Summary
Tres de calor se presentan métodos de precipitación que elimina de manera efectiva más de 90% de las proteínas de la célula huésped (HCP) de tabaco extrae antes de cualquier otra etapa de purificación. La planta de profesionales de la Salud irreversiblemente total a temperaturas superiores a 60 ° C.
Abstract
Las plantas no sólo proporcionan alimentos, piensos y materias primas para los seres humanos, sino que también se han desarrollado como un sistema de producción económica para las proteínas biofarmacéuticas, tales como anticuerpos, candidatas a vacunas y enzimas. Estos deben ser purificados a partir de la biomasa de la planta pero etapas de cromatografía se ven obstaculizados por las altas concentraciones de proteínas de la célula huésped (HCP) en extractos de plantas. Sin embargo, la mayoría de los profesionales de la Salud irreversiblemente agregan a temperaturas superiores a 60 ° C que facilitan la posterior purificación de la proteína diana. Aquí, tres métodos se presentan para lograr la precipitación de calor de HCP de tabaco, ya sea en hojas intactas o extractos. El blanqueo de las hojas intactas puede ser fácilmente incorporado en los procesos existentes, pero puede tener un impacto negativo en las etapas de filtración posteriores. Lo contrario es cierto para la precipitación de calor de extractos de hojas en un recipiente agitado, lo que puede mejorar el rendimiento de las operaciones aguas abajo aunque con cambios importantes en el diseño de equipos de proceso, tales comogeometría homogeneizador. Por último, una configuración de intercambiador de calor está bien caracterizado en términos de condiciones de transferencia de calor y fácil de escalar, pero la limpieza puede ser difícil y puede haber un impacto negativo en la capacidad del filtro. El enfoque de diseño de experimentos se puede utilizar para identificar los parámetros de proceso más importantes que afectan a la eliminación HCP y recuperación del producto. Esto facilita la aplicación de cada método en otras plataformas de expresión y la identificación del método más adecuado para una estrategia de purificación dado.
Introduction
Los sistemas de salud modernos dependen cada vez más de las proteínas biofarmacéuticas 1. La producción de estas proteínas en las plantas es ventajosa debido a la baja carga de patógenos y una mayor escalabilidad en comparación con los sistemas de expresión convencionales 2-4. Sin embargo, el procesamiento aguas abajo (DSP) de productos farmacéuticos derivados de plantas puede ser un reto debido a que los procedimientos de extracción de punta dan como resultado una alta carga de partículas, con turbidez inferior o igual a 5.000 unidades nefelométricas de turbidez (NTU), y la proteína de la célula huésped (HCP) las concentraciones menudo superior a 95 [m / m] 5,6%.
Se requieren procedimientos de aclaración elaborados para eliminar las partículas dispersas 7-9, pero un equipo de cromatografía es menos costoso de operar en el modo de vinculación y eluyen durante la recuperación inicial del producto si hay un paso anterior para la eliminación eficaz de los PCH 10,11. Esto se puede lograr ya sea por precipitación de la proteína diana utilizando floccul12 hormigas o de bajo pH 13,14, así como haciendo que el PCH a agregarse. La agregación selectiva de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa / oxigenasa (RuBisCO), el HCP más abundante en las plantas verdes tales como el tabaco (Nicotiana tabacum), puede promoverse mediante la adición de polietilenglicol 15, pero esto es caro e incompatible con gran -scale de fabricación. El tratamiento térmico se ha demostrado para desnaturalizar y precipitar más del 95% de los profesionales sanitarios de tabaco, mientras que los candidatos de la vacuna de la malaria proteína tales como Vax8 permanecen estables en solución 16-18.
