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Biology

बरकरार पौधों blanching द्वारा या अर्क की गर्मी उपचार द्वारा तंबाकू मेजबान कोशिका प्रोटीन को हटाने के तरीकों की तुलना

Published: August 8, 2016 doi: 10.3791/54343
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

Summary

तीन गर्मी वर्षा के तरीकों को प्रभावी ढंग से प्रस्तुत कर रहे हैं कि तंबाकू से मेजबान कोशिका प्रोटीन (HCPs) की 90% से अधिक दूर करने के लिए किसी भी अन्य शुद्धि कदम से पहले निकालता है। संयंत्र HCPs अचल 60 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान पर कुल।

Abstract

पौधे न केवल मनुष्य के लिए भोजन, दूध और कच्चे माल उपलब्ध कराने, लेकिन यह भी इस तरह के एंटीबॉडी, टीका उम्मीदवारों और एंजाइमों के रूप में बायोफर्मासिटिकल प्रोटीन, के लिए एक किफायती उत्पादन प्रणाली के रूप में विकसित किया गया है। ये संयंत्र बायोमास से शुद्ध होना चाहिए लेकिन क्रोमैटोग्राफी कदम पौधों के अर्क में मेजबान कोशिका प्रोटीन (HCPs) की उच्च सांद्रता द्वारा बाधा कर रहे हैं। हालांकि, ज्यादातर HCPs अचल 60 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान लक्ष्य प्रोटीन के बाद शुद्धि की सुविधा पर कुल। इधर, तीन तरीकों या तो बरकरार पत्ते या अर्क में तंबाकू HCPs की गर्मी वर्षा प्राप्त करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। बरकरार पत्तियों का blanching आसानी से मौजूदा प्रक्रियाओं में शामिल किया जा सकता है, लेकिन बाद में निस्पंदन कदम पर एक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है। विपरीत एक उभारा पोत में पत्ता अर्क की गर्मी वर्षा, जो इस तरह के रूप में इस प्रक्रिया उपकरणों के डिजाइन में बड़े बदलाव, यद्यपि के साथ नीचे की ओर संचालन के प्रदर्शन में सुधार कर सकते हैं के लिए सच हैhomogenizer ज्यामिति। अंत में, एक हीट एक्सचेंजर सेटअप अच्छी तरह से गर्मी हस्तांतरण की स्थिति के संदर्भ में होती है और बड़े पैमाने करने के लिए आसान है, लेकिन सफाई के लिए मुश्किल हो सकता है और फिल्टर क्षमता पर नकारात्मक असर पड़ सकता है। डिजाइन के-प्रयोगों दृष्टिकोण HCP हटाने और उत्पाद वसूली प्रभावित करने वाले सबसे अधिक प्रासंगिक प्रक्रिया पैरामीटर की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह अन्य अभिव्यक्ति प्लेटफार्मों में प्रत्येक विधि और एक दिया शुद्धि रणनीति के लिए सबसे उपयुक्त विधि की पहचान के आवेदन की सुविधा।

Introduction

आधुनिक स्वास्थ्य सिस्टम तेजी से बायोफर्मासिटिकल प्रोटीन 1 पर निर्भर करते हैं। पौधों में ये प्रोटीन के उत्पादन के पारंपरिक अभिव्यक्ति सिस्टम 2-4 की तुलना में कम रोगज़नक़ बोझ और अधिक से अधिक scalability के कारण फायदेमंद है। हालांकि, संयंत्र व्युत्पन्न दवाइयों के बहाव प्रोसेसिंग (डीएसपी) चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि विघटनकारी निष्कर्षण प्रक्रियाओं turbidities 5000 Nephelometric मैलापन इकाइयों (NTUs) से अधिक है, और मेजबान कोशिका प्रोटीन (HCP) सांद्रता अक्सर 95 से अधिक के साथ एक उच्च कण बोझ में परिणाम, % [एम / एम] 5,6।

विस्तृत स्पष्टीकरण प्रक्रियाओं बिखरे कणों 7-9 दूर करने के लिए आवश्यक हैं, लेकिन क्रोमैटोग्राफी उपकरण कम प्रारंभिक उत्पाद वसूली के दौरान बाँध और Elute मोड में संचालित करने के लिए HCPs 10,11 के कुशल हटाने के लिए पहले के एक कदम है, तो महंगा है। इस लक्ष्य प्रोटीन floccul का उपयोग कर सकते हैं या तो precipitating द्वारा प्राप्त किया जा सकताचींटियों 12 या कम पीएच 13,14, साथ ही HCPs कुल करने के लिए पैदा कर रहा है। Ribulose-1,5-बाइफोस्फेट carboxylase / oxygenase (RuBisCO), इस तरह के तंबाकू (निकोटियाना Tabacum) के रूप में हरे पौधों में सबसे प्रचुर मात्रा में HCP, के चुनिंदा एकत्रीकरण पॉलीथीन ग्लाइकोल 15 जोड़कर पदोन्नत किया जा सकता है, लेकिन यह महंगा है और बड़े के साथ असंगत है -scale विनिर्माण। गर्मी उपचार denature और तंबाकू HCPs के 95% से अधिक वेग, जबकि इस तरह के Vax8 के रूप में प्रोटीन मलेरिया वैक्सीन उम्मीदवारों समाधान 16-18 में स्थिर रहने के लिए दिखाया गया है।

(I) blanching, यानी, गर्म तरल में बरकरार पत्तियों का विसर्जन, (ii) एक तापमान नियंत्रित हड़कंप मच गया पोत, और (iii) एक हीट एक्सचेंजर (: तीन अलग अलग दृष्टिकोण तंबाकू HCPs की गर्मी प्रेरित वर्षा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया चित्रा 1) 16। बरकरार पत्तियों के लिए, HCPs के तेजी से और कुशल वर्षा हासिल की और भी आसान था blanchingपैमाने पर और मौजूदा बड़े पैमाने पर विनिर्माण प्रक्रियाओं है कि संयंत्र बायोमास 19 धोने के लिए एक प्रारंभिक कदम शामिल हैं के साथ संगत करने के लिए। इसके विपरीत, तापमान नियंत्रित जहाजों पहले से ही कुछ प्रक्रियाओं में उपलब्ध हैं और के लिए संयंत्र के थर्मल उपचार के अर्क 20 है, लेकिन उनके scalability और ऊर्जा हस्तांतरण दर सीमित कर रहे हैं इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि टैंकों की सतह से मात्रा के अनुपात उत्तरोत्तर कम हो जाता है और प्रक्रिया पैमाने पर अनुपयुक्त हो जाता है। एक हीट एक्सचेंजर एक तकनीकी रूप से अच्छी तरह से परिभाषित विकल्प हड़कंप मच गया वाहिकाओं गरम किया जाता है, लेकिन हीटिंग और ठंडा मीडिया, जैसे, भाप और ठंडे पानी की आपूर्ति की भरमार है, साथ ही एक कसकर नियंत्रित बड़ा प्रवाह दर है कि हीट एक्सचेंजर ज्यामिति के लिए अनुकूल है की आवश्यकता है और मीडिया गुण, उदा।, विशिष्ट उष्मा। इस लेख से पता चलता है कि कैसे सभी तीन तरीकों को सामान्य रूप में तंबाकू HCPs, और संयंत्र HCPs की गर्मी प्रेरित वर्षा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्थापना और पूर्वी वायु कमान के ऑपरेशनएक प्रयोगशाला स्थापित करने में ज विधि बड़े पैमाने पर प्रक्रियाओं के लिए उनकी उपयुक्तता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बड़ी चुनौती प्रत्येक ऑपरेशन है कि उपकरणों और शर्तों प्रक्रिया पैमाने पर निर्माण के दौरान इस्तेमाल के समान के लिए पर्याप्त पैमाने नीचे मॉडल बनाने और चलाने की स्थिति की पहचान है। यहाँ प्रस्तुत डेटा ट्रांसजेनिक पौधों तंबाकू मलेरिया वैक्सीन उम्मीदवार Vax8 और फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त DsRed 16 के साथ किए गए प्रयोगों का उल्लेख है, लेकिन विधि भी सफलतापूर्वक एन लिए आवेदन किया है benthamiana पौधों क्षणिक अन्य बायोफर्मासिटिकल प्रोटीन 21 व्यक्त।

