Summary
三熱沈殿法は、効果的に前に他の精製工程にタバコ抽出物から、宿主細胞タンパク質（のHCP）の90％以上を除去することが示されています。植物のHCPは、不可逆的に60℃以上の温度で凝集します。
Abstract
植物は人間のための食品、飼料、原材料を提供するだけでなく、このような抗体、ワクチン候補と酵素などのバイオ医薬品タンパク質、のための経済的な生産システムとして開発されているだけではなく。これらは、植物バイオマスから精製されなければならないが、クロマトグラフィー工程は、植物抽出物中の宿主細胞タンパク質（のHCP）の高濃度によって妨げられます。しかし、ほとんどののHCPは、不可逆的に、標的タンパク質のその後の精製を容易にする60℃以上の温度で凝集します。ここでは、3つの方法は、無傷の葉または抽出物のいずれかでタバコのHCPの熱沈殿を達成するために提示されます。無傷の葉のブランチングを容易に既存のプロセスに組み込むことができるが、その後の濾過工程に悪影響を与えることができます。反対は、次のようなプロセス装置の設計に大きな変化、とはいえ下流操作のパフォーマンスを向上させることができ、撹拌容器、中葉抽出物の熱沈殿のために真でありますホモジナイザージオメトリ。最後に、熱交換器の設定は、熱伝達条件および拡張が容易という点で十分に特徴付けられているが、洗浄が困難であることができ、フィルタの能力に負の影響があってもよいです。デザイン・オブ・実験アプローチは、HCPの除去および生成物回収に影響を与える最も関連するプロセスパラメータを識別するために使用することができます。これは、他の発現プラットフォーム内の各メソッドと与えられた精製戦略に最も適した方法の特定のアプリケーションを容易にします。
Introduction
現代の医療システムは、ますますバイオ医薬品タンパク質1に依存しています。植物におけるこれらのタンパク質を産生することは、従来の発現系2-4と比較して、低い病原体負荷とスケーラビリティに有利で す。破壊的な抽出手順は5,000比濁分析濁度単位（NTUs）を超える濁度、及び宿主細胞タンパク質（HCP）濃度は、多くの場合、95を超えると、高い粒子負荷をもたらすしかし、植物由来の医薬品の下流の処理（DSP）は、挑戦することができ％[メートル/メートル] 5,6。
精巧な浄化手順は、分散粒子7-9を削除する必要があります。ただし、クロマトグラフィー装置はのHCP 10,11を効率的に除去するための以前のステップがある場合、最初の製品の回収時にバインドおよび溶出モードで動作するように安価であるされています。これはflocculを使用して標的タンパク質を沈殿させることによってのいずれかで達成することができますアリ12または低pH 13,14、ならびにのHCPが凝集させることもできます。リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ（のRuBisCO）の選択的な凝集は、例えば、タバコ（ タバコ ）などの緑色植物の中で最も豊富なHCPは、ポリエチレングリコール15を追加することによって促進することができるが、これは高価であり、大規模なと互換性がありません-scale製造。例えばVax8などのタンパク質のマラリアワクチン候補は、溶液中で安定16-18まま熱処理は、タバコのHCPの95％以上を変性し、沈殿させることが示されています。
（I）ブランチング、 すなわち、高温の液体中の無傷の葉の浸漬、（ii）の温度制御撹拌容器、および（iii）熱交換器（：三つの異なるアプローチがタバコのHCPの熱誘導沈殿を達成するために使用しました。 図1）16。無傷の葉のために、ブランチングは、のHCPの迅速かつ効率的な降水量を達成し、また簡単でしたスケールアップと植物バイオマス19を洗浄するための最初のステップを含む、既存の大規模製造プロセスに適合します。対照的に、温度制御された血管は、既にいくつかのプロセスで利用可能であり、タンクの表面対体積比が徐々に低下するため、プラントの熱処理20を抽出し 、それらのスケーラビリティとエネルギー移動速度が制限されるために使用することができるとプロセスのスケールで適さなくなります。熱交換器は、撹拌容器を加熱するために技術的に明確に定義された代替手段であるが豊富な加熱の供給およびメディア、 例えば、蒸気、冷水、冷却、ならびに熱交換器の形状に適合されている厳密に制御体積流量を必要としメディアの特性、 例えば 、特定の熱容量。この記事では、すべての3つの方法が一般的にタバコのHCP、および植物のHCPの熱による沈殿のために使用することができる方法を示しています。 EACの設立と運営実験室の設定における時間法は、大規模なプロセスのためのそれらの適合性を評価するために使用することができます。主要な課題は、プロセス規模製造中に使用されるデバイスおよび条件に似ている各操作に対して十分な縮小モデルと運転条件を識別することです。ここに提示したデータは、マラリアワクチン候補Vax8を発現するトランスジェニックタバコ植物を用いて行った実験を参照し、蛍光タンパク質は、16のDsRedが、方法はまた、成功裏にNに適用されていますbenthamiana植物は一過他のバイオ医薬品タンパク質21を発現しています 。