Tres enfoques diferentes fueron usados para lograr la precipitación inducida por calor de PCH tabaco: (i) de blanqueo, es decir, la inmersión de hojas intactas en líquido caliente, (ii) una temperatura controlada recipiente de agitación, y (iii) un intercambiador de calor ( Figura 1) 16. Para hojas intactas, el blanqueado logrado la precipitación rápida y eficaz de los profesionales sanitarios y también fue fácilpara ampliar y compatible con los procesos de fabricación a gran escala existentes que incluyen un paso inicial para lavar la biomasa de la planta 19. En contraste, los vasos de temperatura controlada ya están disponibles en algunos procesos y se pueden utilizar para el tratamiento térmico de los extractos de plantas 20, pero su capacidad de ampliación y velocidad de transferencia de energía son limitados debido a que la relación de superficie a volumen de los tanques se reduce progresivamente y se convierte en no aptos a escala de proceso. Un intercambiador de calor es una alternativa técnicamente bien definido para calentar calderas de agitación, pero requiere un suministro abundante de calefacción y medios de refrigeración, por ejemplo, vapor y agua fría, así como una tasa de flujo volumétrico estrechamente controlado que se adapta a la geometría del intercambiador de calor y propiedades de medios, por ejemplo., la capacidad calorífica específica. Este artículo muestra cómo los tres métodos se pueden utilizar para la precipitación inducida por calor de HCP de tabaco, y HCP vegetales en general. El establecimiento y funcionamiento de EACmétodo h en un laboratorio puede utilizarse para evaluar su idoneidad para los procesos a mayor escala. El principal desafío es identificar modelos a escala reducida y adecuadas condiciones de funcionamiento para cada operación que se asemejan a las condiciones y dispositivos utilizados durante el proceso de fabricación a gran escala. Los datos presentados aquí se refieren a experimentos realizados con plantas de tabaco transgénicas que expresan la vacuna candidata malaria Vax8 y proteína fluorescente DsRed 16, pero el método también se ha aplicado con éxito a N. benthamiana plantas que expresaban transitoriamente otras proteínas biofarmacéuticas 21.
Un diseño-de-experimentos (DOE) se aproximan a 22 puede facilitar el desarrollo de procesos, y floculantes 23 también puede ser beneficioso en este contexto como se ha descrito previamente 8. La principal diferencia entre el escaldado, depósitos con calefacción y los intercambiadores de calor es que el escaldado se aplica a las hojas intactas al principio del proceso, mientras que el otella se aplican a extractos de plantas (Figura 1).
Figura 1:. Esquema del flujo de procesos que ilustra la implementación de tres diferentes métodos para Tabaco HCP precipitación térmica El material vegetal se lava y se homogeneiza antes de clarificación y purificación. El equipo para la etapa de blanqueo (rojo) se pueden añadir fácilmente a la maquinaria existente. Por el contrario, el uso de un recipiente agitado (naranja) y, especialmente, un intercambiador de calor (azul) requiere uno o varios dispositivos y tubos adicionales. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
1. Cultivar las plantas de tabaco
- Enjuague cada bloque de lana mineral con 1 a 2 L de agua desionizada y, posteriormente, con 1 L de 0,1% [w / v] solución de fertilizante. Coloque una semilla de tabaco en cada bloque de lana mineral y suavemente a ras de 0,25 l de solución de fertilizante sin lavarse la descendencia 16.
- Cultivar las plantas de tabaco durante 7 semanas en un invernadero con un 70% de humedad relativa, un fotoperíodo de 16 h (180 mmol seg - 1 m - 2; λ = 400 - 700 nm) y un régimen de temperatura 25/22 ° C luz / oscuridad.
- Cosechar todas las hojas excepto las cuatro hojas de cotiledones, que están situados en la base del tallo de la planta.
2. Opcional: Precipitación de calor por Escaldado
NOTA: Llevar a cabo los pasos descritos en los pasos 2.1 a 2.12 con el fin de precipitar los profesionales sanitarios de tabaco por escaldado. Saltar toda la sección 2, si se precipitan los profesionales de la Saluden un recipiente calentado (sección 4) o el uso de un intercambiador de calor (sección 5).
- Ponga a un lado 50 g de material vegetal y llevar a cabo la extracción sin escaldado (sección 3). Tomar una muestra de este extracto como un control interno durante el análisis posterior (sección 7).
- Establecer un baño de 8-l de volumen de trabajo del agua, por ejemplo, 50 x 40 x 40 cm, en un cubo de espuma de poliestireno aislado térmicamente o similar. Montar el termostato ajustable en el baño de agua para controlar la temperatura posterior (paso 2.7).