एक डिजाइन के-प्रयोगों (डीओई) 22 दृष्टिकोण के विकास की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के कर सकते हैं और flocculants 23 भी रूप में पहले 8 वर्णित इस संदर्भ में फायदेमंद हो सकता है। , Blanching गर्म वाहिकाओं और हीट एक्सचेंजर्स के बीच मुख्य अंतर यह है कि blanching जबकि ओ.टी. प्रारंभिक प्रक्रिया में बरकरार पत्तियों को लागू किया जाता हैउसकी पौधों के अर्क (चित्रा 1) को लागू कर रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1:। प्रक्रिया प्रवाह योजना तंबाकू HCP हीट वर्षा के लिए तीन अलग अलग तरीकों का कार्यान्वयन दृष्टांत संयंत्र सामग्री धोया और स्पष्टीकरण और शुद्धि से पहले homogenized है। blanching कदम (लाल) के लिए उपकरण आसानी से मौजूदा मशीनरी में जोड़ा जा सकता है। इसके विपरीत, एक उभारा पोत (नारंगी) और विशेष रूप से एक हीट एक्सचेंजर (नीला) का उपयोग कर एक या कई अतिरिक्त उपकरणों और ट्यूबिंग की आवश्यकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

1. तंबाकू पौधों की खेती

  1. 0.1% [w / V] उर्वरक समाधान के 1 एल के साथ 1 2 विआयनीकृत पानी की एल के लिए और बाद में साथ प्रत्येक खनिज ऊन ब्लॉक फ्लश। प्रत्येक खनिज ऊन ब्लॉक में एक तंबाकू बीज और धीरे बीज 16 दूर धोने के बिना उर्वरक समाधान के 0.25 एल के साथ फ्लश रखें।
  2. 70% सापेक्ष आर्द्रता के साथ एक ग्रीन हाउस में 7 सप्ताह के लिए तंबाकू पौधों की खेती, एक 16 घंटा फोटो पीरियड (180 μmol सेक - 1 एम - 2; λ = 400 - 700 एनएम) और एक 25/22 डिग्री सेल्सियस प्रकाश / अंधेरे तापमान शासन।
  3. चार गर्भदल पत्ते, जो संयंत्र स्तंभ के आधार पर स्थित हैं को छोड़कर सभी पत्ते हार्वेस्ट।

2. वैकल्पिक: गर्मी वर्षा blanching द्वारा

नोट: कदम आदेश blanching द्वारा तंबाकू HCPs वेग में 2.12 करने के लिए चरणों में वर्णित 2.1 बाहर ले। , पूरे धारा 2 जाएं HCPs उपजी हो जाएगा अगरएक गर्म पोत (धारा 4) या एक हीट एक्सचेंजर (धारा 5) का उपयोग करने में।

  1. संयंत्र सामग्री की तरफ 50 ग्राम सेट और (धारा 3) blanching बिना निकासी के लिए बाहर ले। बाद के विश्लेषण (धारा 7) के दौरान एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस निकालने का एक नमूना ले लो।
  2. एक 8 एल काम की मात्रा पानी से स्नान, जैसे, 50 x 40 x 40 सेमी, एक thermally अछूता polystyrene फोम बाल्टी या इसी तरह के सेट करें। बाद में तापमान नियंत्रण (कदम 2.7) के लिए पानी के स्नान पर समायोज्य थर्मोस्टेट माउंट।
  3. एक चुंबकीय हलचल थाली पर पूरे विधानसभा स्थानांतरण और नहाने के पानी में एक चुंबकीय हलचल बार जगह है। सुनिश्चित करें कि चुंबकीय क्षेत्र काफी मजबूत हलचल बार बारी बारी से करने के लिए है।
  4. कम से कम चार समर्थन टाइल्स जिस पर एक polypropylene टोकरी (कदम 2.6) blanching प्रक्रिया के दौरान बाद में रखा जाएगा साथ हलचल बार चारों ओर। सुनिश्चित करें कि समर्थन टाइल्स एक गैर चुंबकीय सामग्री (जैसे, स्टेनलेस स्टील मिश्र धातु युक्त निकल) से बना रहे हैं और कहा कि वेहलचल पट्टी (चित्रा 2) से अधिक है।
  5. विआयनीकृत पानी की 8 एल नहाने के पानी में जोड़े।
    नोट:।, एक बफर का उपयोग जैसे, 50 मिमी सोडियम फास्फेट (7.5 पीएच), लक्ष्य प्रोटीन पैदावार में सुधार कर सकते हैं, तो कम पीएच वर्षा एक मुद्दा है।
  6. समर्थन टाइल्स पर एक 23 x 23 x 23 सेमी polypropylene टोकरी जगह है और यकीन है कि टोकरी हलचल बार रोटेशन के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है और यह पूरी तरह से तरल में डूब जाता है। यदि आवश्यक हो, जब तक टोकरी पूरी तरह से डूबे हुए है, तब टोकरी फिर से हटाने के लिए अतिरिक्त पानी / बफर जोड़ें।
    चेतावनी: 2.12 अप करने के लिए सभी बाद के चरणों गर्म तरल की हैंडलिंग शामिल है। thermally अछूता दस्ताने सहित उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
  7. 70 डिग्री सेल्सियस (या तापमान प्रयोगों के लिए आवश्यक) को नहाने के पानी लाने के लिए समायोज्य थर्मोस्टेट का प्रयोग करें। कम से कम 15 मिनट के इंतजार के बाद वांछित तापमान एक THERMA तक पहुँच गया है पूरे विधानसभा सुनिश्चित करने के लिए पहुँच जाता हैएल संतुलन।
  8. काटा तंबाकू के पत्तों से 150 ग्राम aliquots तैयार करें। टोकरी में एक विभाज्य रखें जबकि, अपरिवर्तनीय संपीड़न और पत्तियों को नुकसान, जैसे परहेज फाड़। संयंत्र सामग्री या बाद के एक घने पैकिंग के साथ टोकरी overfilling से बचें।
  9. ध्यान लेकिन जल्दी गर्म तरल में डूब टोकरी और समर्थन टाइल पर जगह है। टोकरी तैरने की क्रिया को रोकने के लिए की चोटी पर एक स्टेनलेस स्टील ब्लॉक रखें।
  10. blanching तरल पदार्थ में 5 मिनट के लिए पत्ते सेते हैं, या एक समय प्रयोगात्मक डिजाइन suiting का चयन करें। पूरे ऊष्मायन अवधि के दौरान तरल तापमान पर नजर रखने।
  11. ध्यान से blanching तरल पदार्थ से टोकरी को हटाने और 30 सेकंड के लिए पत्तियों से अवशिष्ट तरल नाली करते हैं। तो ले संयंत्र टोकरी से बाहर छोड़ देता है, उन्हें ब्लेंडर के लिए स्थानांतरण और तुरंत निकासी (धारा 3) शुरू करते हैं।
    नोट: पौधों blanching के बाद और वें के शुरू होने से पहले समय की विस्तारित अवधि के लिए रखा जा सकता हैई निकासी, जैसे, बर्फ पर अधिक से अधिक 30 मिनट या कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया है। हालांकि, उत्पाद स्थिरता भंडारण बार बढ़ती जा रही है और इस तरह तत्काल प्रसंस्करण की सिफारिश की है साथ गिरावट हो सकती है।
  12. दोहराएँ ताजा पत्ती सामग्री के साथ 2.11 करने के लिए 2.8 कदम जब तक पूरे काटा बायोमास कार्रवाई की है।

