Summary
Trois chaleur des procédés de précipitation sont présentées qui éliminent efficacement plus de 90% des protéines de la cellule hôte (SPH) de tabac extrait avant toute autre étape de purification. L'usine RSG agréger de manière irréversible à des températures supérieures à 60 ° C.
Abstract
Les plantes fournissent non seulement la nourriture, l'alimentation et des matières premières pour l'homme, mais ont également été mis au point en tant que système de production économique pour les protéines biopharmaceutiques, tels que des anticorps, des vaccins candidats et des enzymes. Ceux-ci doivent être purifiés à partir de la biomasse des plantes, mais des étapes de Chromatographie sont gênées par les concentrations élevées de protéines de cellule hôte (HCP) dans les extraits de plantes. Cependant, la plupart des professionnels de la santé agrégées de manière irréversible à des températures supérieures à 60 ° C facilitant la purification ultérieure de la protéine cible. Ici, trois méthodes sont présentées pour obtenir la précipitation de la chaleur des RSG de tabac soit dans des feuilles intactes ou des extraits. Le blanchissement des feuilles intactes peut facilement être incorporé dans les processus existants, mais peut avoir un impact négatif sur les étapes subséquentes de filtration. L'inverse est vrai pour la précipitation de la chaleur des extraits de feuilles dans un récipient agité, ce qui peut améliorer la performance des opérations en aval mais avec des changements majeurs dans la conception de l'équipement de procédé, tels quela géométrie de la homogénéisateur. Enfin, une configuration de l'échangeur de chaleur est bien caractérisée en termes de conditions de transfert de chaleur et facile à l'échelle, mais le nettoyage peut être difficile et il peut y avoir un impact négatif sur la capacité du filtre. L'approche de conception-de-expériences peut être utilisé pour identifier les paramètres de processus les plus pertinents affectant l'élimination des HCP et la récupération du produit. Ceci facilite l'application de chaque méthode dans d'autres plates-formes d'expression et l'identification de la méthode la plus appropriée pour une stratégie de purification donné.
Introduction
Les systèmes de santé modernes dépendent de plus en plus sur les protéines biopharmaceutiques 1. La production de ces protéines dans les plantes est avantageuse en raison de la charge pathogène faible et une plus grande évolutivité par rapport aux systèmes d'expression classiques 2-4. Cependant, le traitement en aval (DSP) de produits pharmaceutiques d'origine végétale peut être difficile parce que les procédures d'extraction perturbateurs se traduisent par une charge élevée de particules, dont la turbidité dépassant 5.000 unités néphélométriques de turbidité (NTU), et de la protéine de la cellule hôte (HCP) concentrations dépassant souvent 95 % [m / m] 5,6.
Procédures de clarification Elaborate sont nécessaires pour éliminer les particules dispersées 7-9, mais l' équipement de chromatographie est moins coûteux à exploiter en mode bind-et-éluent lors de la récupération initiale du produit s'il y a une étape antérieure pour l'élimination efficace des professionnels de la santé 10,11. Ceci peut être réalisé soit par précipitation de la protéine cible à l'aide flocculfourmis 12 ou à faible pH 13,14, ainsi que par l' origine du RSG pour agréger. L'agrégation sélective de la ribulose-1,5-biphosphate carboxylase / oxygénase (RuBisCO), le HCP le plus abondant dans les plantes vertes telles que le tabac (Nicotiana tabacum), peut être favorisée par l' addition de polyéthylène - glycol 15, mais ceci est coûteux et incompatible avec un grand fabrication -scale. Le traitement thermique a été montré pour dénaturer et précipiter plus de 95% des professionnels de la santé du tabac, tandis que les vaccins candidats protéines telles que le paludisme Vax8 demeurent stables en solution 16-18.
Trois approches différentes ont été utilisées pour réaliser la précipitation induite par la chaleur des professionnels de la santé du tabac (i) de blanchiment, à savoir l'immersion des feuilles intactes dans un liquide chaud, (ii) une température contrôlée récipient sous agitation, et (iii) un échangeur de chaleur ( Figure 1) 16. Pour des feuilles intactes, Blanchir atteint la précipitation rapide et efficace des professionnels de la santé et a été également facileà l' échelle et compatible avec les procédés de fabrication à grande échelle existantes qui comprennent une étape initiale pour laver la biomasse végétale 19. En revanche, les navires à température contrôlée sont déjà disponibles dans certains procédés , et peuvent être utilisés pour le traitement thermique d'extraits de plantes 20, mais leur évolutivité et une vitesse de transfert d'énergie sont limitées parce que le rapport de la surface au volume des réservoirs est réduite progressivement et devient impropre à l'échelle du processus. Un échangeur de chaleur est une alternative techniquement bien défini pour chauffer des cuves agitées , mais nécessite une offre abondante de chauffage et de milieux de refroidissement, par exemple, de la vapeur et de l' eau froide, ainsi qu'un débit volumétrique étroitement contrôlé qui est adaptée à la géométrie de l' échangeur de chaleur et propriétés des médias, par exemple., la capacité thermique spécifique. Cet article montre comment les trois méthodes peuvent être utilisées pour la précipitation induite par la chaleur des RSG du tabac, et RSG végétales en général. La mise en place et le fonctionnement de each méthode dans un environnement de laboratoire peut être utilisé pour évaluer leur aptitude à des processus à plus grande échelle. Le principal défi consiste à identifier les modèles à échelle réduite adéquates et les conditions de fonctionnement pour chaque opération qui ressemblent à des dispositifs et des conditions utilisées lors de la fabrication processus échelle. Les données présentées ici se réfèrent à des expériences menées avec des plants de tabac transgéniques exprimant le paludisme candidat vaccin Vax8 et protéine fluorescente DsRed 16, mais la méthode a également été appliquée avec succès à N. benthamiana plantes exprimant de manière transitoire 21 d' autres protéines biopharmaceutiques.