- Transferir todo el conjunto sobre una placa de agitación magnética y colocar una barra de agitación magnética en el baño de agua. Asegúrese de que el campo magnético es lo suficientemente fuerte para hacer girar la barra de agitación.
- Rodear la barra de agitación con al menos cuatro baldosas de soporte sobre el que se coloca una cesta de polipropileno (paso 2.6) más tarde durante el procedimiento de blanqueo. Asegúrese de que las baldosas de apoyo están hechos de un material no magnético (por ejemplo, aleación de acero inoxidable que contiene níquel) y que seson más altos que la barra de agitación (Figura 2).
- Añadir 8 l de agua desionizada al baño de agua.
NOTA:. El uso de un tampón, por ejemplo, fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5), puede mejorar el rendimiento de proteína diana si la precipitación a pH bajo es un problema. - Coloque una canasta de polipropileno cm 23 x 23 x 23 en las baldosas de apoyo y asegúrese de que la cesta no interfiere con la rotación barra de agitación y de que está completamente sumergido en el líquido. Si es necesario, añadir agua adicional / tampón hasta que la cesta está totalmente sumergido, a continuación, recoger la cesta de nuevo.
PRECAUCIÓN: Todas las etapas posteriores de hasta 2,12 implican el manejo de líquido caliente. Use equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes con aislamiento térmico. - Utilice el termostato ajustable para llevar el baño de agua a 70 ° C (o la temperatura requerida para los experimentos). Espere al menos 15 minutos después de que se alcance la temperatura deseada para asegurar todo el conjunto ha alcanzado un Thermal equilibrio.
- Preparar 150 g alícuotas de las hojas de tabaco cosechadas. Colocar una alícuota en la cesta evitando al mismo tiempo la compresión irreversible y el daño a las hojas, por ejemplo, por desgarro. Evitar el llenado excesivo de la canasta con material vegetal o un empaquetamiento denso de este último.
- Con cuidado, pero rápidamente sumergir la cesta en el líquido caliente y colocarlo en las baldosas de apoyo. Coloque un bloque de acero inoxidable en la parte superior de la canasta para evitar la flotación.
- Se incuban las hojas durante 5 minutos en el líquido de escaldado, o seleccionar un tiempo satisfaciendo el diseño experimental. Monitorear la temperatura del líquido durante todo el período de incubación.
- Retire cuidadosamente la cesta del fluido de escaldado y dejar escurrir el líquido residual de las hojas durante 30 s. Luego tomar las hojas de plantas de la cesta, transferirlos a la licuadora y empezar de inmediato la extracción (sección 3).
NOTA: Las plantas se pueden mantener durante largos periodos de tiempo después del escaldado y antes del inicio de THextracción e, por ejemplo, más de 30 min en hielo o congelado a -20 ° C durante varias semanas ha sido probado con éxito. Sin embargo, la estabilidad del producto puede disminuir con el aumento de los tiempos de almacenamiento y por lo tanto se recomienda su procesamiento inmediato. - Repita los pasos 2.8 a 2.11 con el material de la hoja fresca hasta que se procesa toda la biomasa cosechada.
3. extracción de proteínas a partir de las hojas de tabaco
PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos implican una licuadora con cuchillas giratorias. No trabajar en el cubo mezclador mientras que se monta en el motor de la licuadora.
- Colocar 150 g (masa húmeda) de cosechado (paso 1.3) o blanqueado (paso 2,11) hojas en el mezclador y añadir 450 ml de tampón de extracción (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 500 mM, disulfito de sodio 10 mM, pH 8,0).
NOTA: La composición de tampón de extracción depende de la proteína que se extrae y por lo tanto puede requerir el ajuste de, por ejemplo, el uso de otro pH o tampón componente tal como Tres. - Homogeneizar las hojas durante 3 x 30 pulsos por segundo con un 30 seg intercalan pausas. Asegúrese de que las hojas son homogeneizados y no obstruyen el cubo de la licuadora. Parar el mezclador y levantar las hojas para evitar la obstrucción si es necesario, y luego continuar la homogeneización.