3. तंबाकू के पत्तों से प्रोटीन निष्कर्षण

चेतावनी: अगले कदम के घूर्णन ब्लेड के साथ एक ब्लेंडर शामिल है। ब्लेंडर बाल्टी में काम करते हैं, जबकि यह ब्लेंडर मोटर पर मुहिम शुरू की है मत करो।

  1. काटा (1.3 चरण) या blanched (कदम 2.11) की 150 ग्राम (गीला मास) की जगह ब्लेंडर में छोड़ देता है और निष्कर्षण बफर (50 मिमी सोडियम फास्फेट, 500 मिमी सोडियम क्लोराइड, सोडियम 10 मिमी disulfite, पीएच 8.0) के 450 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: निष्कर्षण बफर रचना प्रोटीन निकाला जा करने के लिए पर निर्भर करता है और इस प्रकार समायोजन, जैसे, एक और पीएच के उपयोग की आवश्यकता है या इस तरह Tr के रूप में घटक बफर कर सकते हैंहै।
  2. 3 एक्स 30 सेकंड दालों के लिए पत्ते Homogenize 30 सेकंड के साथ टूटता है interspersed। सुनिश्चित करें कि पत्तियों homogenized हैं और ब्लेंडर बाल्टी रोकना नहीं है। ब्लेंडर बंद करो और पत्तियों उठा यदि आवश्यक हो तो clogging रोकने के लिए, और फिर homogenization जारी है।
  3. प्रत्येक निकालने कि बाद के विश्लेषण (धारा 7) का उत्पादन किया जाता है की एक 1 मिलीलीटर नमूना ले लो। संयंत्र सामग्री blanched है, तो धारा 6 के लिए जारी अन्यथा चयन किया प्रयोगात्मक दृष्टिकोण पर निर्भर करता है, एक बर्तन में गर्मी वर्षा (धारा 4) या हीट एक्सचेंजर (धारा 5) के साथ जारी है।

4. वैकल्पिक: एक उभारा बर्तन में गर्मी वर्षा

नोट: आदेश में एक उभारा पोत में तंबाकू HCPs वेग में कदम 4.11 वर्गों 4.2 में वर्णित आचरण। पूरे धारा 4 जाएं, अगर HCPs (खंड 2) blanching से उपजी किया गया है या एक हीट एक्सचेंजर (धारा 5) का उपयोग उपजी दिया जाएगा।

  1. दो 8 एल काम की मात्रा पानी के सेट अपस्नान, जैसे, 50 x 40 x 40 सेमी, thermally अछूता polystyrene फोम या इसी तरह की है। पहले स्नान में, बाद में तापमान नियंत्रण (4.6 कदम) के लिए समायोज्य थर्मोस्टेट माउंट। दूसरे में, विआयनीकृत पानी की 5 एल और बाद ठंडा (कदम 4.9) के लिए बर्फ के 2 किलो जोड़ें।
  2. एक चुंबकीय हलचल थाली पर पहले पानी से स्नान स्थानांतरण, और नहाने के पानी में इस तरह है कि पोत के केंद्र हलचल प्लेट के केंद्र के लिए गठबंधन किया है में 2-एल स्टेनलेस स्टील के बर्तन जगह है।
  3. स्टेनलेस स्टील के बर्तन में एक चुंबकीय हलचल पट्टी रखें। सुनिश्चित करें कि चुंबकीय क्षेत्र काफी मजबूत हलचल बार बारी बारी से करने के लिए है।
  4. स्टेनलेस स्टील के बर्तन के ऊपरी किनारे से नीचे 5 सेमी विआयनीकृत पानी से नहाने के पानी भरें। तब निकासी बफर के साथ पोत भरें। पोत पर एक polystyrene फोम ढक्कन रखें।
    चेतावनी: 4.9 अप करने के लिए सभी बाद के चरणों गर्म तरल की हैंडलिंग शामिल है। thermally आईएनएस सहित उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनेंसंचित दस्ताने।
  5. polystyrene फोम ढक्कन में एक suiting छेद के माध्यम से स्टेनलेस स्टील के बर्तन में एक थर्मामीटर डालें। 78 डिग्री सेल्सियस के लिए पानी से स्नान तापमान सेट और 15 मिनट के लिए पूरे विधानसभा सेते थर्मल संतुलन तक पहुँचने के लिए। सुनिश्चित करें पोत में तापमान 70 डिग्री सेल्सियस, नहाने के पानी के सेट बिंदु से नीचे लगभग 8 डिग्री सेल्सियस है।
  6. स्टेनलेस स्टील के बर्तन में तापमान 70 डिग्री सेल्सियस से अलग है, तो नहाने के पानी के तापमान के हिसाब से समायोजित करने और प्रणाली एक और 15 मिनट के लिए संतुलित करते हैं। इस चरण को दोहराएँ जब तक पोत में तापमान 70 डिग्री सेल्सियस है या के रूप में प्रयोग के लिए आवश्यक है, और स्टेनलेस स्टील के बर्तन खाली है।
  7. स्टेनलेस स्टील के बर्तन में निकालने (3.2 कदम) के 300 मिलीलीटर डालो यह अभी भी नहाने के पानी में है, जबकि और एक टाइमर शुरू करते हैं। 150 rpm पर निकालने हलचल और 5 मिनट के लिए सेते हैं। सुनिश्चित करें कि निकालने इस ऊष्मायन अवधि के दौरान कम से कम 2 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस के तापमान तक पहुँचता है।
  8. चुंबकीय उत्तेजक से गर्म पानी से स्नान निकालें, स्टेनलेस स्टील के बर्तन बाहर ले और ठंडा बाल्टी में जगह है। चुंबकीय उत्तेजक पर रखें उत्तरार्द्ध और polystyrene फोम ढक्कन हटा दें।
  9. सुनिश्चित करें कि संयंत्र homogenate अच्छी तरह से 150 rpm पर उत्तेजित है, निकालने में थर्मामीटर जगह और सेते हैं जब तक यह 20 डिग्री सेल्सियस के तापमान या तापमान प्रयोगात्मक डिजाइन द्वारा निर्दिष्ट पहुंचता है।
  10. दोहराएँ 4.7 सभी aliquots के लिए 4.9 कदम। प्रत्येक गर्मी के 1 मिलीलीटर नमूना ले लो एक बार इसे अंतिम तापमान तक पहुँच गया है, तो धारा 6 के साथ आगे बढ़ना निकालने उपजी।

5. वैकल्पिक: एक हीट एक्सचेंजर में हीट वर्षा

नोट: आदेश में एक हीट एक्सचेंजर का उपयोग कर तंबाकू HCPs वेग में कदम 5.2 5.12 वर्गों में वर्णित आचरण। पूरे खंड 5 में जाएं, अगर HCPs (खंड 2) blanching द्वारा या एक गर्म पोत (धारा 4) में उपजी किया गया है।

