的uent深度过滤步骤。误差棒表示标准偏差(n = 3),B,不同的热处理条件后样品的HCP内容可以被分析并使用考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶进行比较。 RUBISCO(绿色箭头)与其他医疗专业人员如在热处理的温度上升一起除去,而红色荧光蛋白(红色箭头)留在溶液中。 *表示暴露于受热0.5分钟的样品,所有其他样品为3.0分钟以上处理。重新打印许可从16。 请点击此处查看该图的放大版本。
在搅拌容器医疗专业人员的沉淀热
热沉淀搅拌容器最多84±1%去除(N = 3)医疗专业人员,实现了纯度Ø˚F0.33±0.02%(n = 3时),用于Vax8和20.2±1.4%(N = 3)红色荧光蛋白( 图3)。热处理是在一个容器中从均化器中分离,以防止反射装置占用串联处理多个样品时的延迟进行。对于实验室规模的过程中所需的处理努力是类似于用于热烫但还需要额外的不锈钢容器中,一个专门的冷却步骤。此外,热传递到提取比热烫期间慢,以至少5分钟的温育时间, 也就是说,比热烫的10倍。延迟加热是由容器中,提出了一个附加的屏障传热引起的,而该更大〜300质量%被在容器由于提取缓冲除了植物生物量的存在下加热。沉淀的蛋白质也粘结到容器的壁,逐步建立一个附加的热传递屏障和增加的工作量需要后续清洁。设置水浴温度10°C以上用于在部分开放式系统的能量损失补偿热析出温度,达到了预期的提取温度。在对比热烫(部分2)和热交换器设置(部分5),HCP沉淀在容器由2.5倍增加下游深度过滤的能力,这反映在容器下部剪切力相比通过热抽提取交换器或热烫后的同质化,可能导致更大的聚集体较容易在袋过滤步骤去除。
在热交换器医疗专业人员的热沉淀
大约88.3±0.7%(N = 12)将HCP内容是一致的,从该提取物使用的温度范围内的热交换器除去60 - 70℃,Vax8实现的0.31±0.01%(12)的纯度和27。6±2.0%(N = 12),用于DsRed的( 图3)。变异系数平均为13%(N = 24),说明此程序的重复性比热烫甚至更好。所需的提取温度,如果水浴温度设定4.5℃以下后〜3分钟内达到。作为用于加热的容器中,加热处理后,需要一个专用的冷却步骤。热交换器涉及比其他方法更处理的努力,因为需要密集的清洁的泵送装置和热交换器由于该沉淀物附着于窄孔不锈钢管的壁。该热交换器还达到的最低下游深度过滤器的容量,堵塞之前澄清只有13.5±6.0(n = 3时)L-米-2。
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Discussion
以上所述的三种方法为热沉淀能有效地去除前的任何层析纯化步骤16,17烟草医疗专业人员。它们补充,旨在增加初始产品的纯度, 例如,吐水29,rhizosecretion 30或离心萃取31,32,所有这些都限于分泌蛋白的其他策略。但是,基于热的方法只能在一个有意义的方式使用,如果待纯化的目的蛋白可承受〜60℃的最低析出温度超过1分钟。因此,在任何的三种方法的第一步骤是要设计一个靶分子具有足够高的熔融温度,这已经描述为包括不同的域的几个疟疾疫苗的候选蛋白从几个恶性疟原虫抗原16,18,21。一旦目标蛋白质的热稳定性已经证明,人们可以基于可用的设备和介质,预期的最终处理的规模和随后的DSP操作16进行选择的三种方法。
热烫是最快的方法和附加设备的要求进行最小的,所以它可以很容易被实现成用于来自植物的重组蛋白现有的实验室规模的纯化方案。热烫液体彻底搅动是影响HCP沉淀的同时基于经验数据和理论计算21,33效率的重要工艺参数。不能达到良好的混合可以削弱传热和结果仅在局部的HCP的去除,这反过来又可以是有害的产品,如果宿主蛋白酶保持活性21,34。若干其他参数也可以影响HCP沉淀, 例如,加热温度和温育时间,因此一个能源部的方法可能是有用的表征最相关的发构建函数,并提供预测模型来量化的,如产品纯度,恢复和随后的步骤DSP 22的性能响应它们的影响。