- Tomar una muestra de 1 ml de cada extracto que se produce para su posterior análisis (sección 7). Si se blanquea el material vegetal, vaya a la sección 6. De lo contrario continuar con la precipitación de calor en un recipiente (sección 4) o intercambiador de calor (sección 5), dependiendo del enfoque experimental seleccionado.
4. Opcional: Precipitación de calor en un recipiente agitado
NOTA: Llevar a cabo los pasos descritos en las secciones 4.2 a 4.11 con el fin de precipitar los profesionales sanitarios del tabaco en un recipiente agitado. Saltar toda la sección 4, si los profesionales sanitarios han sido precipitada por escaldado (sección 2) o se precipitó mediante un intercambiador de calor (sección 5).
- La creación de dos de 8 l de agua volumen de trabajocuartos de baño, por ejemplo, 50 x 40 x 40 cm, en la espuma de poliestireno con aislamiento térmico o similar. En el primer baño, montar el termostato ajustable para el control de temperatura posterior (paso 4.6). En el segundo, añadir 5 L de agua desionizada y 2 kg de hielo durante el enfriamiento subsiguiente (etapa 4.9).
- Transferir el primer baño de agua sobre una placa de agitación magnética, y colocar el recipiente de acero inoxidable de 2 L en el baño de agua de modo que el centro del recipiente se alinea con el centro de la placa de agitación.
- Colocar una barra de agitación magnética en el recipiente de acero inoxidable. Asegúrese de que el campo magnético es lo suficientemente fuerte para hacer girar la barra de agitación.
- Llenar el baño de agua con agua desionizada a 5 cm por debajo del borde superior del recipiente de acero inoxidable. A continuación, llenar el recipiente con el tampón de extracción. Colocar una tapa de espuma de poliestireno en el buque.
PRECAUCIÓN: Todas las etapas posteriores de hasta 4,9 implican el manejo de líquido caliente. Use equipo de protección personal adecuado incluyendo ins térmicamenteulated guantes. - Insertar un termómetro en el recipiente de acero inoxidable a través de un agujero satisfaciendo en la tapa de espuma de poliestireno. Ajuste la temperatura del baño de agua a 78 ° C y se incuba todo el conjunto durante 15 minutos para alcanzar el equilibrio térmico. Asegúrese de que la temperatura en el recipiente es de 70 ° C, aproximadamente a 8 ° C por debajo del punto del baño de agua.
- Si la temperatura en el recipiente de acero inoxidable se diferencia de 70 ° C, ajustar la temperatura del baño de agua y en consecuencia dejar que el sistema se equilibre durante otros 15 min. Repita este paso hasta que la temperatura en el recipiente es de 70 ° C o como se requiere para el experimento, y vaciar el recipiente de acero inoxidable.
- Verter 300 ml de extracto (etapa 3.2) en el recipiente de acero inoxidable mientras que todavía está en el baño de agua y comenzar un temporizador. Se agita el extracto a 150 rpm y se incuba durante 5 min. Asegúrese de que el extracto alcanza una temperatura de 70 ° C durante al menos 2 min durante este período de incubación.
- Retirar el baño de agua caliente del agitador magnético, sacar el recipiente de acero inoxidable y colocarlo en la cubeta enfriada con hielo. Colocar este último en el agitador magnético y retire la tapa de espuma de poliestireno.
- Asegúrese de que el homogenado de plantas es bien agitada a 150 rpm, colocar el termómetro en el extracto y se incuba hasta que se alcanza una temperatura de 20 ° C o la temperatura especificada por el diseño experimental.
- Repita los pasos 4.7 a 4.9 para todas las alícuotas. Tomar una muestra de 1 ml de cada extracto de calor precipitó una vez que se ha alcanzado la temperatura final, a continuación, proceder con la sección 6.
5. Opcional: Precipitación de calor en un intercambiador de calor
NOTA: Llevar a cabo los pasos descritos en las secciones 5.2 a 5.12 con el fin de precipitar los PCH tabaco utilizando un intercambiador de calor. Saltar toda la sección 5, si los profesionales sanitarios han sido precipitada por escaldado (sección 2) o en un recipiente calentado (sección 4).