  1. दो 8 एल काम की मात्रा निर्धारित करेंपानी स्नान, जैसे, 50 x 40 x 40 सेमी, thermally अछूता polystyrene फोम बाल्टी या इसी तरह की है। पहले स्नान में, बाद में तापमान नियंत्रण (5.3 चरण) के लिए समायोज्य थर्मोस्टेट माउंट। दूसरे में, विआयनीकृत पानी की 5 एल और बाद ठंडा (कदम 5.10) के लिए बर्फ के 2 किलो जोड़ें।
    चेतावनी: 5.9 अप करने के लिए सभी बाद के चरणों गर्म तरल की हैंडलिंग शामिल है। thermally अछूता दस्ताने सहित उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
  2. 8 एल विआयनीकृत पानी के साथ पहली बार नहाने के पानी भरें। थर्मोस्टेट का उपयोग कर 74.5 डिग्री सेल्सियस तक तापमान सेट करें। 15 मिनट के लिए विधानसभा सेते थर्मल संतुलन तक पहुँचने के लिए।
  3. एक 1-एल प्लास्टिक बीकर में एक 0.5 एल प्लास्टिक बीकर रखकर एक अछूता भंडारण पोत को तैयार है और रूई के साथ अंतराल को भरने के। वैकल्पिक रूप से, एक 0.5-एल काम की मात्रा के साथ एक समर्पित thermally अछूता पोत का उपयोग करें।
  4. एक छोर पर और othe पर एक दुकान नली को क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए हीट एक्सचेंजर कनेक्टआर एल / एस 24 ट्यूबिंग का उपयोग कर खत्म होता है। दोनों रखें ट्यूबिंग अछूता भंडारण के बर्तन में एक थर्मामीटर के साथ समाप्त होता है और 300 मिलीलीटर निष्कर्षण बफर (चित्रा 2) के साथ भरें।
  5. हीट एक्सचेंजर गर्म पानी से स्नान में रखें और 300 मिलीलीटर मिनट -1 की दर से क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप शुरू करते हैं। सुनिश्चित करें पोत में जिसके परिणामस्वरूप तापमान 70 डिग्री सेल्सियस, नहाने के पानी के सेट बिंदु से नीचे लगभग 4.5 डिग्री सेल्सियस है कि, 3 मिनट के बाद।
  6. अछूता वाहिका में तापमान 70 डिग्री सेल्सियस से भिन्न होता है, उसी के अनुसार पानी के स्नान के तापमान को समायोजित करने और प्रणाली एक और 15 मिनट के लिए संतुलित करते हैं। कम से कम 3 मिनट में 70 डिग्री सेल्सियस के परिवेश से निकासी बफर का बढ़ता तापमान जब तक इस चरण को दोहराएँ, या कि प्रयोग के लिए आवश्यक बराबर होती है, और स्टेनलेस स्टील के बर्तन खाली है।
  7. अछूता पोत से निकासी बफर त्यागें और संयंत्र निकालने की 300 मिलीलीटर aliquots तैयार करते हैं। एक विभाज्य से अछूता पोत भरें।
  8. मिनट -1 300 मिलीलीटर में हीट एक्सचेंजर के माध्यम से संयंत्र निकालने (धारा 3.3) पंप 5 मिनट के लिए। सुनिश्चित करें कि निकालने तापमान 3 मिनट के बाद 70 डिग्री सेल्सियस है, या तापमान प्रयोगात्मक डिजाइन में परिभाषित बराबर होती है।
  9. 5 मिनट के बाद, बर्फ के ठंडे पानी के स्नान में हीट एक्सचेंजर जगह है, जबकि निकालने अभी भी लगाया जा रहा है। इस सेटिंग में सेते हैं जब तक तापमान वास्तव में पहुंचता है 20 डिग्री सेल्सियस, या तापमान प्रयोगात्मक डिजाइन में परिभाषित किया।
  10. इनलेट अछूता पोत से क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से जुड़ा नली निकालें और हीट एक्सचेंजर के भीतर से अवशिष्ट गर्मी उपजी संयंत्र निकालने इकट्ठा करने के लिए पम्पिंग जारी है। फिर पंप बंद करो।
  11. दोहराएँ 5.7 सभी aliquots के लिए 5.10 करने के लिए कदम। एक बार इसे अंतिम तापमान तक पहुँच गया है, तो बैग निस्पंदन (धारा 6) को निष्कर्षों पर पारित प्रत्येक गर्मी उपजी निकालने की एक 1 मिलीलीटर नमूना ले लो।
    नोट: के बाद पहली बार एक चक्र के माध्यम से 5.10 के लिए 5.7 कदम के लिए कोई निकासी बफर हो जाएगाकदम 5.7 में त्यागें।

6. संयंत्र निकालने की बैग निस्पंदन

  1. इसी समर्थन टोकरी जो फिल्टर आवास में लगाया है और लचीला फिल्टर सामग्री के लिए यांत्रिक सहायता प्रदान करता है में एक बैग फिल्टर माउंट। एक 1-एल पोत टोकरी के नीचे रखें और 150 मिलीलीटर मिनट -1 की दर से बैग को निकालने aliquots (धारा 3.3, 4.10 या 5.11 से चयनित गर्मी उपचार के आधार पर) लागू होते हैं।
  2. छानने के बाद, turbidimeter का उपयोग कर निकासी बफर में छानना के 1:10 कमजोर पड़ने की मलिनता को मापने।
  3. 1 मिलीलीटर नमूना जैसे गहराई निस्पंदन और क्रोमैटोग्राफी 7,10 ले लो और बैग छानना की प्रक्रिया के रूप में प्रयोगात्मक डिजाइन में परिभाषित।