デザイン・オブ・実験（DOE）アプローチ22は、プロセスの開発を容易にすることができ、以前8に記載のように凝集剤23もまた、この状況において有益であり得ます。ブランチング、加熱された容器と熱交換器との間の主な違いは、ブランチングは、初期のOT一方過程で無傷の葉に適用されることです彼女は、植物抽出物（ 図1）に適用されます。
図1： タバコHCP熱降水のための3つの異なる方法の実施例を示すプロセスフロースキームは、植物材料を洗浄し、明確化し、精製前の均質化されています。ブランチング工程（赤色）のための装置は、容易に既存の機械に追加することができます。これとは対照的に、攪拌容器（橙）、特に熱交換器（青）を使用して、1つまたはいくつかの追加の機器や配管を必要とします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.タバコ植物を育成
- 脱イオン水を1〜2 Lで各ミネラルウールブロックをフラッシュし、その後、0.1％の1 Lと肥料溶液[w / vの]。各ミネラルウールブロックに1タバコの種子を置き、優しくシード16を洗い流すことなく、肥料溶液の0.25 Lと面一に。
- 、相対湿度70％で温室で16時間の光周期7週間のタバコ植物を栽培（ - 1メートル - 180マイクロモル秒2と 、λ= 400から700 nm）を22分の25℃の明/暗温度領域。
- 植物の茎の基部に位置されている4つの子葉の葉、以外のすべての葉を収穫。
2.オプション：ブランチングによる熱降水
注：ブランチングによってタバコのHCPを沈殿させるために2.12〜ステップ2.1で説明する手順を実行します。 HCPが析出する場合は、セクション全体2をスキップ加熱された容器（セクション4）または熱交換器（第5節）を使用。
- 植物材料の脇に50グラムを設定し、（セクション3）をブランチングすることなく抽出を行います。その後の分析（セクション7）中の内部コントロールとして、この抽出物のサンプルを取ります。
- 熱絶縁発泡スチロールのバケットまたは類似の8 L作業容量の水槽、 例えば 、50×40×40センチ、設定します。その後の温度制御（ステップ2.7）のための水浴上で調節可能なサーモスタットをマウントします。
- 磁気撹拌プレート上にアセンブリ全体を転送し、水浴中で磁気攪拌棒を配置します。磁界が撹拌棒を回転させるのに十分な強度であることを確認してください。
- ポリプロピレンバスケット（ステップ2.6）はブランチング手順中に、後に置かれる時に、少なくとも4つの支持タイルで撹拌棒を囲みます。サポートタイルは非磁性材料（ 例えば 、ステンレス合金を含むニッケル）から作られていることを確認して、その彼ら攪拌棒（ 図2）よりも高いです。
- 水浴に脱イオン水8 Lを追加します。
注：低pHの沈殿が問題になる場合、例えば 、緩衝液を用いて、50 mMリン酸ナトリウム（pHは7.5）が、標的タンパク質の収量を改善することができます。 - サポートタイルに23のx 23のx 23センチポリプロピレンバスケットを置き、バスケットは攪拌棒の回転を妨げないことを確認して、それが完全に液体中に浸漬されていること。必要に応じて、バスケットが完全に水没するまで、再びバスケットを削除し、追加の水/バッファを追加します。
注意：2.12までのすべての後続のステップは、高温の液体の取り扱いを伴います。断熱手袋などの適切な保護具を着用してください。 - 70°C（または実験のために必要な温度）に水浴をもたらすために調節可能なサーモスタットを使用してください。所望の温度にTHERMAに達したアセンブリ全体を確実にするために到達した後、少なくとも15分待ちリットル平衡。
- 収穫したタバコの葉から150グラムのアリコートを準備します。引き裂くことによって、例えば非可逆圧縮や葉への損傷を回避しながら、バスケットに1つのアリコートを置きます。植物材料または後者の密なパッキングとバスケットを過剰充填しないでください。
- 慎重が、すぐに熱い液体にバスケットを沈め、サポートタイルの上に置きます。浮選を防ぐためにバスケットの上にステンレス鋼製のブロックを配置します。
- ブランチング液に5分間の葉をインキュベートし、または実験デザインに合っ時間を選択します。全体のインキュベーション期間中の液体の温度を監視します。
- 慎重にブランチング液からのバスケットを削除し、30秒間葉から残留液の排出をしましょう。その後、植物がバスケットの外に出る取るブレンダーに転送し、直ちに抽出（セクション3）を起動します。
注：植物はブランチング後や目の開始前に長期間保つことができますEの抽出は、 例えば、30以上の氷の上で分または数週間のために-20℃で凍結が正常にテストされています。しかし、製品の安定性は、貯蔵時間を増加させ、したがって、即時処理が推奨されて低下する可能性があります。 - 全体収穫したバイオマスが処理されるまで繰り返して、新鮮な葉材料で2.11から2.8を繰り返します。