- Configurar dos volúmenes de trabajo 8-Lbaños de agua, por ejemplo, 50 x 40 x 40 cm, en cubos de espuma de poliestireno con aislamiento térmico o similar. En el primer baño, montar el termostato ajustable para el control de temperatura posterior (paso 5.3). En el segundo, añadir 5 L de agua desionizada y 2 kg de hielo durante el enfriamiento subsiguiente (etapa 5.10).
PRECAUCIÓN: Todas las etapas posteriores de hasta 5,9 implican el manejo de líquido caliente. Use equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes con aislamiento térmico. - Llene el primer baño de agua con 8 l de agua desionizada. Ajuste la temperatura de 74,5 ° C, utilizando el termostato. Se incuba el conjunto durante 15 minutos para alcanzar el equilibrio térmico.
- Preparar un recipiente de almacenamiento con aislamiento mediante la colocación de un vaso de precipitados de plástico de 0,5 L en un vaso de plástico de 1 litro y rellenar los huecos con un algodón. Como alternativa, utilizar un recipiente aislado térmicamente dedicado con un volumen de trabajo de 0,5 l.
- Conectar el intercambiador de calor a la bomba peristáltica en un extremo y a una manguera de salida en el other terminar usando L / S 24 tubos. Colocar las dos tubos termina junto con un termómetro en el recipiente de almacenamiento aislado y llenarlo con 300 ml de tampón de extracción (Figura 2).
- Coloque el intercambiador de calor en el baño de agua caliente y en marcha la bomba peristáltica a una velocidad de 300 ml min -1. Asegúrese de que la temperatura resultante en el recipiente es de 70 ° C, aproximadamente 4,5 ° C por debajo del punto del baño de agua, después de 3 min.
- Si la temperatura en el recipiente aislado difiere de 70 ° C, ajustar la temperatura del baño de agua y en consecuencia dejar que el sistema se equilibre durante otros 15 min. Repita este paso hasta que la temperatura del tampón de extracción aumenta desde la temperatura ambiente hasta 70 ° C en menos de 3 min, o es igual a la requerida para el experimento, y vaciar el recipiente de acero inoxidable.
- Desechar el tampón de extracción desde el recipiente aislado y preparar alícuotas de 300 ml de extracto de la planta. Llenar el recipiente aislado con una alícuota.
- Bombear el extracto de la planta (sección 3.3) a través del intercambiador de calor a 300 ml min-1 durante 5 min. Asegúrese de que la temperatura de extracto es de 70 ° C después de 3 min, o es igual a la temperatura definida en el diseño experimental.
- Después de 5 min, colocar el intercambiador de calor en el baño de agua enfriada con hielo, mientras que el extracto todavía está siendo bombeada. Incubar en esta configuración hasta que la temperatura alcanza exactamente 20 ° C, o la temperatura definida en el diseño experimental.
- Quitar el tubo de entrada conectado a la bomba peristáltica desde el recipiente de aislamiento y continuar el bombeo para recoger el extracto de planta residual precipitado con calor desde el interior del intercambiador de calor. Luego se detiene la bomba.
- Repita los pasos 5.7 a 5.10 para todas las alícuotas. Tomar una muestra de 1 ml de cada extracto se precipitó por el calor una vez que se ha alcanzado la temperatura final, a continuación, pasar los extractos a bolsa de filtración (sección 6).
NOTA: Después de un primer ciclo de los pasos a través de 05/07 a 05/10 no habrá tampón de extracción adeseche en el paso 5.7.
6. La bolsa de filtración del extracto de la planta
- Montar un filtro de bolsa en el cesto de apoyo correspondiente, que está montado en la carcasa del filtro y proporciona soporte mecánico para el material de filtro flexible. Colocar un recipiente de 1 litro por debajo de la canasta y se aplican las alícuotas de extracto (sección 3.3, 4.10 o 5.11 dependiendo del tratamiento térmico seleccionado) a la bolsa a una velocidad de 150 ml min -1.
- Después de la filtración, se mide la turbidez de una dilución 1:10 de filtrado en tampón de extracción mediante el turbidímetro.
