Summary
Drie warmte precipitatiewerkwijzen gepresenteerd die effectief meer dan 90% van gastheerceleiwitten (HCP) van tabak extracten te verwijderen vóór alle andere zuiveringsstap. De plant HCPs irreversibel aggregeren bij temperaturen boven 60 ° C.
Abstract
Planten bieden niet alleen voedsel, voer en grondstoffen voor de mens, maar ook ontwikkeld als voordelig productieplatform voor biofarmaceutische eiwitten, zoals antilichamen, vaccin kandidaten en enzymen. Deze moeten worden gezuiverd uit de plantaardige biomassa, maar chromatografie stappen worden belemmerd door de hoge concentraties van de gastheercel eiwitten (HCPs) in plantenextracten. De meeste HCPs irreversibel aggregeren bij temperaturen boven 60 ° C vervolgens gemakkelijker zuivering van het doeleiwit. Hier worden drie methoden voorgesteld om de warmte precipitatie van tabak HCPs bereiken hetzij intacte bladeren of extracten. Het blancheren van intacte bladeren kunnen gemakkelijk in bestaande processen worden opgenomen, maar kan een negatief effect hebben op de daaropvolgende filtratie stappen te hebben. Het tegenovergestelde geldt voor de warmte het neerslaan van blad extracten in een geroerd vat, die de prestaties van de downstream-activiteiten te verbeteren, zij het met grote veranderingen in het proces van het ontwerp van apparatuur, zoalshomogenisator geometrie. Tenslotte wordt een warmtewisselaar setup goed gekarakteriseerd in termen van warmteoverdracht omstandigheden en gemakkelijk op schaal, maar reiniging kan moeilijk zijn en er kan een negatief effect op filter capaciteit. Het ontwerp-of-experimenten benadering kan worden gebruikt om de meest relevante procesparameters invloed HCP verwijdering en productwinning identificeren. Dit vergemakkelijkt de toepassing van elke methode andere expressie en het ter bepaling van de meest geschikte methode voor een bepaalde zuiveringsstrategie.
Introduction
Moderne systemen in de gezondheidszorg steeds meer afhankelijk van biofarmaceutische eiwitten 1. De productie van deze eiwitten in planten is voordelig vanwege de lage pathogeen last en grotere schaalbaarheid in vergelijking met conventionele expressiesystemen 2-4. Echter, de stroomafwaartse verwerking (DSP) van plantaardige geneesmiddelen uitdagend omdat de verstorende extractieprocedures resulteren in een hoge deeltjes belasting met troebelingen dan 5000 nefelometrische troebelingseenheden (NTUs), en eiwitten van de gastheercel (HCP) concentraties die vaak meer dan 95 % [m / m] 5,6.
Uitgebreide verduidelijkingsprocedures moeten 7-9 verspreide deeltjes te verwijderen, maar vloeistofchromatograaf is goedkoper om in-binden en elueren stand tijdens uitgangsproduct herstel of er een eerdere stap voor het effectief verwijderen van HCPs 10,11. Dit kan worden bereikt door het precipiteren van het doeleiwit via floccul12 mieren of lage pH 13,14, en door het veroorzaken van de HCPs te aggregeren. De selectieve aggregatie van ribulose-1,5-bisfosfaat carboxylase / oxygenase (RuBisCO), de meest voorkomende HCP in groene planten zoals tabak (Nicotiana tabacum), kan worden bevorderd door het toevoegen van polyethyleenglycol 15, maar dit is duur en onverenigbaar met grote -schaal productie. Warmtebehandeling is aangetoond dat het denatureren en precipiteren meer dan 95% van tabak HCP, terwijl eiwit malaria vaccin kandidaten zoals Vax8 stabiel in oplossing blijven 16-18.
Drie verschillende benaderingen werden gebruikt om de warmte-geïnduceerde precipitatie van tabak HCPs bereiken: (i) blancheren, dat wil zeggen, het onderdompelen van intacte bladeren in hete vloeistof, (ii) een thermisch geïsoleerde geroerd vat, en (iii) een warmtewisselaar ( figuur 1) 16. Voor intact bladeren, blancheren bereikte de snelle en efficiënte neerslaan van HCPs en was ook gemakkelijkopschalen en compatibel met bestaande grootschalige productieprocessen die een eerste stap om de plant biomassa 19 wassen omvatten. Daarentegen-geïsoleerde vaten, reeds op bepaalde werkwijzen en kan worden gebruikt voor de thermische behandeling van plantenextracten 20, maar de schaalbaarheid en energie overdrachtssnelheid beperkt omdat de oppervlakte-volumeverhouding van de tank geleidelijk verlaagd en ongeschikt wordt op procesniveau schaal. Een warmtewisselaar is een technisch goed gedefinieerde alternatief roervaten verhit maar vereist een overvloedige toevoer van verwarmings- en koelmiddelen zoals stoom en koud water, evenals een strak volumestroom die geschikt is om de warmtewisselaar geometrie en media eigenschappen, bijv., de soortelijke warmte. Dit artikel laat zien hoe alle drie methoden voor de warmte-geïnduceerde precipitatie van tabak HCPs en planten HCPs in het algemeen. De oprichting en de werking van each werkwijze in een laboratoriumomgeving worden gebruikt om hun geschiktheid voor grootschalige processen te evalueren. De grote uitdaging is om een adequate schaal-down modellen en actief voorwaarden te identificeren voor elke operatie die de apparaten en voorwaarden gebruikt tijdens proces-grootschalige productie lijken. De hier gepresenteerde gegevens hebben betrekking op experimenten met transgene tabaksplanten expressie het malariavaccin Vax8 en fluorescerend eiwit DsRed 16, maar de methode is ook met succes toegepast op N. benthamiana planten transient expressie andere biofarmaceutische eiwitten 21.