タバコの葉から3.タンパク質抽出
注意：次の手順は、回転するブレードを備えたブレンダーを伴います。それはブレンダーモータに搭載されている間ブレンダーバケツに動作しません。
- 回収し（ステップ1.3）又は湯通し（ステップ2.11）を150g（湿潤質量）を配置し、ブレンダーに残し、抽出緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、500mMの塩化ナトリウム、10mMの二亜硫酸ナトリウム、pH8.0）で450mlのを加えます。
注：抽出緩衝液組成物が抽出されるタンパク質に依存し、したがって、そのようなTrのような別のpH調整、 例えば 、使用または緩衝剤成分を必要とすることができますです。 - 30秒で3×30秒のパルスの葉は休憩を散在ホモジナイズします。葉が均質化しており、ブレンダーバケットを詰まらせていないことを確認してください。ブレンダーを停止し、必要に応じて目詰まりを防止するために、葉を持ち上げ、その後、均質化を続けます。
- その後の分析（セクション7）のために生成された各抽出物の1ミリリットルのサンプルを取ります。植物材料をブランチングされている場合は、それ以外の場合は、選択した実験的なアプローチに応じて、容器内の熱沈殿（セクション4）または熱交換器（第5節）と続け部6に進みます。
4.オプション：撹拌容器内の熱降水
注：撹拌容器にタバコのHCPを沈殿させるために4.11にセクション4.2で説明する手順を実施します。 HCPは、（セクション2）をブランチングすることにより沈殿されたか、熱交換器（第5節）を用いて沈殿された場合、セクション全体4をスキップします。
- 2つの8-L作業容量の水を設定します断熱発泡ポリスチレンまたは類似で風呂、 例えば、50×40×40センチ、。最初のお風呂では、その後の温度制御（ステップ4.6）のための調整可能なサーモスタットをマウントします。第二には、その後の冷却（ステップ4.9）のための脱イオン水5リットルと氷の2キロを追加します。
- 磁気撹拌プレート上に第一の水浴を転送し、容器の中心を攪拌プレートの中央に位置合わせされるように水槽に2リットルのステンレス鋼容器を置きます。
- ステンレス製容器内の磁気攪拌棒を置きます。磁界が撹拌棒を回転させるのに十分な強度であることを確認してください。
- ステンレス容器の上端より5 cmの脱イオン水で水浴を埋めます。そして、抽出バッファーで容器を埋めます。容器に発泡スチロールの蓋を置きます。
注意：4.9までのすべての後続のステップは、高温の液体の取り扱いを伴います。熱インを含む適切な個人用保護具を着用します手袋をulated。 - 発泡スチロールの蓋で合った穴を介してステンレス製の容器に温度計を挿入します。 78°Cの水浴温度を設定し、熱平衡に到達するために15分間、アセンブリ全体をインキュベートします。容器内の温度が約8℃の水浴のセットポイント以下、70°Cであることを確認してください。
- ステンレス製容器内の温度を70°Cと異なる場合、それに応じて水浴の温度を調節し、システムは、さらに15分間平衡化させ。容器内の温度が70℃になるまで、または実験のために、必要に応じてこの手順を繰り返して、ステンレス製の容器を空にします。
- それは水浴中である間に、ステンレス製容器に抽出（ステップ3.2）の300ミリリットルを入れ、タイマーを開始します。 150rpmでの抽出物を攪拌し、5分間インキュベートします。抽出物は、このインキュベーション期間中に少なくとも2分間、70℃の温度に達していることを確認してください。
- 、マグネチックスターラーから湯浴を取り外しステンレス製容器を取り出し、氷のように冷たいバケツに入れてください。マグネチックスターラー上に、後者を置き、発泡スチロールのふたを取り外します。
- 、植物のホモジネートはよく150rpmで攪拌されていることを確認した抽出物に温度計を配置し、それが20°Cの温度や実験計画で指定された温度に達するまでインキュベートします。
- 繰り返しは、すべてのアリコートのために4.7〜4.9を繰り返します。各ヒートの1ミリリットルのサンプルを取り、それが最終温度に達した後のセクション6に進み、その後、抽出し沈殿させました。
5.オプション：熱交換器の熱降水
注：熱交換器を使用して、タバコのHCPを沈殿させるために5.12にセクション5.2で説明する手順を実施します。 HCPは、（セクション2）をブランチングすることによって、または加熱された容器（セクション4）中で沈殿されている場合、セクション全体5をスキップします。
- 2つの8-L作業容量を設定します熱絶縁された発泡スチロールバケットまたは類似の水浴場、 例えば、50×40×40センチ、。最初のお風呂では、その後の温度制御（ステップ5.3）のための調整可能なサーモスタットをマウントします。第二には、その後の冷却（ステップ5.10）のための脱イオン水5リットルと氷の2キロを追加します。