7. नमूना विश्लेषण

  1. कुल घुलनशील प्रोटीन (टीएसपी) की मात्रा ब्रैडफोर्ड विधि 24,25 का उपयोग को मापने।
    1. तीन प्रतियों में, एक के एकल कुओं में प्रत्येक नमूने की 2.5 μl पिपेट96 अच्छी तरह से थाली। 2,000 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 - तीन प्रतियों में आठ गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के मानकों रेंज 0 को कवर को शामिल करें।
    2. बुलबुले के गठन से बचने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 200 μl ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से लेकिन धीरे काफी है।
    3. 22 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 595 एनएम पर absorbance के उपाय। बीएसए संदर्भ बिंदुओं के माध्यम से एक मानक वक्र के आधार पर नमूनों में टीएसपी एकाग्रता की गणना।
  2. सतह plasmon अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी 26 से Vax8 यों।
    1. सेटअप 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) चल बफर के साथ सतह plasmon अनुनाद साधन (10 मिमी HEPES, 3 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 1500 मिमी सोडियम क्लोराइड, 0.05% वी / वी polysorbate 20, 7.4 पीएच) और डिवाइस में एक carboxymethylated dextran सतह चिप माउंट। सिस्टम फ्लश करने के लिए प्रधानमंत्री समारोह का प्रयोग करें और 30 के प्रवाह की दर के साथ एक मैनुअल रन शुरूμl मिनट -1 प्रवाह कोशिकाओं 1 और 25 मिमी सोडियम हाइड्रॉक्साइड के एक 60 सेकंड interspersed इंजेक्शन के साथ 2. इंजेक्षन 30 मिमी हाइड्रोजन क्लोराइड 60 सेकंड के लिए दो बार से अधिक।
    2. एक 500 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम के 200 μl -1 एमएबी 5.2 10 मिमी सोडियम एसीटेट (पीएच 4.0) में समाधान तैयार है। पिघलना 1-इथाइल-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी) और एन -hydroxysuccinimide (एनएचएस) शीशियों और 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र। एन एच एस के 70 μl के साथ ईडीसी के 70 μl मिक्स और एक 7 मिमी प्लास्टिक की शीशी के लिए स्थानांतरण।
    3. 10 μl मिनट -1 के प्रवाह की दर के साथ 10 मिनट के लिए प्रवाह कोशिकाओं पर 1 EDC / एनएचएस मिश्रण और 2 इंजेक्शन द्वारा carboxymethylated dextran सतह चिप सतह को सक्रिय करें।
    4. प्रवाह करने के लिए सेल 2 केवल प्रवाह पथ सेट करें। युगल एमएबी 5.2 μl 10 मिनट -1 की दर से 15 मिनट के लिए यह इंजेक्शन लगाने के द्वारा।
    5. प्रवाह पथ स्विच कोशिकाओं 1 और 2 के प्रवाह और मिनट -1 सतह को निष्क्रिय करने के लिए 5 μl की दर से 7 मिनट के लिए ethanolamine इंजेक्षन करने के लिए। टीमुर्गी 25 मिमी सोडियम हाइड्रॉक्साइड के एक 60 सेकंड interspersed इंजेक्शन के साथ 60 सेकंड के लिए दो बार 30 मिमी हाइड्रोजन क्लोराइड इंजेक्षन।
    6. 30 μl मिनट की दर से 19 मानकों -1 180 सेकंड के लिए - नमूने और MSP1 इंजेक्षन। सुनिश्चित करें कि Vax8 एकाग्रता 50 है - 1,000 एनजी मिलीलीटर -1। HEPES में पूर्व dilutions तैयार EDTA और polysorbate 20 (HBSEP) युक्त यदि आवश्यक हो तो खारा बफर।
    7. प्रवाह सेल 2 के उस से प्रवाह सेल 1 के शिखर संकेत घटाना और नमूनों में Vax8 एकाग्रता एमएसपी 1 के संकेत के आधार पर गणना करने के लिए अंतर का उपयोग करें - 500 एनजी मिलीलीटर -1 के एक ज्ञात प्रोटीन एकाग्रता के साथ 19 इंजेक्शन।
    8. 30 μl मिनट की एक प्रवाह दर पर 60 सेकंड के लिए 30 मिमी हाइड्रोजन क्लोराइड के लिए जोखिम के 19 इंजेक्शन -1 - प्रत्येक नमूना या एमएसपी 1 के बाद चिप सतह पुनर्जन्म।
  3. प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा DsRed यों
    1. तीन प्रतियों में, पिपेट 50 एक काले रंग की आधा गिरफ्तारी के एकल कुओं में प्रत्येक नमूने की μlईए 96 अच्छी तरह से थाली। 225 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 - छह DsRed मानकों रेंज 0 को कवर को शामिल करें।
    2. दो प्रतियों में प्रतिदीप्ति उपाय एक 530 ± 30 एनएम उत्तेजना फिल्टर और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में एक 590 ± 35 एनएम उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग। DsRed संदर्भ बिंदुओं के माध्यम से एक मानक वक्र के आधार पर नमूनों में DsRed एकाग्रता की गणना।
  4. कण आकार के वितरण का निर्धारण
    1. 1 मिलीलीटर isopropanol साथ एक क्युवेट धोने और फिर विआयनीकृत पानी के 2 मिलीलीटर के साथ धूल के कणों को हटा दें। क्युवेट में नमूने के 850 μl पिपेट।
    2. क्युवेट जीटा संभावित और कण आकार विश्लेषक में रखें। "सॉफ़्टवेयर" खोलें और सामग्री के रूप में "प्रोटीन" और छितरे के रूप में "पीबीएस" के साथ एक मैनुअल माप शुरू करते हैं। 25 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 180 सेकंड की एक संतुलन समय का चयन करें।
    3. 173 ° backscatter पर "DTS0012" सेल और उपाय चुनें। "ऑटो" funct चेकमाप अवधि के लिए आयन और कोई interspersed देरी से तीन माप का चयन करें।
    4. कण आकार के वितरण पीक प्रोफ़ाइल जांच एक बार माप प्रयोग देखें में नमूने के तीन माप का चयन करके पूरा हो गया है। "वॉल्यूम PSD" टैब का चयन करें।

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Representative Results

Blanching द्वारा तंबाकू मेजबान कोशिका प्रोटीन की गर्मी वर्षा
blanching प्रक्रिया धारा 2 में वर्णित सफलतापूर्वक HCPs वेग तंबाकू 70 डिग्री सेल्सियस के साथ छोड़ देता से 96 ± 1% से टीएसपी को कम करने, इस्तेमाल किया गया था (एन = 3) Vax8 लक्ष्य प्रोटीन का 51% तक ठीक हो, इस प्रकार बढ़ रही है, जबकि इसकी 0.1% से 1.2% से पवित्रता chromatographic जुदाई 16 से पहले। यह भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन DsRed के 83 ± 1% (एन = 3) ठीक करने के लिए, 64.1% से 3.3% से इसकी शुद्धता को बढ़ाने के लिए संभव था। Blanching प्रक्रिया को आसानी से (चित्रा 1) 7 बायोमास धोने, homogenization, बैग निस्पंदन और गहराई निस्पंदन से मिलकर एक मानक निष्कर्षण और स्पष्टीकरण योजना में एकीकृत किया गया। (चित्रा 2) blanching उपकरण तैयारी स्पष्टीकरण उपकरणों, जो नियमित रूप से 20 मिनट लगते हैं के लिए निर्धारित समय के बारे में 5 मिनट के लिए कहा। एक और 7 मिनट प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक था45 मिनट के विशिष्ट निष्कर्षण और स्पष्टीकरण के समय के अलावा बरकरार पत्तियों का blanching। हालांकि, अतिरिक्त 7 मिनट का केवल 2 मिनट वास्तविक "हाथों पर" समय था। इसके अतिरिक्त, कम से कम 1 मिनट से कम ऊष्मायन बार संभव हो रहे हैं, लगभग 3 मिनट के लिए 7 मिनट से blanching समय को कम करने। इसलिए, न केवल blanching कच्चे तेल संयंत्र निष्कर्षों में एक उत्पाद की प्रारंभिक पवित्रता बढ़ जाती है, लेकिन यह भी तेजी से कोई अतिरिक्त प्रक्रिया उपकरणों के साथ पूरा हो गया है, इस प्रकार के संभावित कम से कम एक प्रारंभिक क्रोमैटोग्राफी कदम को बदलने के लिए की पेशकश की। Blanching स्नान तापमान, निरंतर बनी यानी, <0.2 डिग्री सेल्सियस में उतार-चढ़ाव, सभी प्रयोगों भी तुरंत काटा पत्ते जो परिवेश के तापमान पर थे के बाद इसके अलावा दौरान। यह आंकड़ा 3 चम्मच कमी, उत्पाद की पैदावार और बाद में स्पष्टीकरण चरणों में फिल्टर क्षमता के संदर्भ में (यह सुनिश्चित प्रक्रिया है, repeatable था यानी, 17% की भिन्नता के एक औसत गुणांक (एन = 24) 9, जो बहाल करने या यहां तक कि फिल्टर क्षमताओं में वृद्धि कर सकते हैं के बाद प्रोटीन निकासी 8 और फिल्टर एड्स के बाद flocculants जोड़कर संबोधित किया जा सकता। 60 डिग्री सेल्सियस के तापमान (एन = 3) HCPs के हटाने 80 ± 3% और फिल्टर क्षमता को प्रभावित किए बिना Vax8 पवित्रता 2.6 ± 0.1 गुना (एन = 3) बढ़ाने के लिए पर्याप्त था। इसलिए, HCP हटाने blanching द्वारा लक्ष्य प्रोटीन है कि मध्यम गर्मी स्थिरता, यानी, 70 डिग्री सेल्सियस 27,28 के नीचे एक पिघलने के तापमान के साथ संगत है। हालांकि, 70 डिग्री सेल्सियस या उससे अधिक के तापमान में वृद्धि 95% से अधिक (चित्रा 3) के एक HCP हटाने में परिणाम हो सकता है। क्योंकि यह सबसे आर की तेजी से पहचान की अनुमति दी यह एक सांख्यिकीय दृष्टिकोण 22 का उपयोग कर एक अच्छी तरह से डिजाइन तरीके से प्रयोगों की इसी सेट संचालन करने के लिए उपयोगी थाelevant प्रक्रिया के मानकों, यानी, हीटिंग समय और तापमान। इसी समय, डो विधि अनुकूलन प्रक्रिया 16 की सुविधा के लिए एक भविष्य कहनेवाला मॉडल उत्पन्न।