A expériences de conception-de-(DoE) approche 22 peut faciliter le processus de développement, et de floculants 23 peut également être bénéfique dans ce contexte comme décrit précédemment 8. La principale différence entre le blanchiment, les navires chauffés et des échangeurs de chaleur est que blanchissement est appliquée à des feuilles intactes au début du processus alors que le otla sienne sont appliqués aux extraits de plantes (figure 1).
Figure 1:. Schéma de flux de processus illustrant la mise en œuvre de trois méthodes différentes pour le tabac HCP Heat Précipitation Le matériel végétal est lavé et homogénéisé avant clarification et purification. L'équipement pour l'étape de blanchiment (rouge) peut facilement être ajouté à la machine existante. En revanche, en utilisant un récipient agité (orange) et en particulier un échangeur de chaleur (bleu) nécessite un ou plusieurs dispositifs supplémentaires et les tubes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocol
1. Cultiver les plantes de tabac
- Rincer chaque bloc de laine minérale avec 1 à 2 litres d'eau déminéralisée, puis avec 1 L de 0,1% [p / v] Solution d'engrais. Placez une graine de tabac dans chaque bloc de laine minérale et rincer doucement avec 0,25 L de solution d'engrais sans se laver la postérité 16.
- Cultiver les plants de tabac pendant 7 semaines dans une serre avec 70% d' humidité relative, 16 h photopériode (180 pmol sec - 1 m - 2; λ = 400 - 700 nm) et un sombre régime 25/22 ° C lumière / température.
- Récolter toutes les feuilles sauf les quatre feuilles de cotylédons, qui sont situés à la base de la tige de la plante.
2. Facultatif: Heat Précipitation par Blanchir
REMARQUE: Effectuez les étapes décrites dans les étapes 2.1 à 2.12 pour précipiter RSG du tabac par le blanchiment. Passer toute la section 2, si les RSG seront précipitésdans un récipient chauffé (section 4) ou en utilisant un échangeur de chaleur (section 5).
- Mettre de côté 50 g de matériel végétal et de procéder à l'extraction sans blanchissement (section 3). Prélever un échantillon de cet extrait comme un contrôle interne lors de l'analyse ultérieure (section 7).
- Mettre en place un bain de 8 litres de volume de travail de l' eau, par exemple, 50 x 40 x 40 cm, dans un seau en mousse de polystyrène à isolation thermique ou similaire. Monter le thermostat réglable sur le bain d'eau pour réguler la température suivante (étape 2.7).
- Transférer la totalité de l'ensemble sur une plaque d'agitation magnétique et placer une barre d'agitation magnétique dans le bain d'eau. Assurez-vous que le champ magnétique est assez forte pour faire tourner la barre d'agitation.
- Entourez la barre d'agitation avec au moins quatre tuiles de support sur lequel un panier de polypropylène (étape 2.6) sera placé plus tard au cours de la procédure de blanchissement. Assurez - vous que les tuiles de support sont fabriqués à partir d' un matériau non magnétique (par exemple, un alliage d'acier inoxydable contenant du nickel) et qu'ilssont plus élevés que la barre d'agitation (Figure 2).
- Ajouter 8 litres d'eau déminéralisée dans le bain d'eau.
NOTE:. L' utilisation d' un tampon, par exemple, le phosphate de sodium 50 mM (pH 7,5), peut améliorer les rendements en protéines cible si faibles précipitations de pH est un problème. - Placez un cm en polypropylène panier 23 x 23 x 23 sur les tuiles de soutien et assurez-vous que le panier ne pas interférer avec la rotation de la barre d'agitation et qu'il est complètement immergé dans le liquide. Si nécessaire, ajouter plus d'eau / tampon jusqu'à ce que le panier est complètement immergée, puis retirer le panier à nouveau.
ATTENTION: Toutes les étapes ultérieures de 2.12 impliquent la manipulation de liquide chaud. Porter un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants isolés thermiquement. - Utiliser le thermostat réglable pour amener le bain d'eau à 70 ° C (ou la température requise pour les expériences). Attendre au moins 15 minutes après que la température désirée est atteinte pour assurer la totalité de l'ensemble a atteint un thermal 'équilibre.
- Préparer des aliquotes 150 g de feuilles de tabac récoltées. Placer une aliquote dans le panier , tout en évitant la compression irréversible et les dégâts sur les feuilles, par exemple par déchirure. Évitez de trop remplir le panier avec du matériel végétal ou d'un empilement dense de ce dernier.
- Soigneusement mais rapidement plonger le panier dans le liquide chaud et placez-le sur les tuiles de soutien. Placer un bloc d'acier inoxydable sur le dessus du panier afin d'éviter la flottation.