- Tomar una muestra de 1 ml y procesar el filtrado bolsa tal como se define en el diseño experimental, por ejemplo, filtración en profundidad y 7,10 cromatografía.
Análisis 7. Muestra
- Medir la cantidad de proteína soluble total (TSP) utilizando el método de Bradford 24,25.
- Por triplicado, una pipeta de 2,5 l de cada muestra en los pocillos individuales de unaplaca de 96 pocillos. Incluyen ocho patrones de albúmina de suero bovino (BSA), por triplicado, que cubren el rango de 0 - 2000 mg ml -1.
- Añadir 200 l de reactivo de Bradford a cada pocillo y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo, pero con cuidado suficiente para evitar la formación de burbujas.
- Incubar durante 10 min a 22 ° C y medir la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro. Calcular la concentración de TSP en las muestras en base a una curva estándar a través de los puntos de referencia de BSA.
- Cuantificar Vax8 por espectroscopia de resonancia de plasmones superficiales 26.
- Configuración de la superficie del instrumento de resonancia de plasmón con 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) que se ejecuta tampón (HEPES 10 mM, 3 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), cloruro de sodio 1,500 mM, 0,05% v / v de polisorbato 20, pH 7,4) y un soporte de chip de la superficie de dextrano carboximetilado en el dispositivo. Utilice la función primordial para limpiar el sistema y comenzar una carrera manual con un caudal de 30min l -1 sobre celdas de flujo 1 y 2. Inyectar 30 mM de cloruro de hidrógeno dos veces durante 60 segundos con una inyección de 60 seg intercaladas de hidróxido de sodio 25 mM.
- Preparar 200 l de una 500 mg ml -1 mAb 5.2 de solución en acetato de sodio 10 mM (pH 4,0). Descongelar 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y viales N hidroxisuccinimida (NHS) y centrifúguelas a 16.000 xg durante 1 min. Mezclar 70 l de EDC con 70 l de NHS y transferir a un vial de plástico de 7 mm.
- Activar la superficie del chip superficie de dextrano carboximetilado mediante la inyección de la mezcla de EDC / NHS sobre celdas de flujo 1 y 2 durante 10 minutos con un caudal de 10 l min -1.
- Establecer la ruta de flujo de la celda de flujo 2 solamente. Pareja mAb 5.2 mediante la inyección de 15 min a una velocidad de 10 l min -1.
- Cambie la trayectoria de flujo a fluir las células 1 y 2 y se inyecta etanolamina durante 7 min a una velocidad de 5 l min -1 para desactivar la superficie. Tgallina inyectan cloruro de hidrógeno 30 mM dos veces durante 60 segundos con una inyección de 60 seg intercaladas de hidróxido de sodio 25 mM.
- Inyectar las muestras y MSP1 - 19 estándares a una velocidad de 30 min l -1 para 180 seg. Asegúrese de que la concentración Vax8 es de 50 - 1.000 ng ml-1. Preparar pre-diluciones en solución salina tamponada HEPES que contiene EDTA y polisorbato 20 (HBSEP) si es necesario.
- Restar la señal de pico de la celda de flujo 1 de la de la celda de flujo 2 y el uso de la diferencia para calcular la concentración Vax8 en las muestras basándose en la señal de la MSP 1 - inyección 19 con una concentración de proteína conocido de 500 ng ml -1.
- Regenerar la superficie del chip después de cada muestra o MSP 1-19 inyección por la exposición a 30 mM de cloruro de hidrógeno durante 60 segundos a una velocidad de flujo de 30 min l -1.
- Cuantificar DsRed por espectrometría de fluorescencia
- Por triplicado, de pipeta 50 l de cada muestra en los pocillos individuales de un negro medio-area placa de 96 pocillos. Incluirá seis estándares DsRed que cubren el rango de 0 - 225 mg ml-1.
- Medir la fluorescencia por duplicado utilizando un filtro de excitación 530 nm ± 30 y un filtro de emisión de 590 nm ± 35 en un espectrofotómetro. Calcular la concentración de DsRed en las muestras en base a una curva estándar a través de los puntos de referencia DsRed.