注意：5.9までのすべての後続のステップは、高温の液体の取り扱いを伴います。断熱手袋などの適切な保護具を着用してください。 - 8 L脱イオン水で最初の水浴を埋めます。サーモスタットを使用して74.5℃に温度を設定します。熱平衡に到達するために15分間アセンブリインキュベートします。
- 1-Lのプラスチックビーカーに0.5リットルのプラスチックビーカーを置くことによって、断熱貯蔵容器を準備し、脱脂綿とのギャップを埋めます。代わりに、0.5リットルの作業容量で専用断熱容器を使用します。
- 一方の端にとパーソナルプラグイン上の出口ホースに蠕動ポンプに熱交換器を接続しますR L / S 24チューブを使用して終了します。両方のチューブが絶縁された貯蔵容器内の温度計と一緒に終了し、300ミリリットルの抽出緩衝液（ 図2）とそれを埋める置きます。
- 湯浴中に熱交換器を配置し、300ミリリットル分-1の速度で蠕動ポンプを起動します。容器中の得られた温度は3分後に、70℃、水浴の設定点より約4.5°Cであることを確認してください。
- 絶縁容器内の温度を70°Cと異なる場合、それに応じて水浴の温度を調節し、システムは、さらに15分間平衡化させ。 3分未満で70℃に周囲から抽出緩衝液の温度が上昇するまで、この手順を繰り返し、または実験のために必要なことと等しく、ステンレス製の容器を空にします。
- 絶縁された容器から抽出緩衝液を捨て、植物抽出物の300ミリリットルのアリコートを準備します。 1つのアリコートで断熱容器を埋めます。
- 5分間分-1 300ミリリットルで熱交換器を介して、植物抽出物（セクション3.3）をポンプ。抽出温度は3分後に70℃である、または実験デザインで定義された温度に等しいことを確認してください。
- 抽出物が依然としてポンピングしながら5分後、氷水浴に熱交換器を配置します。温度が正確に20゜C、または実験計画で定義された温度に達するまで、この設定でインキュベートします。
- 断熱容器から蠕動ポンプに接続された入口ホースを取り外し、熱交換器内から残留熱沈殿した植物抽出物を収集するためにポンピング続けます。その後、ポンプを停止します。
- 繰り返しは、すべてのアリコートのために5.10に5.7を繰り返します。それは最終温度に達するとバッグ濾過（セクション6）に抽出物を渡した後、各熱沈殿した抽出物の1-mlのサンプルを取ります。
注：5.10〜ステップ5.7を経て、最初のサイクルの後に何の抽出緩衝液は存在しませんステップ5.7で捨てます。
植物エキスの6袋ろ過
- フィルターハウジングに取り付け、柔軟なフィルター材料の機械的支持を提供された対応するサポートバスケットにバグフィルターをマウントします。バスケットの下に1-L容器を置き、150ミリリットル分-1の速度で、袋に（選択された熱処理に応じてセクション3.3、4.10または5.11）の抽出物のアリコートを適用します。
- 濾過後、濁度計を用いて、抽出緩衝液中でろ液の1:10希釈液の濁度を測定します。
- 1ミリリットルのサンプルを取り、実験デザインで定義されたバッグろ液を処理し、 例えば、深さ濾過、クロマトグラフィー7,10。
7.サンプル分析
- ブラッドフォード法24,25を用いて全可溶性タンパク質（TSP）の量を測定します。
- 三連では、単一のウェルに各サンプルの2.5μLをピペット96ウエルプレート。 2000μgのmlの-1 -範囲に0をカバーする三連で8ウシ血清アルブミン（BSA）の基準を含めます。
- 気泡を形成避けるために穏やかに十分な各ウェルに200μlのブラッドフォード試薬を加え、ピペッティングにより完全に混和するけど。
- 22℃で10分間インキュベートし、分光光度計で595 nmの吸光度を測定します。 BSAの基準点を介して、標準曲線に基づいて、試料中のTSP濃度を計算します。
- 表面プラズモン共鳴分光法26によってVax8を定量化します。
- セットアップ4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）ランニング緩衝液を用いた表面プラズモン共鳴装置（10mMのHEPES、3mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、1,500 mM塩化ナトリウム、0.05％（v / v）のポリソルベート20、 pHは7.4）とは、装置内にカルボキシメチル化デキストラン表面チップをマウントします。システムをフラッシュする主要機能を使用して、30の流量で手動実行を開始μlの分-1フローセルの上に1と2を注入30mMの塩化水素二倍の25mM水酸化ナトリウムの60秒散在噴射で60秒間。
- 500μgのミリリットル200μlの-1モノクローナル抗体5.2 10 mM酢酸ナトリウム（pH 4.0）中の溶液を調製します。解凍1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC） とNヒドロキシスクシンイミド（NHS）バイアルおよび1分間16,000×gで、それらを遠心。 NHSの70μlのEDCの70μLを混合し、7 mmのプラスチックバイアルに移します。