- Incuber les feuilles pendant 5 min dans le liquide de blanchiment, ou sélectionnez un temps convenant à la conception expérimentale. Surveiller la température du liquide pendant la totalité de la période d'incubation.
- Retirez délicatement le panier du fluide blanchissement et laisser résiduelle fuite liquide à partir des feuilles pendant 30 secondes. Prendre ensuite la plante laisse de la corbeille, les transférer dans le mélangeur et commencer immédiatement l'extraction (section 3).
NOTE: Les plantes peuvent être conservés pendant de longues périodes de temps après la décoloration et avant le début de the extraction, par exemple, plus de 30 minutes sur la glace ou congelé à -20 ° C pendant plusieurs semaines a été testé avec succès. Cependant, la stabilité du produit peut diminuer avec l'augmentation des temps de stockage et donc un traitement immédiat est recommandé. - Répétez les étapes 2.8 à 2.11 avec un matériau de feuille fraîche jusqu'à ce que la totalité de la biomasse récoltée est traitée.
3. Extraction des protéines de feuilles de tabac
ATTENTION: Les prochaines étapes impliquent un mélangeur avec des lames rotatives. Ne pas travailler dans le seau de mélangeur lorsqu'il est monté sur le moteur du mélangeur.
- Placer 150 g (masse humide) de la récolte (étape 1.3) ou blanchies (étape 2.11) des feuilles dans le mélangeur et ajouter 450 ml de tampon d'extraction (phosphate de sodium 50 mM, chlorure de sodium 500 mM, du disulfite de sodium 10 mM, pH 8,0).
REMARQUE: La composition du tampon d'extraction dépend de la protéine à extraire et peut donc nécessiter un ajustement, par exemple, l' utilisation d'un tampon de pH ou de composant tel que Trest. - Homogénéiser les feuilles pendant 3 x 30 impulsions par seconde avec 30 sec entrecoupé des pauses. Veiller à ce que les feuilles sont homogénéisés et ne bouchent pas le godet mélangeur. Arrêter le mélangeur et soulever les feuilles pour éviter le colmatage si nécessaire, et ensuite continuer l'homogénéisation.
- Prenez un échantillon de 1 ml de chaque extrait qui est produit pour une analyse ultérieure (section 7). Si le matériel végétal est blanchies, passez à la section 6. Sinon continuer la précipitation de la chaleur dans un récipient (section 4) ou de l'échangeur de chaleur (section 5), en fonction de l'approche expérimentale sélectionnée.
4. Facultatif: Heat Précipitation dans un navire Brassé
REMARQUE: Effectuer les étapes décrites dans les sections 4.2 à 4.11 afin de précipiter RSG du tabac dans un récipient agité. Passer toute la section 4, si RSG ont été précipités par blanchissement (section 2) ou seront précipités en utilisant un échangeur de chaleur (section 5).
- Mettre en place deux 8-L d'eau du volume de travailbains, par exemple, 50 x 40 x 40 cm, en mousse de polystyrène thermiquement isolé ou similaire. Dans le premier bain, monter le thermostat réglable pour le réglage de la température subséquente (étape 4.6). Dans le second, ajouter 5 litres d'eau déminéralisée et 2 kg de glace pour le refroidissement ultérieur (étape 4.9).
- Transférer le premier bain d'eau sur une plaque d'agitation magnétique et placer le récipient en acier inoxydable de 2 L dans le bain d'eau de telle sorte que le centre du récipient est aligné sur le centre de la plaque d'agitation.
- Placez une barre d'agitation magnétique dans le récipient en acier inoxydable. Assurez-vous que le champ magnétique est assez forte pour faire tourner la barre d'agitation.
- Remplir le bain d'eau avec de l'eau déminéralisée à 5 cm en dessous du bord supérieur du récipient en acier inoxydable. Ensuite, remplissez le récipient avec un tampon d'extraction. Placer un couvercle en mousse de polystyrène sur le navire.
ATTENTION: Toutes les étapes ultérieures jusqu'à 4.9 impliquent la manipulation de liquide chaud. Porter un équipement de protection individuelle approprié, y compris ins thermiquementgants menté. - Insérer un thermomètre dans le récipient en acier inoxydable à travers un trou dans le couvercle draperie en mousse de polystyrène. Régler la température du bain d'eau à 78 ° C et laisser incuber la totalité de l'ensemble pendant 15 minutes pour atteindre l'équilibre thermique. Faire en sorte que la température dans le récipient est de 70 ° C à environ 8 ° C en dessous du point le bain d'eau réglé.
- Si la température dans le récipient en acier inoxydable est différent de 70 ° C, régler la température du bain d'eau en conséquence et laisser le système équilibrer pendant encore 15 minutes. Répéter cette étape jusqu'à ce que la température dans le récipient est de 70 ° C ou selon les besoins de l'expérience, et vider la cuve en acier inoxydable.
- Verser 300 ml d'extrait (étape 3.2) dans le récipient en acier inoxydable pendant qu'il est encore dans le bain d'eau et de démarrer une minuterie. Incorporer l'extrait à 150 rpm et incuber pendant 5 min. Faire en sorte que l'extrait atteigne une température de 70 ° C pendant au moins 2 minutes au cours de cette période d'incubation.
- Retirer le bain d'eau chaude à partir de l'agitateur magnétique, retirez la cuve en acier inoxydable et le placer dans le seau à glace. Placez ce dernier sur l'agitateur magnétique et retirez le couvercle de mousse de polystyrène.