Een ontwerp-of-experimenten (DoE) benaderen 22 kan procesontwikkeling vergemakkelijken en flocculatoren 23 kan ook nuttig in deze context zijn zoals eerder beschreven 8. Het belangrijkste verschil tussen blancheren verwarmde tanks en warmtewisselaars is dat blancheren wordt toegepast op intacte bladeren vroeg in het proces, terwijl de others toegepast op plantenextracten (figuur 1).
Figuur 1:. Process Flow Scheme Ter illustratie van de uitvoering van drie verschillende methoden voor tabak HCP Heat Neerslag Het plantmateriaal wordt gewassen en gehomogeniseerd voor verduidelijking en zuivering. Apparatuur voor het blancheren stap (rood) kan eenvoudig aan de bestaande machines worden toegevoegd. In tegenstelling tot het gebruik van een geroerd vat (oranje) en in het bijzonder een warmtewisselaar (blauw) vereist een of meerdere extra apparatuur en leidingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwikkel de Installaties van de tabak
- Spoel elk blok minerale wol met 1-2 liter gedeïoniseerd water en vervolgens met 1 liter 0,1% [w / v] kunstmestoplossing. Plaats een tabak zaad in elke minerale wol blok en voorzichtig spoelen met 0,25 L van kunstmest oplossing zonder wegwassen van het zaad 16.
- Cultiveren van de tabaksplanten 7 weken in een kas met 70% relatieve vochtigheid, een 16 uur fotoperiode (180 umol sec - 1 m - 2; λ = 400 - 700 nm) en een 25/22 ° C licht / donker regime temperatuur.
- Oogst alle bladeren behalve de vier zaadlob bladeren, die zich aan de voet van de plant stem.
2. Optioneel: Heat Neerslag door Blancheren
OPMERKING: Voer de stappen beschreven in stappen 2,1-2,12 om tabak HCPs neerslaan door blancheren. Sla de hele sectie 2, als de HCPs wordt neergeslagenin een verwarmde vat (deel 4) of met behulp van een warmtewisselaar (hoofdstuk 5).
- Zet opzij 50 g plantmateriaal en extractie uit te voeren zonder blancheren (deel 3). Neem een monster van dit extract als een interne controle tijdens de verdere analyse (hoofdstuk 7).
- Opzetten van een 8-L werkvolume waterbad, bijvoorbeeld 50 x 40 x 40 cm, in een thermisch geïsoleerde polystyreenschuim emmer of dergelijke. Monteer de regelbare thermostaat op het water bad voor verdere temperatuurregeling (stap 2.7).
- Breng de gehele samenstel op een magnetische roer bord en leg een magnetische roerstaaf in het waterbad. Zorgen dat het magnetische veld sterk genoeg is om de roerstaaf te roteren.
- Omringen de roerstaaf met minstens vier support tegels waarop een polypropyleen korf (stap 2,6) later tijdens de blancheer- procedure wordt geplaatst. Controleer of de drager tegels zijn gemaakt van een niet-magnetisch materiaal (bijvoorbeeld roestvrij staal legering met nikkel) en dathoger zijn dan de roerstaaf (figuur 2).
- Voeg 8 L gedemineraliseerd water in het waterbad.
Opmerking. Het gebruik van een buffer, bijvoorbeeld 50 mM natriumfosfaat (pH 7,5), kan het doeleiwit opbrengsten verbeteren als lage pH precipitatie is een probleem. - Plaats een 23 x 23 x 23 cm polypropyleen mand op de steun tegels en zorg ervoor dat de korf niet interfereert met het roerstaafje rotatie en dat het volledig is ondergedompeld in de vloeistof. Voeg zo nodig extra water / buffer totdat de mand volledig is ondergedompeld, dan weer verwijder de mand.
LET OP: Alle volgende stappen tot aan 2,12 betrekking hebben op de behandeling van hete vloeistof. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder thermisch isolerende handschoenen. - Met de instelbare thermostaat op het waterbad van 70 ° C (of de vereiste temperatuur voor de experimenten) brengen. Wacht tenminste 15 minuten na de gewenste temperatuur is bereikt om het gehele samenstel te waarborgen heeft bereikt thermal evenwicht.
- Bereid 150 g hoeveelheden van de geoogste tabaksbladeren. Plaats een hoeveelheid in het mandje met vermijding irreversibele compressie en schade aan de bladeren, bijvoorbeeld door scheuren. Vermijd overvulling van de mand met plantaardig materiaal of een dichte pakking van de laatste.
- Voorzichtig maar snel onderdompelen de mand in de hete vloeistof en plaats het op de steun tegels. Plaats een roestvrij stalen blok bovenop de mand flotatie voorkomen.
- Incubeer de bladeren voor 5 min in het blancheren vloeistof, of selecteer een tijd die past bij de experimentele opzet. Controleer de vloeistoftemperatuur gedurende de gehele incubatieperiode.