- 10μL分の流速でフローセル1と10分間2上にEDC / NHS混合物を注入することによりカルボキシメチル化デキストラン表面チップ表面を活性化-1。
- セル2のみを流す流路を設定します。 10μlの分-1の速度で15分のためにそれを注入することによってカップルのmAb 5.2。
- セル1と2を流れ、5μlの分の速度で7分間のエタノールアミンを注入-1表面を無効にするための流路を切り替えます。 T鶏は、25 mMの水酸化ナトリウムの60秒散在注射で60秒間回30 mMの塩化水素を注入します。
- 30μlの分の速度で19規格-1 180秒間-サンプルおよびMSP1を注入します。 Vax8濃度が50であることを確認してください-千ngのmlで-1。 HEPESで事前に希釈液を調製するには、必要に応じてEDTAおよびポリソルベート20（HBSEP）を含む緩衝生理食塩水。
- フローセル2とからフローセル1のピーク信号を減算し、MSP 1の信号に基づいて、試料中のVax8濃度を計算する差を使用- 500 ngのmlの既知のタンパク質濃度で19注射-1。
- 30μL分の流速で60秒間、30 mMの塩化水素に暴露することによって19注射-1 -各サンプルまたはMSP 1の後にチップ表面を再生します。
- 蛍光分光法によってのDsRedを定量
- 三連では、黒のハーフARの単一ウェルに各サンプルのピペットを50μlEA 96ウエルプレート。 225μgのmlの-1 -範囲に0をカバー6のDsRed基準を含めます。
- 分光光度計で530±30 nmの励起フィルターおよび590±35 nmの発光フィルターを使用して二重に蛍光を測定します。 DsRedの基準点を介して標準曲線に基づいて、試料中のDsRedの濃度を計算します。
- 粒度分布の決意
- 1mLのイソプロパノールでキュベットを洗浄した後、脱イオン水2mlでダスト粒子を除去します。キュベットにサンプルの850μLをピペット。
- ゼータ電位および粒径分析器にキュベットを置きます。 「ソフトウェア」を開き、分散剤などの材料として「タンパク質」および「PBS」で手動測定を開始します。 25℃の温度及び180秒の平衡時間を選択します。
- 173°後方散乱で「DTS0012」セルとメジャーを選択します。 「自動」FUNCTをチェック測定時間のためのイオンなし散在遅延で3回の測定を選択します。
- 測定は実験ビューでサンプルの3つの測定値を選択して完了すると、粒度分布のピークプロファイルを調査します。 「ボリュームPSD」タブを選択します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ブランチングによってタバコ宿主細胞タンパク質の熱沈殿
項2に記載のブランチング手順が成功したタバコは96±1％TSPを減らす、70°Cでの葉からのHCPを沈殿させるために使用した（N = 3）従って、Vax8標的タンパク質の51％まで回復し、そのを増加させながらクロマトグラフィー分離16前の0.1％から1.2％まで純度。それ64.1％と3.3％の純度を増加させる、蛍光タンパク質DsRedの83±1％（n = 3）を回収することも可能でした。ブランチング手順は簡単バイオマス洗浄、均質化、袋濾過および深層濾過からなる標準的な抽出と明確化スキーム（ 図1）7に統合されました。ブランチング機器を準備する（ 図2）は、日常的に20分を要し清澄化するデバイスには、設定時間に約5分を追加しました。別の7分を実行するのに必要とされました45分の典型的な抽出と明確化の時間に加えて、無傷の葉のブランチング。しかし、追加の7分の唯一の2分は、実際の「ハンズ・オン」の時間でした。また、1分未満の短いインキュベーション時間は約3分の7分のブランチング時間を短縮することも可能です。したがって、だけでなく、湯通しして、粗植物抽出物中の製品の初期純度を増加させるだけでなく、急速にこのように、少なくとも最初のクロマトグラフィー工程を交換する可能性を提供し、追加のプロセス装置で完了します。ブランチング浴温度はあっても、すぐに周囲温度であった収穫した葉を添加した後のすべての実験の間、 すなわち 、<0.2℃の揺らぎ、一定のままでした。これは、その後の清澄化工程におけるTSP低下、生成物収率及びフィルタ容量（ 図3の点で、プロセスは反復可能であった、 すなわち 、平均17％の変動係数（N = 24）を確保しました9、後にタンパク質抽出8とフィルタ助剤の後に凝集剤を添加することによって対処することができます。 60°Cの温度が80±3％を除去するのに十分であった（n = 3）でのHCPの2.6±0.1倍Vax8純度を増加させる（n = 3）は、フィルタ能力に影響を与えず。そのため、ブランチングによりHCP除去は適度な熱安定性を有する標的タンパク質、 すなわちと互換性があり、70℃以下の融解温度C 27,28。しかし、70℃以上に温度を上げると、95％以上のHCPの除去（ 図3）をもたらし得ます。これは多くともrの迅速な同定を可能にしたので、統計的手法22を使用して、うまく設計された方法での実験の対応する設定を行うために有用でしたelevantプロセスパラメータ、 すなわち、加熱時間及び温度。同時に、実験計画法は、プロセスの最適化16を容易にするための予測モデルを生成しました。