- Faire en sorte que l'homogénat de plante est bien agité à 150 tours par minute, placer le thermomètre dans l'extrait et laisser incuber jusqu'à ce qu'il atteigne une température de 20 ° C ou à la température indiquée par la conception expérimentale.
- Répéter les étapes 04.07 à 04.09 pour toutes les aliquotes. Prenez un échantillon de 1 ml de chaque chaleur précipité extrait une fois qu'il a atteint la température finale, puis passez à l'article 6.
5. Facultatif: Heat Précipitation dans un échangeur de chaleur
REMARQUE: Effectuer les étapes décrites dans les sections 5.2 à 5.12 afin de précipiter RSG de tabac en utilisant un échangeur de chaleur. Passer toute la section 5, si RSG ont été précipités par blanchissement (section 2) ou dans un récipient chauffé (section 4).
- Mettre en place deux volumes de travail 8-Lbains d'eau, par exemple, 50 x 40 x 40 cm, en polystyrène seaux en mousse à isolation thermique ou similaire. Dans le premier bain, monter le thermostat réglable pour le réglage de la température subséquente (étape 5.3). Dans le second, ajouter 5 litres d'eau déminéralisée et 2 kg de glace pour le refroidissement ultérieur (étape 5.10).
ATTENTION: Toutes les étapes ultérieures jusqu'à 5,9 impliquent la manipulation de liquide chaud. Porter un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants isolés thermiquement. - Remplissez le premier bain d'eau avec 8 litres d'eau déminéralisée. Réglez la température à 74,5 ° C en utilisant le thermostat. Incuber l'ensemble pendant 15 minutes pour atteindre l'équilibre thermique.
- Préparer un récipient de stockage isolé en plaçant un 0,5-L bêcher en plastique dans un 1-L bêcher en plastique et combler les lacunes avec de la laine de coton. Vous pouvez également utiliser un récipient isolé thermiquement dédié avec un volume de travail de 0,5 L.
- Relier l'échangeur de chaleur à la pompe péristaltique à une extrémité et à un tuyau de sortie de la other fin en utilisant L / S 24 tubes. Placer les deux extrémités de tubage le long d'un thermomètre dans le récipient de stockage isolé et le remplir avec un tampon d'extraction 300 ml (Figure 2).
- Placez l'échangeur de chaleur dans le bain d'eau chaude et démarrer la pompe péristaltique à un débit de 300 ml min -1. Faire en sorte que la température qui en résulte dans le récipient est de 70 ° C à environ 4,5 ° C en dessous du point le bain d'eau réglé, après 3 min.
- Si la température dans la cuve à isolation diffère de 70 ° C, régler la température du bain d'eau en conséquence et laisser le système équilibrer pendant encore 15 minutes. Répéter cette étape jusqu'à ce que la température du tampon d'extraction augmente de la température ambiante à 70 ° C en moins de 3 minutes, ou égale à celle requise pour l'essai, et vider la cuve en acier inoxydable.
- Jeter le tampon d'extraction de la cuve isotherme et préparer des aliquotes de 300 ml de l'extrait végétal. Remplir le récipient avec une aliquote isolée.
- Pomper l'extrait de plante (section 3.3) à travers l'échangeur de chaleur à 300 ml min -1 pendant 5 min. Faire en sorte que la température d'extraction est de 70 ° C au bout de 3 min, ou égale à la température définie dans la conception expérimentale.
- Après 5 min, placer l'échangeur de chaleur dans le bain d'eau glacée tandis que l'extrait est toujours en cours de pompage. Laisser incuber dans ce milieu jusqu'à ce que la température atteigne exactement 20 ° C ou à la température définie dans la conception expérimentale.
- Retirer le tuyau d'entrée relié à la pompe péristaltique du récipient isolé et continuer le pompage résiduel pour recueillir un extrait végétal chaleur précipité à partir de l'échangeur de chaleur. Ensuite, arrêter la pompe.
- Répéter les étapes 5.7 à 5.10 pour toutes les aliquotes. Prenez un échantillon de 1 ml de chaque extrait de chaleur précipité une fois qu'il a atteint la température finale, puis transmettre les extraits à sac de filtration (section 6).
Remarque: après un premier cycle à travers les étapes 05.07 à 05.10 il n'y aura pas de tampon d'extractionjeter à l'étape 5.7.
6. Sac de filtration de l'extrait végétal
- Monter un filtre à sac dans le panier de support correspondant qui est monté dans le boîtier de filtre et fournit un support mécanique pour le matériau filtrant flexible. Placez un récipient de 1 L sous le panier et appliquer les aliquotes d'extrait (de la section 3.3, 4.10 ou 5.11 selon le traitement thermique choisi) à la poche à un débit de 150 ml min -1.
- Après filtration, on mesure la turbidité d'une dilution 1:10 du filtrat dans un tampon d'extraction à l'aide du turbidimètre.
- Prenez un échantillon de 1 ml et traiter le sac filtrat tel que défini dans le plan expérimental, par exemple, la filtration en profondeur et Chromatographie 7,10.
7. Analyse de l'échantillon
- Mesurer la quantité de protéine totale soluble (TSP) en utilisant la méthode de Bradford 24,25.