- Haal de mand uit het blancheren vloeistof en laat de resterende vloeistof drain uit de bladeren gedurende 30 sec. Neem dan de bladeren van de planten uit de mand, overbrengen naar de blender en onmiddellijk de extractie (deel 3) te starten.
OPMERKING: Planten kunnen voor langere tijd bewaard na blancheren en voorafgaand aan the extractie, bijvoorbeeld meer dan 30 min op ijs of bevroren bij -20 ° C gedurende enkele weken is met succes getest. Echter, kan het product stabiliteit afnemen met toenemende bewaartijd en dus onmiddellijke verwerking wordt aanbevolen. - Herhaal stap 2,8-2,11 met verse bladmateriaal tot de volledige geoogste biomassa wordt verwerkt.
3. Protein Extraction uit Tobacco Leaves
LET OP: De volgende stappen leiden tot een blender met roterende bladen. Werk niet in de blender emmer, terwijl het op de blender motor is gemonteerd.
- Plaats 150 g (nat gewicht) van geoogst (stap 1,3) of geblancheerd (stap 2.11) bladeren in de blender en voeg 450 ml extractiebuffer (50 mM natriumfosfaat, 500 mM natriumchloride, 10 mM natriumbisulfiet, pH 8,0).
OPMERKING: De extractiebuffer samenstelling afhankelijk van de eiwit te extraheren en dus aanpassing, bijvoorbeeld, gebruik van een pH vereisen of buffer component zoals Tris. - Homogeniseren van de bladeren voor 3 x 30 sec pulsen met 30 sec afgewisseld pauzes. Zorg ervoor dat de bladeren zijn gehomogeniseerd en niet verstoppen de blender emmer. Stop de blender en til de bladeren verstoppingen te voorkomen, indien nodig, en dan verder de homogenisering.
- Neem een monster 1 ml van elk extract dat wordt geproduceerd voor verdere analyse (hoofdstuk 7). Als de plant materiaal wordt geblancheerd, blijft hoofdstuk 6. Ga anders verder met warmte neerslag in een vat (deel 4) of warmtewisselaar (hoofdstuk 5), afhankelijk van de gekozen experimentele benadering.
4. Optioneel: Warmte Neerslag in een geroerd vat
OPMERKING: Voer de stappen in secties 4,2-4,11 beschreven om tabak HCPs neerslag in een geroerd vat. Sla de hele afdeling 4, indien HCPs hebben door blancheren (deel 2) is neergeslagen of zullen worden neergeslagen met behulp van een warmtewisselaar (hoofdstuk 5).
- Instellen van twee 8-L werkvolume waterbaden, bijvoorbeeld 50 x 40 x 40 cm, in thermisch geïsoleerd polystyreenschuim of dergelijke. In het eerste bad, zet de instelbare thermostaat voor de volgende temperatuurregeling (stap 4.6). In de tweede, voeg 5 L gedeïoniseerd water en 2 kg ijs vervolgens afkoelen (stap 4,9).
- Breng de eerste waterbad op een magnetische roerplaat en plaats de 2-roestvast stalen vat in het waterbad, zodat het midden van het vat is gericht naar het midden van de roerplaat.
- Plaats een magnetische roerstaaf in de roestvrij stalen vat. Zorgen dat het magnetische veld sterk genoeg is om de roerstaaf te roteren.
- Vul het waterbad met gedeïoniseerd water tot 5 cm onder de bovenkant van het roestvast stalen vat. Vul dan het schip met extractiebuffer. Plaats een polystyreenschuim deksel op het vat.
LET OP: Alle volgende stappen tot aan 4.9 betrekking hebben op de behandeling van hete vloeistof. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder thermisch insulated handschoenen. - Plaats een thermometer in het roestvast stalen vat door middel van een passend bij gat in het piepschuim deksel. Stel het waterbad temperatuur tot 78 ° C en incubeer het geheel gedurende 15 min thermisch evenwicht bereiken. Zorg ervoor dat de temperatuur in het vat is 70 ° C, ongeveer 8 ° C onder de ingestelde waarde van het waterbad.
- Indien de temperatuur in het roestvast stalen vat verschilt van 70 ° C, stel de temperatuur van het waterbad en bijgevolg laat het systeem equilibreren gedurende 15 min. Herhaal deze stap tot de temperatuur in het vat is 70 ° C of zoals vereist voor het experiment en leeg het roestvast stalen vat.
- Giet 300 ml extract (stap 3,2) in de roestvast stalen vat terwijl het nog in het waterbad en start een timer. Roer het extract bij 150 rpm en incubeer gedurende 5 min. Zorgen dat het extract gedurende deze incubatieperiode een temperatuur van 70 ° C gedurende ten minste 2 min bereikt.
- Verwijder het warmwaterbad van de magneetroerder, verwijder de roestvast stalen vat en plaats het in de ijskoude emmer. Plaats de laatste op de magneetroerder en verwijder het piepschuim deksel.
- Controleer of de plantenhomogenaat goed geroerd met 150 rpm plaats de thermometer in het extract en incubeer totdat het een temperatuur van 20 ° C en de temperatuur door de proefopzet bereikt.