在容器中设置,要求更长的温育时间,以达到完全的HCP沉淀,这可能会增加不希望的靶蛋白质变性的反映了长期暴露于高温下的可能性。在容器中更彻底的混合可以改善热传递和降低加热持续时间。在此设置长的升温也可以是具有挑战性的,如果在提取蛋白酶21,34最终热灭活之前变得更加活跃,造成产品损失。
对船舶设置观察到的深度增加过滤能力可以帮助减少耗材成本,允许在一个项目有一个固定的预算处理的样品数量较多或减少对给定experim的总体资金需求经济需求测试。然而,该益处可通过附加容器的成本,如果几个提取运行在一系列的实验中, 如需要这是必要的,除了将均化器,以防止引入过程保持步骤所抵消,作为美国能源部的一部分做法。如果一个更密集的混合制度是用来减少加热时间如上面所建议的过滤能力的积极效果也可能降低。
专用冷却步骤都是必要的基于提取物的热沉淀方法中,不仅需要额外的资源,而且还延长每样本的总处理时间,这也可以用流利能源部程序或在一般实验序列相抵触。该热交换器设置是公从工程角度35特征,可以容易地设计并调整为特定的温度差,与此相反的容器中,其中比例最多的表面与体积比的变化。怎么样以往,一旦热交换器大小被定义,它可以是难以调整到替代的温度差,因为它的长度,从而传热面积是固定的。
改变其它参数,如停留时间(或流速)和热交换器介质的温度,可以恢复的灵活性,以一定的程度,但只在小规模的实验,因为这些因素通常在窄窗口中,由于过程规模的操作操作由现有的设备和媒体强加的限制。 5分钟和40的温度差 - - 为3短温育时间的组合的需求60℃变得越来越困难在设备级作为处理规模增大到解决,因为在热交换器的尺寸变大。这是用于冷却步骤尤其如此,因为该介质和所需的提取温度之间的温度差通常较小(ΔT= 10〜15℃)比加热步骤(ΔT= 20-40℃)产生较大的设备尺寸或更长的冷却时间。
在未来,该协议可以适于比其在此研究中对热稳定性进行了专门设计的疫苗候选物的其他生物制药的蛋白质。许多抗体可承受> 70℃36,37这已经是与当前的热处理协议兼容的温度。这种自然的热稳定性可进一步通过设计不同的抗体结构域38,从而增加了可以进行这里介绍的方法(及其变型)的蛋白质的数量增加。漂白方法已经应用于表达单克隆抗体(2G12)17中一直没有受到选择的热稳定性或蛋白质工程转基因烟草植株。在65℃下热处理通过的系数提高该抗体的纯度色谱纯化之前两同时回收率为类似于未经热烫观察。
此外,表征的表达系统的各个HCP熔融温度可以促进与该过程可以进行类似于牛奶巴氏消毒的温度下的识别:高温,短时间39。热处理(除热烫)也可应用到其他的生物的起始原料以除去医疗专业人员,如果该产品可承受所需的温度。后者可以从如果正在处理的其他表达平台如哺乳动物细胞培养物上清液在这里讨论的那些偏离。在任何情况下,成本效益比,应考虑到, 也就是,不降低HCP水平的利益大于用于实现热处理步骤导致额外的投资成本费用,增加了处理时间,并且可以降低产品一愕LD 16。在这方面的一个关键参数是该产品的活性。如果它取决于线性表位作为用于一些基于蛋白的疫苗的情况下,则热处理不太可能有一个作用40。相反,如果蛋白质结构是重要的, 例如,对于构象表位,氨基酸侧链中的酶的活性位点的精确定向或抗体的互补性的正确折叠决定 区,热处理可与蛋白质活性41,42干扰。因此,合适的分析测定法应建立在热处理之前和之后监测产品的性能。
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Disclosures
作者有没有利益冲突披露。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
Blender | Waring | 800EG | Blender |
BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
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