- En trois exemplaires, pipette 2,5 pi de chaque échantillon dans les puits individuels d'uneplaque de 96 puits. Inclure huit sérum - albumine bovine (BSA) normes en triple exemplaire , couvrant la gamme 0 - 2,000 pg ml -1.
- Ajouter 200 ul de réactif Bradford chaque puits et mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas, mais assez doucement pour éviter la formation de bulles.
- Incuber pendant 10 min à 22 ° C et on mesure l'absorbance à 595 nm dans un spectrophotomètre. Calculer la concentration de TSP dans les échantillons sur la base d'une courbe d'étalonnage à travers les points de référence BSA.
- Quantifier Vax8 par plasmon de surface 26 spectroscopie de résonance.
- Configurer l'appareil de la surface de la résonance plasmonique de 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) exécutant un tampon (10 mM d'HEPES, l'acide éthylènediaminetétraacétique 3 mM (EDTA), le chlorure de sodium mM 1,500, 0,05% v / v de polysorbate 20, pH 7,4) et monter une puce de surface dextran carboxyméthylé dans le dispositif. Utilisez la fonction première pour purger le système et commencer une course manuelle avec un taux de 30 fluxmin -1 ul sur des cellules d'écoulement 1 et 2. Injecter 30 mM de chlorure d'hydrogène à deux reprises pendant 60 secondes avec 60 secondes par injection intercalés d'hydroxyde de sodium à 25 mM.
- Préparer 200 pi de 500 pg ml - 1 de mAb 5,2 solution dans de l' acétate de sodium 10 mM (pH 4,0). Décongeler 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et du N - hydroxysuccinimide (NHS) et des flacons à centrifuger les 16 000 x g pendant 1 min. Mélanger 70 pi d'EDC avec 70 pi de NHS et transférer dans un flacon en plastique de 7 mm.
- Activer la surface de la puce de la surface de dextran carboxyméthylé en injectant le mélange EDC / NHS sur des cellules d'écoulement 1 et 2 pendant 10 min avec un débit de 10 min -1 ul d'écoulement.
- Définir le chemin d'écoulement vers la cellule 2 que l'écoulement. Couple mAb 5.2 en l' injectant pendant 15 min à une vitesse de 10 pi min -1.
- Mettez le chemin d'écoulement à l' écoulement des cellules 1 et 2 et injecter éthanolamine pendant 7 min à une vitesse de 5 pi min -1 pour désactiver la surface. Then injectent 30 mM de chlorure d'hydrogène à deux reprises pendant 60 secondes avec 60 secondes par injection intercalés d'hydroxyde de sodium à 25 mM.
- Injecter les échantillons et MSP1 - normes 19 à un taux de 30 min pi -1 pour 180 sec. Assurez -vous que la concentration Vax8 est de 50 - 1000 ng ml -1. Préparer pré-dilutions en HEPES solution saline tamponnée contenant de l'EDTA et de polysorbate 20 (HBSEP) si nécessaire.
- Soustraire le signal de crête de la cellule d'écoulement 1 de celle de la cellule d'écoulement 2 et utiliser la différence pour calculer la concentration Vax8 dans des échantillons en fonction du signal de MSP 1 - injection 19 avec une concentration en protéine connue de 500 ng ml - 1.
- Régénérer la surface de la puce après chaque échantillon ou MSP 1-19 injection par l' exposition à 30 mM de chlorure d'hydrogène pendant 60 secondes à une vitesse de 30 min ul d'écoulement -1.
- Quantifier DsRed par spectrométrie de fluorescence
- En trois exemplaires, pipette 50 ul de chaque échantillon dans les puits individuels d'une demi-ar noirea plaque de 96 puits. Inclure six normes DsRed couvrant la gamme 0 - 225 pg ml -1.
- Mesurer la fluorescence en double en utilisant un filtre à 530 ± 30 nm d'excitation et un filtre d'émission de 590 ± 35 nm dans un spectrophotomètre. Calculer la concentration DsRed dans les échantillons sur la base d'une courbe standard par les points de référence DsRed.
- Détermination de la distribution des tailles de particules
- Laver une cuvette avec 1 ml d'isopropanol, puis avec 2 ml d'eau déminéralisée pour éliminer les particules de poussière. Introduire à la pipette 850 ul de l'échantillon dans la cuvette.
- Placez la cuvette dans le potentiel et particules analyseur zeta de taille. Ouvrez le «Logiciel» et démarrer une mesure manuelle avec "Protein" en tant que matière et "PBS" comme dispersant. Sélectionner une température comprise entre 25 ° C et un temps d'attente de 180 s.
- Choisissez la cellule "DTS0012" et la mesure à 173 ° rétrodiffusion. Cochez la case "auto" fonction pendant la durée de mesure et de sélectionner trois mesures sans retard intercalés.
- Enquêter sur la taille des particules de distribution de pointe profil une fois que la mesure est terminée en sélectionnant les trois mesures de l'échantillon dans la vue de l'expérience. Choisissez l'onglet "Volume PSD".