- Herhaal stap 4,7-4,9 voor alle monsters. Neem een monster 1 ml van elk warmte neergeslagen halen zodra het de uiteindelijke temperatuur heeft bereikt, ga dan verder met hoofdstuk 6.
5. Optioneel: Warmte Neerslag in een warmtewisselaar
OPMERKING: Voer de stappen in paragrafen 5,2-5,12 beschreven om tabak HCPs behulp van een warmtewisselaar neerslaan. Sla de hele afdeling 5, indien HCPs zijn neergeslagen door blancheren (hoofdstuk 2) of in een verwarmde vat (deel 4).
- Instellen van twee 8-L werkvolumewaterbaden, bijvoorbeeld 50 x 40 x 40 cm, in thermisch geïsoleerde polystyreenschuim emmers en dergelijke. In het eerste bad, zet de instelbare thermostaat voor de volgende temperatuurregeling (stap 5.3). In de tweede, voeg 5 L gedeïoniseerd water en 2 kg ijs vervolgens afkoelen (stap 5.10).
LET OP: Alle volgende stappen tot aan 5.9 betrekking hebben op de behandeling van hete vloeistof. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder thermisch isolerende handschoenen. - Vul het eerste waterbad met 8 liter gedemineraliseerd water. Stel de temperatuur tot 74,5 ° C met behulp van de thermostaat. Incubeer de assemblage gedurende 15 min thermisch evenwicht te bereiken.
- Bereid een geïsoleerd opslagvat door het plaatsen van een 0,5-L plastic beker in een 1-L plastic beker en vul de gaten met watten. U kunt ook gebruik maken van een speciale thermisch geïsoleerd vat met een 0,5-L werkvolume.
- Sluit de warmtewisselaar naar de peristaltische pomp aan één einde en een uitlaatslang op de allemaalr beëindigen via L / S 24 buizen. Plaats beide uiteinden buis samen met een thermometer in het voorraadvat geïsoleerde vullen met 300 ml extractiebuffer (figuur 2).
- Plaats de warmtewisselaar in het hete waterbad en start de peristaltische pomp met een snelheid van 300 ml min -1. Zorg ervoor dat de resulterende temperatuur in het vat is 70 ° C, ongeveer 4,5 ° C onder de ingestelde waarde van het waterbad, na 3 min.
- Als de temperatuur in de geisoleerde schip afwijkt van 70 ° C, stel de temperatuur van het waterbad en bijgevolg laat het systeem equilibreren gedurende 15 min. Herhaal deze stap tot de temperatuur van de extractiebuffer toe van omgevingstemperatuur tot 70 ° C in minder dan 3 minuten, of gelijk aan die welke voor het experiment en leeg de roestvrij stalen vat.
- Gooi de extractie buffer van de geïsoleerde vat en voor te bereiden van 300 ml porties van het plantenextract. Vul het geïsoleerde vat met één portie.
- Pomp de plantenextract (paragraaf 3.3) door de warmtewisselaar bij 300 ml min -1 gedurende 5 minuten. Zorg ervoor dat het extract temperatuur van 70 ° C na 3 min of gelijk is aan de temperatuur die in de experimentele opzet.
- Na 5 minuten, plaats de warmtewisselaar in de ijskoud waterbad terwijl het extract nog wordt gepompt. Incubate in deze instelling tot de temperatuur precies bereikt 20 ° C, of de temperatuur die in de experimentele opzet.
- Verwijder de toevoerslang is verbonden met de peristaltische pomp van de geïsoleerde vat en blijven pompen residuele warmte geprecipiteerd plantenextract verzamelen vanuit de warmtewisselaar. stop dan de pomp.
- Herhaal stap 5,7-5,10 alle monsters. Neem een monster van 1 ml van elk warmte neergeslagen extract nadat het de uiteindelijke temperatuur heeft bereikt, dan doorgeven aan de extracten aan zak filtratie (hoofdstuk 6).
NB: Na een eerste doorlopen stappen 5,7-5,10 zal er geen extractiebuffer te zijngooi in stap 5.7.
6. Zak Filtratie van het plantenextract
- Monteer zakkenfilter in de overeenkomstige drager mand die in het filterhuis is aangebracht en biedt mechanische ondersteuning voor een flexibel filtermateriaal. Plaats een 1-L vat onder de mand en het extract fracties (sectie 3.3, 4,10 en 5,11, afhankelijk van de geselecteerde warmtebehandeling) aan de zak toe te passen bij een snelheid van 150 ml min -1.
- Na filtratie, het meten van de troebelheid van een 1:10 verdunning van het filtraat in extractiebuffer met behulp van de troebelheidsmeter.
- Neem een monster 1 ml en verwerken zak filtraat zoals gedefinieerd in de experimentele opzet, bijvoorbeeld dieptefiltratie en chromatografie 7,10.
7. Sample Analysis
- Meet de totale hoeveelheid oplosbare proteïne (TSP) volgens de methode van Bradford 24,25.
- In drievoud pipet 2,5 ul van elk monster in de putjes van een enkele96-well plaat. Bestaat uit acht runderserumalbumine (BSA) standaarden in drievoud meetgebied 0 - 2000 ug ml-1.
- Voeg 200 ul Bradford-reagens aan elke well en meng door en neer te pipetteren maar voorzichtig genoeg om te voorkomen dat bellen vormen.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 22 ° C en meet de absorptie bij 595 nm in een spectrofotometer. Bereken de TSP-concentratie in de basis van een standaard curve door de BSA referentiepunten samples.