चित्र 2
चित्रा 2:। तीन तरीकों में से योजनाबद्ध सेटअप बरकरार पत्ते या अर्क तत्संबंधी ए blanching एक थर्मोस्टेट (टी) में जो एक टोकरी बरकरार पत्तियों से युक्त डूब गया था के साथ गरम पानी के स्नान में बाहर किया गया था में तंबाकू HCPs वेग। नहाने के पानी में एक समरूप और लगातार तापमान सुनिश्चित करने के लिए उत्तेजित किया गया था। बी एक चुंबकीय हलचल बार और पत्ता निकालने युक्त पोत एक नहाने के पानी में डूब गया था। निकालने में तापमान सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि तापमान हासिल की थी नजर रखी थी। सी ए हीट एक्सचेंजर (एच) एक पंप (पी) और एक thermally अछूता storag से जुड़ा थाई पोत संयंत्र निकालने से युक्त। हीट एक्सचेंजर एक पानी के स्नान और गर्म निकालने नजर रखी थी के तापमान में डूब गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। तीन गर्मी वर्षा के तरीके प्रक्रिया प्रदर्शन पर उनके प्रभाव और दो ​​लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धि एक दिखाने की तुलना। HCPs के 90% से अधिक को हटाने के समर्थन शर्तें blanching, एक उभारा पोत और एक हीट एक्सचेंजर सेटअप, जो सभी के 2.5 गुना की एक न्यूनतम द्वारा लक्ष्य प्रोटीन Vax8 और DsRed की शुद्धता में वृद्धि हुई है और 19 वर्ष की एक अधिकतम के लिए पहचान की गई गुना, साथ blanching सबसे अच्छा प्रदर्शन। इसके विपरीत, केवल हड़कंप मच गया पोत सेटअप subseq की क्षमता में वृद्धिuent गहराई निस्पंदन इलाज गर्मी पौधों या अर्क के स्पष्टीकरण के लिए इस्तेमाल किया कदम है। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का संकेत (एन = 3)। बी। विभिन्न गर्मी उपचार के बाद की स्थिति के नमूनों की HCP सामग्री का विश्लेषण किया और Coomassie से सना हुआ polyacrylamide जैल का उपयोग की तुलना की जा सकती है। RuBisCO (हरी तीर) गर्मी उपचार के दौरान तापमान बढ़ जाती है के रूप में अन्य HCPs के साथ हटा दिया जाता है, जबकि DsRed (लाल तीर) के घोल में बनी हुई है। * इंगित करता है एक नमूने है कि 0.5 मिनट के लिए गर्म करने के लिए अवगत कराया गया था, अन्य सभी नमूनों 3.0 मिनट या अधिक के लिए इलाज किया गया। फिर से प्रिंट 16 से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक उभारा पोत में HCPs की गर्मी वर्षा
गर्मी वर्षा के लिए एक उभारा पोत 84 ± 1% की एक अधिकतम हटा (एन = 3) HCPs, एक पवित्रता ओ को प्राप्त करनेच 0.33 ± 0.02% (एन = 3) Vax8 के लिए और 20.2 ± 1.4% (एन = 3) DsRed के लिए (चित्रा 3)। गर्मी उपचार के एक पोत डिवाइस अधिभोग को दर्शाती है जब श्रृंखला में कई नमूने प्रसंस्करण देरी को रोकने के लिए homogenizer से अलग में बाहर किया गया था। से निपटने प्रयोगशाला पैमाने पर प्रक्रिया के लिए आवश्यक प्रयास blanching लेकिन एक अतिरिक्त स्टेनलेस स्टील के बर्तन और एक समर्पित ठंडा चरण आवश्यक थे कि इसी तरह की थी। इसके अलावा, निकालने के लिए गर्मी हस्तांतरण blanching के दौरान की तुलना में धीमी थी, 10 बार blanching के लिए की तुलना में अब कम से कम 5 मिनट के ऊष्मायन बार, यानी, के साथ। देरी हीटिंग पोत, जो एक अतिरिक्त बाधा उत्पन्न खतरे हस्तांतरण करने के लिए गर्मी की वजह से हुई, और ~ 300% अधिक से अधिक जन कि बायोमास संयंत्र के अलावा निकासी बफर की उपस्थिति के कारण बर्तन में गर्म था। प्रोटीन भी पोत की दीवारों का पालन precipitating, धीरे-धीरे एक अतिरिक्त गर्मी हस्तांतरण बाधा के निर्माण और प्रयास में वृद्धिबाद में सफाई के लिए जरूरी है। गर्मी वर्षा आंशिक रूप से खुला प्रणाली में ऊर्जा नुकसान के लिए मुआवजा के लिए इस्तेमाल किया तापमान ऊपर पानी से स्नान तापमान 8 डिग्री सेल्सियस की स्थापना और वांछित निकालने तापमान हासिल की। एक बर्तन में blanching (धारा 2) और हीट एक्सचेंजर सेटअप (धारा 5), HCP वर्षा के विपरीत द्वारा 2.5 गुना नीचे की ओर गहराई निस्पंदन की क्षमता वृद्धि हुई है, गर्मी के माध्यम से निकालने से पंप की तुलना में कम पोत सरासर बलों को दर्शाती है एक्सचेंजर या blanching के बाद homogenization, शायद बड़ा समुच्चय बैग निस्पंदन कदम में दूर करने के लिए आसान थे कि हो जाती है।