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Representative Results
La précipitation thermique des protéines cellulaires de tabac hôte par blanchissement
La procédure de blanchiment décrit dans la section 2. a été utilisé avec succès pour précipiter RSG de feuilles de tabac avec 70 ° C, ce qui réduit le FST de 96 ± 1% (n = 3) tout en récupérant jusqu'à 51% de la protéine cible Vax8, augmentant ainsi sa pureté de 0,1% à 1,2% avant la séparation chromatographique 16. Il a également été possible de récupérer 83 ± 1% (n = 3) de la protéine fluorescente DsRed, augmentant sa pureté de 3,3% à 64,1%. La procédure a été blanchissement facilement intégré dans un système d'extraction et de clarification classique consistant à laver la biomasse, l' homogénéisation, le sac de filtration et la filtration en profondeur (Figure 1) 7. Préparation de l'équipement blanchissement (Figure 2) a ajouté environ 5 min du temps de mise en place pour les dispositifs de clarification, ce qui prend habituellement 20 minutes. Un autre 7 min a été nécessaire pour effectuerle blanchissement des feuilles intactes, en plus du temps typique d'extraction et de clarification de 45 min. Cependant, seulement 2 min de la supplémentaire de 7 min était réelle "hands-on" le temps. En outre, de courtes durées d'incubation de moins de 1 min sont possibles, ce qui réduit le temps blanchissement de 7 min à environ 3 min. Par conséquent, le blanchiment augmente non seulement la pureté initiale d'un produit dans des extraits végétaux bruts, mais est également terminée rapidement avec aucun équipement de procédé supplémentaire, offrant ainsi la possibilité de remplacer au moins une étape de chromatographie initiale. La température du bain de blanchiment est restée constante, à savoir <0,2 ° C fluctuation, pendant toutes les expériences , même immédiatement après l'addition des feuilles récoltées qui étaient à température ambiante. Cela a permis le processus a été répété, à savoir, un coefficient moyen de variation de 17% (n = 24), en termes de réduction TSP, les rendements des produits et de la capacité de filtration dans les étapes ultérieures de clarification (Figure 3 8 et filtre aides après le sac de filtration 9, qui peut restaurer ou même augmenter les capacités de filtrage. Une température de 60 ° C est suffisante pour éliminer 80 ± 3% (n = 3) de HCP et d'augmenter la pureté de l'Vax8 2,6 ± 0,1 fois (n = 3) sans affecter la capacité du filtre. Par conséquent, l' élimination HCP par blanchissement est compatible avec les protéines cibles qui ont une stabilité à la chaleur modérée, à savoir une température de fusion inférieure à 70 ° C , 27,28. Cependant, l' augmentation de la température à 70 ° C ou plus peut entraîner une élimination HCP de plus de 95% (figure 3). Il était utile de procéder à l'ensemble correspondant d'expériences d'une manière bien conçue en utilisant une approche statistique 22 parce que cela a permis l'identification rapide des plus rparamètres de processus Elevant, à savoir, le temps de chauffage et de température. Dans le même temps, le procédé DoE a généré un modèle prédictif afin de faciliter l' optimisation des processus 16.
Figure 2: Configuration schématique des trois méthodes pour précipiter le tabac RSG en feuilles intactes ou extraits A. Blanchir a été réalisée dans un bain d'eau chauffée avec un thermostat (T) dans lequel un panier contenant des feuilles intactes a été submergée.. Le bain d'eau a été agité pour assurer une température homogène et constante. B. Un récipient contenant un barreau d'agitation et extrait de feuille magnétique a été immergé dans un bain d'eau. La température dans l'extrait a été contrôlé pour assurer que la température requise a été atteinte. C. Un échangeur de chaleur (H) a été relié à une pompe (P) et un ran calorifugéee récipient contenant l'extrait de plante. L'échangeur de chaleur a été immergé dans un bain d'eau et la température de l'extrait chauffé a été surveillé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Comparaison des trois méthodes Précipitation chaleur montrant leur effet sur le processus de performance et de la purification de deux protéines cibles A.. Conditions favorisant l'élimination de plus de 90% des professionnels de la santé ont été identifiés pour le blanchiment, une cuve agitée et une configuration de l'échangeur de chaleur, qui a augmenté la pureté des protéines cibles Vax8 et DsRed par un minimum de 2,5 fois et un maximum de 19 -fold, avec blanchissement plus performante. En revanche, seule la configuration du récipient agité a augmenté la capacité de la subsequent étape de filtration en profondeur utilisée pour la clarification des plantes ou des extraits de traités thermiquement. Les barres d'erreur indiquent l'écart - type (n = 3). B. La teneur en HCP des échantillons après différentes conditions de traitement thermique peuvent être analysés et comparés en utilisant des gels de Polyacrylamide colorés au Coomassie. RuBisCO (flèches vertes) est enlevée le long avec d'autres professionnels de la santé que la température pendant le traitement thermique augmente, alors que la DsRed (flèche rouge) reste en solution. * Indique un échantillon qui a été exposé à la chaleur pendant 0,5 min, tous les autres échantillons ont été traités pendant 3,0 min ou plus. Re-print avec la permission de 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Précipitation thermique des RSG dans un récipient agité
Un récipient agité pour la précipitation de la chaleur retirée au maximum de 84 ± 1% (n = 3) HCP, atteignant une pureté of 0,33 ± 0,02% (n = 3) pour Vax8 et 20,2 ± 1,4% (n = 3) pour la DsRed (figure 3). Le traitement thermique a été effectué dans un récipient séparé de l'homogénéisateur afin d'éviter des retards reflétant l'occupation de l'appareil lors du traitement d'échantillons multiples en série. L'effort de manutention nécessaire pour le processus en laboratoire était similaire à celle de blanchissement, mais un récipient en acier inoxydable supplémentaire et une étape de refroidissement dédié ont été nécessaires. En outre, le transfert de chaleur à l'extrait a été plus lente que pendant le blanchiment, avec des temps d'incubation d'au moins 5 minutes, soit 10 fois plus longue que pour le blanchiment. Le chauffage a été provoqué par un retard du navire, ce qui pose un obstacle supplémentaire au transfert de chaleur, et la masse ~ 300% plus grande qui a été chauffée dans le récipient en raison de la présence d'un tampon d'extraction, en plus de la biomasse végétale. Précipitation des protéines a également adhéré aux parois du récipient, la construction progressive d'un supplément barrière de transfert de chaleur et l'augmentation de l'effortrequis pour un nettoyage ultérieur. Réglage du bain d'eau température 8 ° C supérieure à la température utilisée pour la précipitation de chaleur compensé les pertes d'énergie dans le système partiellement ouvert et atteint la température de l'extrait souhaité. Contrairement à blanchissement (section 2) et la configuration de l'échangeur de chaleur (section 5), HCP précipitation dans un récipient accru la capacité de filtration en profondeur en aval de 2,5 fois, ce qui reflète les forces de cisaillement plus faibles dans le récipient par rapport au pompage extrait à travers la chaleur échangeur ou homogénéisation après blanchiment, résultant probablement dans les grands agrégats qui étaient plus faciles à enlever à l'étape sac de filtration.