- Kwantificeren Vax8 door surface plasmon resonance spectroscopy 26.
- Stel het oppervlak plasmon resonantie apparaat met 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) loopbuffer (10 mM HEPES, 3 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1500 mM natriumchloride, 0,05% v / v polysorbaat 20, pH 7,4) en zet een gecarboxymethyleerd dextran chip oppervlak in het apparaat. Gebruik de primaire functie om het systeem te spoelen en start een manuele run met een debiet van 30pl min -1 overstromen cellen 1 en 2. Injecteren 30 mM zoutzuur tweemaal gedurende 60 seconden met 60 seconden afgewisseld injectie van 25 mM natriumhydroxide.
- Bereid 200 ul van een 500 ug ml-1 mAb 5,2-oplossing in 10 mM natriumacetaat (pH 4,0). Ontdooi 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS) flesjes en centrifugeer ze bij 16.000 xg gedurende 1 min. Mix 70 ul van EDC met 70 pi van de NHS en over te dragen aan een 7-mm plastic flesje.
- Activeer de gecarboxymethyleerde dextran chip oppervlak oppervlak door het injecteren van de EDC / NHS mengsel over stroomcellen 1 en 2 gedurende 10 minuten met een stroomsnelheid van 10 pl min -1.
- Stel de stromingsbaan slechts cel 2 stromen. Paar mAb 5,2 door intraveneuze toediening gedurende 15 minuten bij een snelheid van 10 pl min -1.
- Schakelt het stroompad cellen 1 en 2 stroomt en injecteer ethanolamine gedurende 7 minuten bij een debiet van 5 pl min -1 het oppervlak te deactiveren. Tkip injecteren 30 mM zoutzuur tweemaal gedurende 60 seconden met 60 seconden afgewisseld injectie van 25 mM natriumhydroxide.
- Injecteer de monsters en MSP1 - 19 standaarden met een snelheid van 30 pl min -1 voor 180 sec. Zorg ervoor dat de Vax8 concentratie is 50 - 1000 ng ml -1. Bereid pre-verdunningen in HEPES gebufferde zoutoplossing met EDTA en polysorbaat 20 (HBSEP) indien nodig.
- Trek het sterkste signaal van doorstroomcel 1 van dat van stroomcel 2 en gebruik het verschil met de Vax8 concentratie in monsters gebaseerd op het signaal van de MSP 1 berekenen - 19 injectie met een bekende eiwitconcentratie van 500 ng ml-1.
- Regeneratie van de chip oppervlak na elke monster of MSP 1-19 injectie door blootstelling aan 30 mM zoutzuur gedurende 60 sec bij een stroomsnelheid van 30 pl min -1.
- Kwantificeren DsRed door middel van fluorescentie spectrometrie
- In drievoud Pipetteer 50 ul van elk monster in de enkele putjes van een zwarte halve-area 96-well plaat. Inclusief zes DsRed normen voor het bereik van 0-225 ug ml-1.
- Meet de fluorescentie in tweevoud met behulp van een 530 ± 30 nm excitatie- filter en een 590 ± 35 nm emissiefilter in een spectrofotometer. Bereken de DsRed concentratie in de basis van een standaard curve door de DsRed referentiepunten samples.
- Bepaling van deeltjesgrootte verdelingen
- Was een cuvet met 1 ml isopropanol en vervolgens met 2 ml gedeïoniseerd water om stof te verwijderen. Pipetteer 850 ul van het monster in de cuvet.
- Plaats de cuvet in de zeta potentiaal en deeltjesgrootte analysator. Open de "Software" en start een handmatige meting met "eiwit" als het materiaal en "PBS" als de verspreider. Selecteer een temperatuur van 25 ° C en een equilibratie tijd van 180 sec.
- Kies de "DTS0012" cel en meet aan 173 ° backscatter. Controleer de "auto" function voor de duur meten en selecteer drie metingen zonder afgewisseld vertraging.