図2： 無傷の葉またはその抽出物中のタバコのHCPを沈殿させるために3つの方法の概略セットアップ A.ブランチングは、無傷の葉を含むバスケットが浸水したにサーモスタット（T）で加熱された水浴中で行いました。水浴は、均一で一定の温度を確保するために撹拌した。B.磁気攪拌棒及び葉抽出物を含有する容器を水浴に浸しました。抽出物の温度が必要な温度が達成されたことを保証するためにモニタリングした。C.熱交換器（H）は、ポンプ（P）と断熱storagに接続されました植物抽出物を含む電子管。熱交換器は、水浴中に沈めて加熱抽出液の温度をモニターした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： プロセスのパフォーマンスと2つの標的タンパク質の精製上における効果を示す三熱降水方法の比較A。。 HCPの90％以上の除去を支援する条件は、撹拌容器及び2.5倍の最小値によって標的タンパク質Vax8とのDsRedの純度を増加すべてが熱交換器の設定、および19の最大値をブランチングするために同定されました倍、とブランチング最高のパフォーマンス。これとは対照的に、唯一の撹拌容器のセットアップはsubseqの容量を増加しました熱処理された植物またはその抽出物の明確化のために使用されるuentデプスろ過工程。エラーバーは標準偏差（n = 3）。Bを示しています。異なる熱処理条件後のサンプルのHCP含量を分析し、クーマシー染色したポリアクリルアミドゲルを用いて比較することができます。 DsRedの（赤い矢印）が溶液中に残っているのに対してのRuBisCO（緑の矢印）は、熱処理が増加する時の温度などの他のHCPと一緒に削除されます。 * 0.5分間熱にさらされたサンプル、他のすべてのサンプルが3.0分以上処理した示します。再印刷16からの許可を得て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
撹拌容器中のHCPの熱沈殿
熱沈殿のための撹拌容器は、84±1％の最大値を削除した（n = 3）のHCP、純度Oを実現F 0.33±0.02％（n = 3）でVax8および20.2±1.4％（n = 3）でのDsRedのため（ 図3）。熱処理は、直列に複数のサンプルを処理するときに、デバイスの占有を反映遅延を防止するために、ホモジナイザーとは別の容器中で実施しました。実験室規模のプロセスに必要な処理労力はブランチングのためのものと同様であったが、追加のステンレス容器と専用の冷却工程が必要でした。さらに、抽出物への熱伝達は、ブランチングよりも10倍長く、少なくとも5分間のインキュベーション時間、 すなわち、と、ブランチング中よりも遅かったです。遅延された加熱転写を加熱するための追加の障壁を提起容器、および起因植物バイオマスに加えて、抽出緩衝液の存在下に容器中で加熱した〜300％高い質量によって引き起こされました。徐々に追加の熱伝達壁を構築し、労力を増大させる、また、容器の壁に付着したタンパク質を沈殿させますその後の洗浄のために必要。部分的にオープンなシステムでのエネルギー損失を補償熱沈殿のために使用される温度以上の水浴温度8℃に設定し、所望の抽出温度を達成しました。 （セクション2）と熱交換器のセットアップ（第5節）ブランチングとは対照的に、容器内のHCPの降水量は熱を通してエキスをポンプに比べて容器内の低い剪断力を反映して、2.5倍下流の深層ろ過の能力を増強しましたバッグの濾過工程で除去することが容易であったより大きな凝集体が得られ、おそらく、ブランチング後の交換または均質化。
熱交換器内のHCPの熱沈殿
約88.3±HCP含量の0.7％（N = 12）は一貫して60温度範囲内で熱交換器を使用して、抽出物から除去し、 - 70°Cで、Vax8ために0.31±0.01％（N = 12）の純度を達成することと27。6±2.0％（N = 12）のDsRedのため（ 図3）。平均変動係数は、この手順の再現性がブランチングよりも優れたことを示す13％（N = 24）でした。水浴温度は4.5°C高く設定した場合、所望の抽出温度は2〜3分後に達成されました。加熱された容器については、専用の冷却工程は、加熱処理後に必要でした。ポンプ装置と熱交換器は、狭口径ステンレス鋼管の壁に付着した沈殿に集中的な清掃を必要とするので、熱交換器は、他の方法よりも取り扱い努力を関与します。熱交換器は、また、目詰まりの前にのみ13.5±6.0（n = 3）をL mを-2明確最低下流デプスフィルター容量を達成しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