Précipitation thermique de HCP dans un échangeur de chaleur
Environ 88,3 ± 0,7% (n = 12) de la teneur en HCP est constamment éliminé de l'extrait en utilisant un échangeur de chaleur dans la plage de température 60 - 70 ° C, obtenant une pureté de 0,31 ± 0,01% (n = 12) pour Vax8 et 27.6 ± 2,0% (n = 12) pour la DsRed (figure 3). Le coefficient moyen de variation est de 13% (n = 24) indiquant que la reproductibilité de ce procédé est encore mieux que le blanchiment. La température d'extraction désirée a été obtenue après environ 3 minutes si la température du bain d'eau a été réglé à 4,5 ° C au-dessus. En ce qui concerne le récipient chauffé, une étape de refroidissement spécifique a été nécessaire après le traitement thermique. L'échangeur de chaleur implique plus d'efforts de manipulation que les autres méthodes, car l'échangeur de l'appareil de pompage et de chaleur nécessaire à un nettoyage intensif en raison du précipité qui adhère aux parois du tube en acier inoxydable de calibre étroit. L'échangeur de chaleur a également atteint la capacité de filtration en profondeur en aval le plus bas, clarifiant seulement 13,5 ± 6,0 (n = 3) L m -2 avant le colmatage.
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Discussion
Les trois méthodes pour la précipitation de chaleur décrites ci - dessus peuvent éliminer efficacement RSG du tabac avant toute étape de purification chromatographique 16,17. Elles complètent d' autres stratégies visant à accroître la pureté initiale du produit, par exemple, guttation 29, rhizosecretion 30 ou centrifuge extraction 31,32, qui sont limitées à des protéines sécrétées. Cependant, les méthodes basées sur la chaleur ne peuvent être utilisés d'une manière significative si la protéine cible à purifier peut résister à la température de précipitation minimale de ~ 60 ° C pendant plus de 1 min. Par conséquent, la première étape dans l' une des trois méthodes consiste à concevoir une molécule cible avec une température de fusion suffisamment élevé, qui a été décrite pour plusieurs protéines candidates de vaccins contre le paludisme , comprenant des domaines différents de plusieurs antigènes de Plasmodium falciparum 16,18,21. Une fois que la stabilité thermique de la protéine cible a été démontrée, unedes trois méthodes peuvent être choisis en fonction de l'équipement disponible et les médias, l' échelle prévue finale du processus et les opérations de DSP ultérieures 16.
Blanchir a été le plus rapide des méthodes et des exigences d'équipement supplémentaires ont été minimes, de sorte qu'il peut être facilement mis en œuvre dans des protocoles de purification à l'échelle laboratoire existantes pour les protéines recombinantes d'origine végétale. Une agitation minutieuse du liquide de blanchiment est un paramètre important du processus qui affecte l'efficacité des HCP précipitation basée sur des données empiriques et des calculs théoriques 21,33. A défaut d'obtenir un bon mélange peut altérer le transfert de chaleur et le résultat que dans l' élimination partielle de HCP, qui à son tour peut être préjudiciable au produit si les protéases d'accueil restent actives 21,34. Plusieurs autres paramètres peuvent aussi affecter les précipitations HCP, par exemple, le temps de la température de chauffage et d' incubation, et une approche DoE peuvent donc être utiles pour caractériser la fa plus pertinentecteurs et fournir des modèles prédictifs afin de quantifier leurs effets sur les réponses telles que la pureté du produit, la récupération et la performance de la suite DSP étapes 22.
Dans la configuration du navire, les temps d'incubation plus longs ont été nécessaires pour obtenir la précipitation HCP complète, ce qui peut augmenter la probabilité d'une cible indésirable dénaturation des protéines qui reflète l'exposition prolongée à des températures élevées. Plus mélange complet dans le récipient pourrait améliorer le transfert de chaleur et de réduire la durée de chauffage. La longue rampe de température dans cette configuration peut également être difficile si protéases dans l'extrait 21,34 deviennent plus actifs avant dernière inactivation par la chaleur, ce qui provoque des pertes de produit.