- Onderzoek de deeltjesgrootteverdeling piekprofiel wanneer de meting voltooid door het selecteren van de drie metingen van het monster in het experiment weergave. Kies het tabblad "Volume PSD".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Warmte precipitatie van tabak gastheerceleiwitten door blancheren
Het blancheermedium werkwijze onder punt 2 beschreven werd met succes gebruikt om HCPs precipiteren van tabaksbladeren met 70 ° C, waardoor de TSP bij 96 ± 1% (n = 3) onder winning tot 51% van de Vax8 doeleiwit, en aldus meer de zuiverheid van 0,1% tot 1,2% voor 16 chromatografische scheiding. Het was ook mogelijk om te herstellen 83 ± 1% (n = 3) van het fluorescente eiwit DsRed, verhoging van de zuiverheid van 3,3% tot 64,1%. Het blancheermedium procedure is eenvoudig te integreren in een standaard extractie en verduidelijking programma bestaande biomassa wassen, homogenisatie, zakfiltratie en dieptefiltratie (figuur 1) 7. Voorbereiding van het blancheren apparatuur (figuur 2) toegevoegd ongeveer 5 minuten om de set-up tijd voor de verduidelijking apparaten, die routinematig duurt 20 min. Nog eens 7 min diende uit te oefenenhet blancheren van intacte bladeren naast de typische extractie en verduidelijking tijd van 45 min. Slechts 2 min van de extra 7 min was eigenlijke "hands-on 'tijd. Bovendien korte incubatietijden van minder dan 1 min mogelijk, waardoor het blancheren tijd van 7 min tot ongeveer 3 minuten. Daarom blancheren verhoogt niet alleen de initiële zuiverheid van een product in ruwe plantenextracten, maar ook snel voltooid zonder bijkomende apparatuur en biedt dus de mogelijkheid om ten minste een eerste chromatografiestap vervangen. Het blancheermedium badtemperatuur bleef constant, dat wil zeggen <0,2 ° C fluctuatie gedurende alle experimenten zelfs onmiddellijk na de toevoeging van geoogste bladeren, die bij kamertemperatuur waren. Dit verzekerde het proces was reproduceerbaar, dwz een gemiddelde variatiecoëfficiënt van 17% (n = 24), in termen van vermindering TSP, productopbrengsten en filtercapaciteit in de volgende verduidelijking stappen (Figuur 3 8 en filterhulpmiddelen na zakfiltratie 9, te herstellen of zelfs te verhogen filtercapaciteiten. Een temperatuur van 60 ° C voldoende om 80 ± 3% verwijderd (n = 3) van HCPs en verhoging Vax8 zuiverheid 2,6 ± 0,1 maal (n = 3) zonder dat filtercapaciteit. Daarom HCP verwijdering door blancheren is compatibel met doeleiwitten dat matige hittebestendigheid, dat wil zeggen, een smelttemperatuur lager dan 70 ° C 27,28 te hebben. Het verhogen van de temperatuur tot 70 ° C of meer kan leiden tot een verwijdering van HCP dan 95% (Figuur 3). Het was nuttig om de corresponderende reeks experimenten uit te voeren in een goed ontworpen manier met behulp van een statistische benadering 22 omdat dit kon de snelle identificatie van de meest rELEVANTE procesparameters, dat wil zeggen, verwarming tijd en temperatuur. Tegelijkertijd, de DOE systeem omvat een voorspellend model voor procesoptimalisatie 16 vergemakkelijken.
Figuur 2: Schematische Setup van drie methoden om Tobacco HCPs Neerslag in Intact Leaves of uittreksels daarvan A. Blanching werd uitgevoerd in een waterbad verwarmd met een thermostaat (T) waarin een mand met intacte bladeren werd ondergedompeld uitgevoerd.. Het waterbad werd geroerd om een homogene en constante temperatuur te waarborgen. B. Een vat met een magnetische roerstaaf en extract werd ondergedompeld in een waterbad. De temperatuur van het extract werd gevolgd om te verzekeren dat de gewenste temperatuur werd bereikt. C. Een warmtewisselaar (H) is verbonden met een pomp (P) en een thermisch geïsoleerde storage vat dat het plantenextract. De warmtewisselaar werd ondergedompeld in een waterbad en de temperatuur van het verwarmde extract werd gecontroleerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van de Drie Heat Neerslag methodes Wanneer hun effect op procesprestaties en de zuivering van twee doeleiwitten A.. Voorwaarden die samenhangen met de verwijdering van meer dan 90% van HCPs gesignaleerd bij het blancheren een geroerd vat en een warmtewisselaar setup, die verhoogde de zuiverheid van de eiwitten Vax8 en DsRed met minimaal 2,5 en maximaal 19 voudige, met blancheren presteren het best. Daarentegen alleen het geroerde vat setup vergroot de capaciteit van de subsequent dieptefiltratie stap gebruikt voor verduidelijking van de warmte behandelde planten of extracten. Foutbalken geven de standaarddeviatie (n = 3). B. De HCP gehalte van monsters na verschillende warmtebehandeling voorwaarden kunnen worden geanalyseerd en vergeleken met behulp van Coomassie gekleurde polyacrylamidegels. RuBisCO (groene pijlen) wordt verwijderd, samen met andere HCPs als de temperatuur tijdens de warmtebehandeling toeneemt, terwijl DsRed (rode pijl) in oplossing blijft. * Geeft een samples die werd blootgesteld aan warmte gedurende 0,5 minuten werden alle monsters behandeld gedurende 3,0 min of meer. Re-print met toestemming van 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Warmte precipitatie van HCP in een geroerd vat
Een geroerde reactor van warmte precipitatie verwijderd maximaal 84 ± 1% (n = 3) HCP, het bereiken van een zuiverheid of 0,33 ± 0,02% (n = 3) voor Vax8 en 20,2 ± 1,4% (n = 3) voor DsRed (figuur 3). De warmtebehandeling werd uitgevoerd in een vat gescheiden van de homogenisator vertragingen reflecterende bezetting apparaat bij het verwerken van meerdere monsters in serie voorkomen wordt. De doorlooptijd benodigde inspanning voor het laboratoriumschaal werkwijze was vergelijkbaar met dat blancheren maar een aanvullende vat van roestvrij staal en een goede koelstap nodig waren. Bovendien warmteoverdracht naar het extract was trager dan tijdens blancheren, met incubatietijden van ten minste 5 min, dat wil zeggen 10 keer langer dan blancheren. De vertraagde verwarmen werd veroorzaakt door het vaartuig, die een extra belemmering's voor warmteoverdracht en het ~ 300% grotere massa die in het vat verwarmd door de aanwezigheid van extractiebuffer naast de plantaardige biomassa. Precipiterende eiwitten ook gehecht aan de wanden van het vat geleidelijk opbouwen tegen warmteoverdracht barrière en het verhogen van de inspanningvereist voor verdere reiniging. Instellen waterbadtemperatuur 8 ° C boven de temperatuur voor warmteopwekking precipitatie gecompenseerd energieverliezen in de gedeeltelijk open systeem en bereikt de gewenste temperatuur extract. In tegenstelling bleking (deel 2) en de warmtewisselaar opstart (deel 5), HCP precipitatie in een vat verhoogde de capaciteit van stroomafwaartse dieptefiltratie met 2,5-voudige, als gevolg van de lager dwarskrachten in het vat ten opzichte van pompen extract door de hitte wisselaar of homogenisering na blancheren, waarschijnlijk resulteert in grotere aggregaten die gemakkelijker worden verwijderd in de zak filtratiestap waren.