एक हीट एक्सचेंजर में HCPs की गर्मी वर्षा
लगभग 88.3 ± 0.7% (एन = 12) HCP सामग्री की लगातार तापमान सीमा के भीतर एक हीट एक्सचेंजर का उपयोग कर निकालने से हटा दिया गया था 60 - 70 डिग्री सेल्सियस, Vax8 के लिए 0.31 ± 0.01% (एन = 12) की एक पवित्रता को प्राप्त करने और 27।6 ± 2.0% (एन = 12) DsRed के लिए (चित्रा 3)। बदलाव की औसत गुणांक था 13% (एन = 24) यह दर्शाता है कि इस प्रक्रिया के repeatability blanching से भी बेहतर था। वांछित निकालने के बाद तापमान ~ 3 मिनट हासिल की थी, तो नहाने के पानी के तापमान में 4.5 डिग्री सेल्सियस अधिक है स्थापित किया गया था। गर्म पोत के लिए के रूप में, एक समर्पित ठंडा कदम गर्मी उपचार के बाद आवश्यक था। हीट एक्सचेंजर क्योंकि पंप तंत्र और हीट एक्सचेंजर गहन सफाई आवश्यक वेग संकीर्ण बोर स्टेनलेस स्टील टयूबिंग की दीवारों का पालन करने के कारण अन्य तरीकों की तुलना में अधिक से निपटने के प्रयास शामिल किया गया। हीट एक्सचेंजर भी सबसे कम नीचे की ओर गहराई फिल्टर क्षमता, केवल 13.5 ± 6.0 (एन = 3) एल एम -2 स्पष्ट clogging से पहले हासिल की।

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Discussion

गर्मी वर्षा के लिए तीन ऊपर वर्णित विधि प्रभावी ढंग से किसी भी chromatographic शुद्धि कदम 16,17 से पहले तंबाकू HCPs निकाल सकते हैं। वे अन्य रणनीति है कि प्रारंभिक उत्पाद पवित्रता, जैसे, guttation 29, 30 या rhizosecretion केन्द्रापसारक निकासी 31,32, जो सभी के स्रावित प्रोटीन के लिए सीमित कर रहे हैं बढ़ाने के उद्देश्य के पूरक हैं। हालांकि, गर्मी आधारित विधियों केवल एक सार्थक तरीके से इस्तेमाल किया जा सकता है, तो लक्ष्य प्रोटीन अधिक से अधिक 1 मिनट के लिए ~ 60 डिग्री सेल्सियस के न्यूनतम तापमान का सामना कर सकते वर्षा शुद्ध किया जा सके। इसलिए, तीन तरीकों में से किसी में पहला कदम एक पर्याप्त उच्च तापमान के पिघलने, जो कई प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम मलेरिया से कई वैक्सीन उम्मीदवार अलग डोमेन से मिलकर प्रोटीन के लिए वर्णित किया गया है 16,18,21 प्रतिजनों के साथ एक लक्ष्य अणु डिजाइन करने के लिए है। एक बार लक्ष्य प्रोटीन के थर्मल स्थिरता प्रदर्शन किया गया है, एकके तीन तरीके उपलब्ध उपकरण और मीडिया, प्रत्याशित अंतिम प्रक्रिया पैमाने पर और बाद में डीएसपी के संचालन 16 के आधार पर चुना जा सकता है।

Blanching न्यूनतम तरीकों और अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकताओं के सबसे तेजी से गया था, तो यह आसानी से संयंत्र व्युत्पन्न पुनः संयोजक प्रोटीन के लिए मौजूदा प्रयोगशाला पैमाने पर शुद्धि प्रोटोकॉल में लागू किया जा सकता है। Blanching तरल की पूरी तरह से आंदोलन एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया पैरामीटर दोनों अनुभवजन्य डेटा और सैद्धांतिक गणना के आधार पर 21,33 HCP वर्षा की क्षमता को प्रभावित करता है। अच्छा मिश्रण केवल आंशिक HCP हटाने में गर्मी हस्तांतरण और परिणाम ख़राब कर सकते हैं, बारी में उत्पाद के लिए हानिकारक हो सकता है, जो अगर मेजबान proteases सक्रिय 21,34 रहने के लक्ष्य को हासिल करने में विफल रही। कई अन्य मानकों को भी HCP वर्षा, जैसे, हीटिंग तापमान और ऊष्मायन समय को प्रभावित कर सकते हैं, और एक हरिणी दृष्टिकोण इसलिए सबसे अधिक प्रासंगिक एफए को चिह्नित करने के लिए उपयोगी हो सकता हैctors और भविष्य कहनेवाला मॉडल उपलब्ध कराते हैं ऐसे उत्पाद पवित्रता, वसूली और डीएसपी कदम 22 बाद के प्रदर्शन के रूप में प्रतिक्रियाओं पर उनके प्रभाव यों की।

पोत सेटअप में, अब ऊष्मायन बार पूरा HCP वर्षा प्राप्त करने के लिए आवश्यक थे और इस उच्च तापमान के लिए विस्तारित जोखिम को दर्शाती अवांछनीय लक्ष्य प्रोटीन विकृतीकरण की संभावना बढ़ सकती है। पोत में अधिक पूरी तरह से मिश्रण गर्मी हस्तांतरण में सुधार लाने और हीटिंग की अवधि को कम कर सकता है। इस सेटअप में लंबे तापमान रैंप भी चुनौतीपूर्ण हो सकता है अगर निकालने 21,34 में proteases से पहले अंतिम गर्मी निष्क्रियता और अधिक सक्रिय हो जाते हैं, उत्पाद घाटे के कारण।

वृद्धि की गहराई फिल्टर क्षमता पोत स्थापना के लिए मनाया नमूनों की एक बड़ी संख्या को एक निश्चित बजट के साथ एक परियोजना में नियंत्रित किया जा करने के लिए अनुमति या experim का सेट दिया के लिए समग्र वित्त पोषण आवश्यकताओं को कम करने उपभोग्य लागत को कम करने में मदद कर सकते हैं,दस्तावेजों। हालांकि, इस लाभ एक हरिणी के हिस्से के रूप में, अतिरिक्त पोत की लागत, जो homogenizer के अलावा प्रक्रिया पकड़ कदम की शुरूआत को रोकने के लिए आवश्यक है, तो कई निकासी रन प्रयोगों, जैसे की एक श्रृंखला में आवश्यक हैं द्वारा outweighed किया जा सकता है दृष्टिकोण। अगर एक और अधिक गहन मिश्रण शासन के रूप में ऊपर का सुझाव दिया हीटिंग समय को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है फिल्टर क्षमता पर सकारात्मक प्रभाव भी कम हो सकता है।

एक समर्पित ठंडा कदम न केवल अतिरिक्त संसाधनों लेकिन यह भी नमूना प्रति समग्र प्रसंस्करण समय है, जो भी धाराप्रवाह डो प्रक्रियाओं या सामान्य में प्रयोगात्मक दृश्यों के साथ संघर्ष कर सकते हैं समय को बढ़ाने की आवश्यकता होती है दोनों निकालने आधारित गर्मी वर्षा के तरीकों के लिए आवश्यक है। हीट एक्सचेंजर सेटअप अच्छी तरह से एक इंजीनियरिंग के नजरिए से 35 होती है और आसानी से बनाया जा सकता है और विशिष्ट तापमान अंतर के लिए ऊपर पहुंचा, पोत, जिसका पैमाने अप के दौरान सतह से मात्रा के अनुपात में परिवर्तन के विपरीत। किस तरहकभी, एक बार हीट एक्सचेंजर आकार परिभाषित किया गया है, यह मुश्किल विकल्प तापमान अंतर को समायोजित करने के लिए है क्योंकि इसकी लंबाई और इस तरह गर्मी हस्तांतरण क्षेत्र तय कर रहे हैं हो सकता है।