La capacité accrue de filtration en profondeur observée pour la configuration du navire peut aider à réduire les coûts de consommables, permettant un plus grand nombre d'échantillons à traiter dans un projet avec un budget fixe ou en réduisant les besoins globaux de financement pour un ensemble donné de expériments. Toutefois, cet avantage peut être compensé par le coût du navire supplémentaire, ce qui est nécessaire en plus de l'homogénéisateur pour empêcher l'introduction d'étapes processus de maintien si plusieurs pistes d'extraction sont nécessaires dans une série d'expériences, par exemple, dans le cadre d'un DoE approche. L'effet positif sur la capacité du filtre peut aussi diminuer si un régime de mélange plus intensif est utilisé pour réduire les temps de chauffage comme suggéré ci-dessus.
Une étape de refroidissement dédié est nécessaire pour les deux procédés de précipitation de chaleur à base d'extrait, exigeant non seulement des ressources supplémentaires, mais aussi prolonger le temps de traitement global par échantillon, qui peut également entrer en conflit avec les procédures DoE fluides ou des séquences expérimentales en général. La configuration de l' échangeur de chaleur est bien caractérisé du point de vue de l' ingénierie 35 et peut facilement être conçu et mis à l' échelle pour les différences de température spécifiques, contrairement à la cuve, dont les changements de surface à volume de rapport au cours de mise à l' échelle. Commentde plus, une fois que la taille de l'échangeur de chaleur est défini, il peut être difficile d'ajuster les différences de température alternative, car sa longueur et donc la zone de transfert de chaleur sont fixes.
Modification d'autres paramètres, tels que le temps de séjour (ou le débit) et la température du milieu échangeur de chaleur, peut restaurer la flexibilité dans une certaine mesure, mais seulement dans des expériences à petite échelle parce que ces facteurs sont généralement exploités dans des fenêtres étroites dans les opérations à l'échelle du processus en raison des restrictions imposées par le matériel et les médias disponibles. La demande d'une combinaison de courtes durées d'incubation de 3 à 5 minutes et une différence de température de 40 - 60 ° C devient de plus en plus difficiles à résoudre au niveau de l'appareil en tant que l'augmentation d'échelle du procédé, car les dimensions de l'échangeur de chaleur devient plus importante. Cela est particulièrement vrai pour l'étape de refroidissement, car la différence de température entre le milieu et la température d'extraction désirée est souvent plus petite (AT = 10-15 ° C)que l'étape de chauffage (AT = 20-40 ° C) entraînant de grandes dimensions de l'équipement ou plus les temps de refroidissement.
À l'avenir, le protocole peut être adapté à des protéines biopharmaceutiques autres que des vaccins candidats qui, dans cette étude ont été spécialement conçus pour la stabilité thermique. De nombreux anticorps peuvent résister à des températures> 70 ° C qui est déjà 36,37 compatible avec le protocole de traitement thermique en cours. Cette stabilité thermique naturelle peut encore être augmentée en concevant les différents domaines d' anticorps 38, augmentant ainsi le nombre de protéines qui peuvent être soumis à la méthode (et ses variantes) présentées ici. Le procédé de blanchiment a déjà été appliqué à des plants de tabac transgéniques exprimant un anticorps monoclonal (2G12) 17 qui n'a pas été soumis à une sélection pour la stabilité thermique ou de l' ingénierie des protéines. Un traitement thermique à 65 ° C a augmenté la pureté de l'anticorps par un facteur d'deux avant la purification chromatographique tandis que la récupération était similaire à celle observée sans blanchissement.
En outre, la caractérisation des températures d'un système d'expression de fusion HCP individuels pourrait faciliter l'identification d'une température à laquelle le processus pourrait être mené similaire à la pasteurisation du lait: température élevée, peu de temps 39. Le traitement thermique (sauf pour le blanchiment) peut également être appliquée à d'autres matières premières biologiques afin d'éliminer les professionnels de la santé si le produit peut supporter les températures requises. Celle-ci peut différer de ceux décrits ici si d'autres plates-formes d'expression telles que des mammifères surnageants de culture cellulaire sont en cours de traitement. Dans tous les cas, le rapport coût-bénéfice-ratio devrait être pris en compte, à savoir, le fait au profit des niveaux de HCP réduit l' emportent sur le coût de la mise en œuvre d' une étape de traitement thermique qui entraîne des coûts d'investissement supplémentaires, augmente le temps de traitement et peut réduire la yie produitld 16. Un paramètre critique dans ce contexte, l'activité du produit. Si cela dépend de la présence d'épitopes linéaires que pour certains vaccins à base de protéines, alors le traitement thermique est peu probable d'avoir un effet 40. En revanche, si la structure des protéines est importante, par exemple pour des épitopes conformationnels, l'orientation précise des chaînes latérales d'acides aminés dans le site actif d'une enzyme ou le repliement correct de l' anticorps régions déterminant la complémentarité, un traitement thermique peut interférer avec l' activité des protéines 41,42. Par conséquent, les essais d'analyse appropriés doivent être mis en place pour surveiller les performances du produit avant et après le traitement thermique.
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Disclosures
Les auteurs ont aucun conflit d'intérêt à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
| Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
| Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
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