Warmte precipitatie van HCP in een warmtewisselaar
Ongeveer 88,3 ± 0,7% (n = 12) van het HCP gehalte consequent verwijderd uit het extract met behulp van een warmtewisselaar binnen het temperatuurbereik 60-70 ° C, het bereiken van een zuiverheid van 0,31 ± 0,01% (n = 12) voor Vax8 en 27.6 ± 2,0% (n = 12) voor DsRed (figuur 3). De gemiddelde variatiecoëfficiënt was 13% (n = 24) dat de reproduceerbaarheid van deze procedure was zelfs beter dan blancheren. Het extract gewenste temperatuur werd bereikt na ~ 3 min wanneer de waterbadtemperatuur hoger werd 4,5 ° C. Voor het verwarmde vat, werd een speciale koelstap vereist na warmtebehandeling. De warmtewisselaar bij meer handling inspanning dan de andere methoden, omdat de pompinrichting en de warmtewisselaar vereist intensieve reiniging door het precipitaat aan de wand van het smalle boring roestvrijstalen buis. De warmtewisselaar ook over het laagste downstream dieptefilter capaciteit verduidelijking slechts 13,5 ± 6,0 (n = 3) L m -2 voor verstopping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De drie methoden voor warmte-precipitatie hierboven beschreven effectief verwijderen tabak HCPs voorafgaand aan een chromatografische zuiveringsstap 16,17. Zij vullen andere strategieën die gericht zijn oorspronkelijke product zuiverheid, bijvoorbeeld guttatie 29, rhizosecretion 30 of centrifugale extractie 31,32, die beperkt zijn tot uitgescheiden eiwitten verhogen. Echter, de warmte gebaseerde methoden alleen gebruikt op een zinvolle wijze als het doeleiwit te zuiveren kan de minimum precipitatietemperatuur van ~ 60 ° C gedurende meer dan 1 minuut weerstaan. Daarom is de eerste stap in elk van de drie methoden om een doelwitmolecuul te ontwerpen met een voldoend hoge smelttemperatuur, welke is beschreven voor verschillende malariavaccin eiwitten uit verschillende domeinen van verschillende Plasmodium falciparum antigenen 16,18,21. Zodra de thermische stabiliteit van het doelwit eiwit is aangetoond, eenvan de drie methoden worden geselecteerd op basis van de beschikbare apparatuur en media, verwachte laatste proces schaal en daaropvolgende DSP bewerkingen 16.
Blancheren was de snelste van de methoden en aanvullende eisen apparatuur waren minimaal, dus het kan gemakkelijk in bestaande laboratoriumschaal zuivering protocollen voor plantaardige recombinante eiwitten worden uitgevoerd. Grondige agitatie van het blancheermedium vloeistof een belangrijke procesparameter die de efficiëntie van HCP neerslag gebaseerd op zowel empirische en theoretische berekeningen 21,33 beïnvloedt. Geen goede menging kan warmteoverdracht en anders dreigt slechts gedeeltelijke verwijdering HCP, die op zijn beurt nadelig kan het product als gastheer proteasen blijven actief 21,34 realiseren. Verschillende andere parameters kunnen ook invloed HCP precipitatie, bijvoorbeeld de verwarmingstemperatuur en de incubatietijd, en een DoE benadering kan dus nuttig zijn om de meest relevante fa karakteriserenctors en zorgen voor voorspellende modellen om hun effecten te kwantificeren op de antwoorden zoals zuiverheid van het product, herstel en de prestaties van de daaropvolgende DSP stappen 22.
In de opstelling vat, werden langere incubatietijden vereist om volledige HCP precipitatie en kan de kans op ongewenste doelwit eiwit denaturatie die de langdurige blootstelling aan hoge temperaturen verhogen. Meer grondig mengen in het vat kan de warmteoverdracht verbeterd en de duur van de verhitting te verminderen. De lange temperatuur oprit in deze opstelling kunnen ook uitdagend zijn als proteasen in het extract 21,34 actiever geworden vóór de definitieve hitte inactivatie, waardoor het product verliezen.