इस तरह के निवास समय के रूप में अन्य मानकों, (या प्रवाह की दर) और हीट एक्सचेंजर माध्यम के तापमान में परिवर्तन, कुछ डिग्री करने के लिए लचीलापन बहाल कर सकते हैं, लेकिन केवल छोटे पैमाने पर प्रयोग में है, क्योंकि आम तौर पर इन कारकों प्रक्रिया पैमाने पर आपरेशन के कारण में संकीर्ण खिड़कियों में संचालित कर रहे हैं उपलब्ध उपकरणों और मीडिया द्वारा लगाए गए प्रतिबंध को। 5 मिनट और 40 के तापमान का अंतर - - 3 से कम ऊष्मायन बार के संयोजन के लिए मांग 60 डिग्री सेल्सियस प्रक्रिया पैमाने बढ़ जाती है के रूप में डिवाइस के स्तर पर हल करने के लिए, क्योंकि हीट एक्सचेंजर के आयामों को बड़ा बनने के लिए तेजी से मुश्किल हो जाता है। यह ठंडा कदम के लिए विशेष रूप से सच है, क्योंकि मध्यम और वांछित निकालने तापमान तापमान के बीच अंतर अक्सर छोटा होता है (ΔT = 10-15 डिग्री सेल्सियस)हीटिंग कदम (ΔT = 20-40 डिग्री सेल्सियस) बड़े उपकरणों आयाम या लंबे समय तक शांत डाउन समय में जिसके परिणामस्वरूप से।

भविष्य में, प्रोटोकॉल वैक्सीन उम्मीदवारों जो इस अध्ययन में विशेष रूप से थर्मल स्थिरता के लिए डिजाइन किए गए थे अलावा अन्य बायोफर्मासिटिकल प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। कई एंटीबॉडी> 70 डिग्री सेल्सियस 36,37 जो पहले से ही मौजूदा गर्मी उपचार प्रोटोकॉल के साथ संगत है के तापमान का सामना कर सकते हैं। यह प्राकृतिक थर्मल स्थिरता अलग एंटीबॉडी डोमेन के 38 इंजीनियरिंग, जिससे प्रोटीन है कि विधि (और उसके विविधताओं) यहाँ प्रस्तुत करने के लिए किए जा सकता है की संख्या में वृद्धि से आगे बढ़ाया जा सकता है। Blanching पद्धति पहले से ही ट्रांसजेनिक पौधों तंबाकू एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (2G12) 17 है, जो थर्मल स्थिरता या प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए चयन के अधीन नहीं किया गया व्यक्त करने के लिए लागू किया गया है। 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी उपचार का एक पहलू से एंटीबॉडी की शुद्धता में वृद्धि हुईदो chromatographic शुद्धि करने से पहले, जबकि वसूली blanching बिना मनाया समान था।

उच्च तापमान, कम समय 39: इसके अतिरिक्त, एक अभिव्यक्ति प्रणाली के व्यक्तिगत HCP पिघलने तापमान निस्र्पक एक तापमान के साथ जो प्रक्रिया दूध की ​​pasteurization के लिए इसी तरह का आयोजन किया जा सकता है की पहचान की सुविधा सकता है। गर्मी उपचार (blanching के लिए छोड़कर) भी HCPs दूर करने के लिए अगर इस उत्पाद को आवश्यक तापमान का सामना कर सकते हैं अन्य जैविक शुरुआती सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध यहाँ पर चर्चा करता है, तो इस तरह के स्तनधारी सेल संस्कृति supernatants के रूप में अन्य अभिव्यक्ति प्लेटफार्मों कार्रवाई की जा रही लोगों से विचलित हो सकता है। किसी भी मामले में, लागत लाभ अनुपात को ध्यान में रखा जाना चाहिए, यानी, कम HCP स्तरों के लाभ के एक गर्मी उपचार कदम है कि अतिरिक्त निवेश लागत का कारण बनता है को लागू करने के लिए लागत पल्ला झुकना करता प्रक्रिया में समय बढ़ जाती है और उत्पाद Yie कम कर सकते हैंएलडी 16। इस संदर्भ में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर उत्पाद गतिविधि है। अगर यह कुछ प्रोटीन आधारित टीके के लिए के रूप में रैखिक epitopes की उपस्थिति पर निर्भर करता है, तो गर्मी उपचार एक प्रभाव 40 की संभावना नहीं है। इसके विपरीत, यदि प्रोटीन संरचना महत्वपूर्ण है, जैसे, गठनात्मक epitopes के लिए है, एक एंजाइम के सक्रिय साइट में अमीनो एसिड पक्ष श्रृंखला की सटीक अभिविन्यास या एंटीबॉडी पूरकता की सही तह क्षेत्रों का निर्धारण, एक गर्मी उपचार प्रोटीन गतिविधि 41,42 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसलिए, उपयुक्त विश्लेषण assays के पहले और गर्मी उपचार के बाद उत्पाद के प्रदर्शन की निगरानी के लिए स्थापित किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई भी हितों के टकराव खुलासा करने के लिए नहीं थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100P Portable Turbidimeter Hach 4650000 Turbidimeter
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050  SPR chip coupling kit
Autoclaving basket Nalgene 6917-0230 Basket for leaf blanching
Biacore T200 GE Healthcare 28-9750-01 SPR device
Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM Sequip n.a. Particle size analyzer
Blender Waring 800EG Blender
BP-410 Furh 2632410001 Bag filter
Centrifuge 5415D Eppendorf 5424 000.410 Centrifuge
Centrifuge tube 15 ml Labomedic 2017106 Reaction tube
Centrifuge tube 50 ml self-standing Labomedic 1110504 Reaction tube
CM5 chip GE Healthcare BR100012  Chip for SPR measurements
Cuvette 10 x 10 x 45 Sarsted 67.754 Cuvette for Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8 Stat-Ease, Inc. n.a. DoE software
Disodium phosphate Carl Roth GmbH  4984.3  Media component
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Forma -86C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm Grodan 102446 Rockwool block
Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) n.a. (custom design) n.a. Heat exchanger
HEPES Carl Roth GmbH 9105.3 Media component
K200P 60D Pall 5302303 Depth filter layer
KS50P 60D Pall B12486 Depth filter layer
Lauda E300 Lauda Dr Wobser GmbH Z90010 Water bath thermostat
L/S 24 Masterflex SN-06508-24 Tubing
mAb 5.2 American Type Culture Collection HB-9148 Vax8 specific antibody
Masterflex L/S Masterflex HV-77921-75 Peristaltic pump
Miracloth Labomedic 475855-1R Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS WTW WTW_2020 pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Phytotron Ilka Zell n.a. For plant cultivation
Sodium disulfite Carl Roth GmbH 8554.1 Media component
Sodium chloride Carl Roth GmbH P029.2 Media component
Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm n.a. (custom design) n.a. Container for heat precipitation
Synergy HT BioTek SIAFRT Fluorescence and spectrometric plate reader
VelaPad 60 Pall VP60G03KNH4 Filter housing
Zetasizer Nano ZS Malvern ZEN3600 DLS particle size distribution measurement
Zetasizer Software v7.11 Malvern n.a. Software to operate the Zetasizer Nano ZS device

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References

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प्लांट बायोलॉजी अंक 114 मेजबान कोशिका प्रोटीन की कमी प्रयोगों (डीओई) डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण गर्मी वर्षा संयंत्र निकालने स्पष्टीकरण संयंत्र व्युत्पन्न दवाइयों के डिजाइन
बरकरार पौधों blanching द्वारा या अर्क की गर्मी उपचार द्वारा तंबाकू मेजबान कोशिका प्रोटीन को हटाने के तरीकों की तुलना
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Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer,… More

Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer, R. Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts. J. Vis. Exp. (114), e54343, doi:10.3791/54343 (2016).

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