上記の熱沈殿のための3つの方法が効果的に任意のクロマトグラフィー精製ステップ16,17の前にタバコのHCPを削除することができます。彼らは、分泌タンパク質に限定されているすべてのそれらの初期生成物の純度を高めることを目指して他の戦略、 例えば、排水29、rhizosecretion 30または遠心抽出31,32を 、補完します。標的タンパク質は、以上1分〜60°Cの最低沈殿温度に耐えることができる精製される場合は、熱ベースの方法は、唯一の意味のある方法で使用することができます。したがって、3つの方法のいずれかの最初のステップは、いくつかの熱帯熱マラリア原虫抗原異なるドメイン16,18,21からなるいくつかのマラリアワクチン候補タンパク質について記載されている、十分に高い融解温度を有する標的分子を設計することです。標的タンパク質の熱安定性が実証された後、あります三つの方法で利用可能な機器とメディア、予想される最終的なプロセススケールおよびその後のDSP演算16に基づいて選択することができます。
ブランチングは、メソッドの最速であり、付加的な装置の要件は最小であったので、それは容易に植物由来の組換えタンパク質のための既存の実験室規模の精製プロトコルに実装することができます。ブランチング液の徹底攪拌は、実験データと理論計算21,33の両方に基づいて、HCP沈殿の効率に影響を与える重要なプロセスパラメータです。良好な混合を達成するために失敗すると、熱伝達を損ない、ホストプロテアーゼは21,34アクティブのままならば今度は製品に有害となる可能性が部分的にしかHCPの除去をもたらすことができます。いくつかの他のパラメータもHCP沈殿、 例えば、加熱温度およびインキュベーション時間に影響を与えることができ、および実験計画アプローチは、したがって、最も関連性のFAを特徴付けるために有用であり得ますctorsと、このような製品純度、回収およびその後のDSP 22ステップの性能として応答に及ぼす影響を定量化するための予測モデルを提供します。
容器の設定において、より長いインキュベーション時間は、完全なHCP沈殿を達成するために必要とされ、これは、高温に長時間暴露を反映し、望ましくない標的タンパク質の変性の可能性を増大させることができます。容器内のより完全な混合は、熱伝達を向上させ、加熱時間を減らすことができます。抽出液21,34中のプロテアーゼは、製品の損失を引き起こし、最終的な熱不活性化の前に、よりアクティブになる場合は、このセットアップでの長い温度上昇も挑戦することができます。
容器のセットアップのために観察された増加したデプスフィルター能力は、多くのサンプルが一定の予算でプロジェクトに扱うことができるようにするかexperimの与えられたセットのための全体的な資金需要を減少させる、消耗品のコストを削減するのに役立ちますエント。しかし、この利点は、実験計画の一部として、いくつかの抽出の実行は、 例えば実験、一連の必要とされる場合、プロセスホールド工程の導入を防止するためにホモジナイザーに加えて必要となる追加の容器のコストを上回ることができますアプローチ。より集中的な混合レジームは、上記示唆したように加熱時間を減少させるために使用される場合、フィルタ能力にプラスの効果も減少することができます。
専用の冷却工程はまた、流暢DoEの手順や一般の実験シーケンスと競合することができ、追加のリソースだけでなく、サンプルあたりの全体の処理時間を長くするだけでなく、を必要とする、両方のエキスをベースと熱沈殿法のために必要です。熱交換器の設定は十分工学の観点から、35を特徴とする、容易にスケールアップ時の表面対体積比の変更容器とは対照的に、設計され、特定の温度差のためにスケールアップすることができます。どうやって熱交換器の大きさが定義されると、これまで、その長さ、したがって、伝熱面積が固定されているので、代替の温度差を調整することが困難であることができます。
そのような滞留時間などの他のパラメータを変更する（または流量）と、熱交換媒体の温度、これらの因子は、典型的により処理規模操作に狭いウィンドウで操作されるので、ある程度まで、だけ小規模な実験の柔軟性を復元することができ利用可能な機器やメディアによる制限します。 5分および40の温度差 - - 3の短いインキュベーション時間の組み合わせの要求60°Cは、熱交換器の寸法が大きくなるため、プロセスの規模が大きくなるにつれて、デバイスレベルで解決することがますます困難になります。媒体および所望の抽出温度との温度差がしばしば小さいため、冷却工程のために特に当てはまる（ΔT= 10〜15°C）大型機器の寸法や長いクールダウン時間が生じる加熱工程（ΔT= 20-40℃）でより。
将来的には、プロトコルは、本研究で特に熱安定性のために設計されたワクチン候補以外の生物薬剤タンパク質に適合させることができます。多くの抗体は、すでに現在の熱処理プロトコルに対応している> 70°C 36,37の温度に耐えることができます。この天然の熱安定性は、それによってここに提示された方法（及びそのバリエーション）を受けることができるタンパク質の数を増加させる、異なる抗体ドメイン38を操作することによってさらに高めることができます。ブランチング方法は、既に熱安定性またはタンパク質工学のための選択の対象とされていないモノクローナル抗体（2G12）17を発現するトランスジェニックタバコ植物に適用されています。 65℃での熱処理は、因子による抗体の純度を増加させ2つの従来のクロマトグラフィー精製を回復はブランチングなしで観察されたものと同様でした。