De toegenomen diepte filtercapaciteit waargenomen voor de setup vaartuig kan helpen om verbruiksgoederen kosten te verlagen, waardoor een groter aantal monsters in een project om te worden behandeld met een vast budget of een verlaging van de totale financieringsbehoefte voor een bepaalde reeks van experimenten. Echter kan dit voordeel worden gecompenseerd door de kosten van het verdere vat, die nodig is in aanvulling op de homogenisator naar de introductie van werkwijze hold stappen voorkomen wanneer verschillende extractie runs nodig zijn een reeks experimenten, bijvoorbeeld als onderdeel van een DoE nadering. Het positieve effect op de filtercapaciteit kan ook afnemen als een intensievere menging regime wordt gebruikt om verwarming te verkorten zoals hierboven aangegeven.
Een speciale koelstap nodig voor zowel extract warmtevoorziening precipitatiewerkwijzen, waarbij niet alleen extra middelen, maar ook het verlengen van de totale verwerkingstijd per monster, die ook veroorzaken voor vloeiende DoE procedures of experimentele sequenties in het algemeen. De warmtewisselaar setup is goed gekarakteriseerd vanuit een technisch oogpunt 35 en kunnen gemakkelijk worden ontworpen en opgeschaald voor specifieke temperatuurverschillen, in tegenstelling tot het vat, waarvan het oppervlak-tot-volume-verhouding verandert tijdens opschalen. Hoeooit eens de warmtewisselaar grootte wordt gedefinieerd, kan het moeilijk zijn aan te passen aan alternatieve temperatuurverschillen omdat de lengte en daarmee de warmteoverdracht gebied worden vastgesteld.
andere parameters, zoals de verblijftijd (of debiet) en de temperatuur van de warmtewisselaar medium veranderen, buigzaamheid herstellen tot op zekere hoogte, maar alleen in kleinschalige experimenten omdat deze factoren worden typisch gebruikt in smalle vensters in behandeling grootschalige operaties wijten beperkingen opgelegd door de beschikbare apparatuur en media. De vraag naar een combinatie van korte incubatietijden van 3-5 min en een temperatuurverschil van 40 - 60 ° C wordt steeds moeilijker op te lossen op het apparaat niveau als het proces schaalvergroting omdat de afmetingen van de warmtewisselaar groter. Dit geldt vooral voor de koelstap omdat het temperatuurverschil tussen het medium en de gewenste temperatuur extract vaak kleiner (AT = 10-15 ° C)dan de verwarming stap (AT = 20-40 ° C), wat resulteert in grote afmetingen apparatuur of langer cool-down-tijd.
In de toekomst kan het protocol worden aangepast aan andere dan vaccin gegadigden die in deze studie die speciaal zijn ontworpen voor thermische stabiliteit biofarmaceutische eiwitten. Veel antilichamen kunnen temperaturen> 70 ° C 36,37 die verenigbaar zijn met de huidige warmtebehandeling protocol reeds weerstaan. Deze natuurlijke thermische stabiliteit kan verder worden vergroot door engineering van de verschillende antilichaamdomeinen 38, waardoor het aantal eiwitten dat kan worden onderworpen aan de werkwijze (en zijn varianten) hier gepresenteerde verhogen. De blancheermethode is al toegepast om transgene tabaksplanten expressie brengen van een monoklonaal antilichaam (2G12) 17 die niet onderworpen aan selectie voor thermische stabiliteit of eiwitmanipulatie is. Warmtebehandeling bij 65 ° C verhoogde de zuiverheid van het antilichaam met een factortwee vóór chromatografische zuivering Tijdens herstellen was vergelijkbaar met die zonder blancheren.
Hoge temperatuur korte tijd 39: Bovendien karakteriseren van de individuele HCP smelttemperaturen van een expressiesysteem kan de identificatie van een temperatuur waarbij het proces vergelijkbaar met melk pasteurisatie kan worden uitgevoerd vergemakkelijken. De warmtebehandeling (behalve blancheren) kunnen ook worden toegepast op andere biologische uitgangsmaterialen HCPs verwijderen als het product de vereiste temperaturen kan weerstaan. Dit laatste kan afwijken van die welke hier besproken of andere expressie platforms zoals zoogdiercellen celkweek supernatanten worden verwerkt. In elk geval moeten de kosten-baten-verhouding in aanmerking genomen, dat wil zeggen, heeft het voordeel van verminderde HCP niveaus opwegen tegen de kosten van toepassing van een warmtebehandeling stap die bijkomende investeringskosten veroorzaakt, verhoogt de procestijd en kan het product yie verminderenld 16. Een belangrijke parameter in dit verband is het productactiviteit. Indien het afhankelijk van de aanwezigheid van lineaire epitopen als enige eiwit gebaseerde vaccins, is waarschijnlijk geen effect 40 hebben warmtebehandeling. Als daarentegen eiwitstructuur is belangrijk, bijvoorbeeld voor conformationele epitopen, de precieze oriëntatie van aminozuurzijketens in actieve plaats van een enzym of de correcte vouwing van antilichamen complementariteitsbepalende gebieden, een warmtebehandeling beïnvloeden eiwitactiviteit 41,42. Daarom moeten geschikte analyse assays worden vastgesteld om productprestaties controleren vóór en na warmtebehandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
| Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
| Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
- PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
- Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
- Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
- Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
- Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
- Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940 (2016).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
- Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
- Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
- Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
- Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
- Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
- Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
- Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
- Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
- Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
- Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
- Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
- Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
- Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
- Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336 (2006).
- Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
- Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).