高温、短時間39：また、発現系の個々のHCPの融解温度は、プロセスは、牛乳の低温殺菌に類似行うことができたとの温度の同定を容易にすることができる特徴付けます。 （ブランチングを除く）の熱処理は、製品が必要な温度に耐えることができる場合のHCPを除去するために、他の生物学的出発材料に適用することができます。後者は、哺乳動物細胞培養上清のような他の発現プラットフォームが処理されている場合、ここで説明したものから逸脱してもよいです。いずれの場合も、費用便益比が考慮されるべきである、 すなわち、減少HCPレベルの利点は、追加投資費用が発生し、熱処理工程を実施するためのコストを上回る処理時間が増加し、製品yieを減少させることができるんLD 16。この文脈で重要なパラメータは、製品の活動です。それはいくつかのタンパク質ベースのワクチンのような直線状エピトープの存在に依存する場合、その後の加熱処理は、効果40を有しにくいです。タンパク質構造は、立体配座エピトープは、例えば 、重要である場合は対照的に、酵素の活性部位におけるアミノ酸側鎖の正確な配向または領域を決定する抗体の相補の正しいフォールディングは、熱処理は、タンパク質活性41,42に干渉し得ます。従って、適切な分析アッセイは、熱処理前と後の製品の性能を監視するために確立されるべきです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示する利害の競合がありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
| Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
| Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
- PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
- Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
- Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
- Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
- Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
- Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940 (2016).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
- Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
- Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
- Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
- Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
- Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
- Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
- Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
- Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
- Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
- Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
- Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
- Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
- Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
- Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336 (2006).
- Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
- Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).