- La determinación de las distribuciones de tamaño de partícula
- Lavar una cubeta con 1 ml de isopropanol y luego con 2 ml de agua desionizada para eliminar las partículas de polvo. Pipetear 850 l de la muestra en la cubeta.
- Colocar la cubeta en el analizador de tamaño de partícula y potencial zeta. Abra el "software" e iniciar una medición manual con "proteína", como el material y "PBS" como dispersante. Seleccionar una temperatura de 25 ° C y un tiempo de equilibrio de 180 seg.
- Elige la célula "DTS0012" y medir en 173 ° de retrodispersión. Compruebe la func "auto"ión para la duración de la medición y seleccionar tres mediciones sin retardo intercalado.
- Investigar el perfil pico de la distribución del tamaño de partícula, una vez finalizada la medición mediante la selección de las tres mediciones de la muestra en la vista experimento. Seleccione la pestaña "PSD volumen".
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Representative Results
Precipitación de calor de las proteínas de la célula huésped de tabaco por escaldado
El procedimiento de blanqueo se describe en la sección 2. Se ha usado con éxito para precipitar los profesionales sanitarios de hojas de tabaco con 70 ° C, lo que reduce el TSP en un 96 ± 1% (n = 3), mientras se recupera hasta el 51% de la proteína diana Vax8, aumentando así su pureza a partir de 0,1% a 1,2% antes de la separación cromatográfica 16. También fue posible recuperar 83 ± 1% (n = 3) de la proteína fluorescente DsRed, aumentando su pureza a partir de 3,3% a 64,1%. El procedimiento de blanqueo se integra fácilmente en un sistema de extracción y clarificación estándar que consiste en el lavado de la biomasa, la homogeneización, la filtración y la bolsa de filtración en profundidad (Figura 1) 7. Preparación del equipo de escaldado (Figura 2) que se añade a unos 5 minutos al tiempo de preparación para los dispositivos de clarificación, que habitualmente tarda 20 min. Otro 7 min se requiere para llevar a caboel escaldado de hojas intactas además del típico tiempo de extracción y clarificación de 45 min. Sin embargo, sólo 2 min del 7 minutos adicionales fue "práctico" tiempo real. Además, son posibles tiempos de incubación cortos de menos de 1 min, reduciendo el tiempo de escaldado de 7 min a aproximadamente 3 min. Por lo tanto, escaldar no sólo aumenta la pureza inicial de un producto en extractos de plantas crudos, pero también se completa rápidamente sin equipo de proceso adicional, lo que ofrece el potencial para reemplazar al menos un primer paso de cromatografía. La temperatura del baño de blanqueo se mantuvo constante, es decir, <0,2 ° C fluctuación, durante todos los experimentos incluso inmediatamente después de la adición de hojas cosechadas, que eran a temperatura ambiente. Esto aseguró el proceso era repetible, es decir, un coeficiente medio de variación del 17% (n = 24), en términos de reducción de TSP, los rendimientos del producto y la capacidad de filtro en las etapas posteriores de clarificación (Figura 3 8 y filtros de SIDA tras bolsa de filtración 9, que puede restaurar o incluso aumentar las capacidades de filtro. Una temperatura de 60 ° C fue suficiente para eliminar 80 ± 3% (n = 3) de los profesionales sanitarios y aumentar la pureza Vax8 2,6 ± 0,1 veces (n = 3) sin afectar a la capacidad del filtro. Por lo tanto, HCP eliminación por escaldado es compatible con las proteínas diana que tienen estabilidad al calor moderado, es decir, una temperatura de fusión inferior a 70 ° C 27,28. Sin embargo, el aumento de la temperatura a 70 ° C o más puede resultar en una eliminación HCP de más de 95% (Figura 3). Fue útil para llevar a cabo el correspondiente conjunto de experimentos de una manera bien diseñado usando un enfoque estadístico 22 porque esto permitió la rápida identificación de las más rElevant parámetros del proceso, es decir, el tiempo de calentamiento y la temperatura. Al mismo tiempo, el método DoE genera un modelo predictivo para facilitar la optimización de procesos 16.
Figura 2: Configuración esquemática de tres métodos para precipitar los PCH Tabaco en hojas intactas o extractos de A. El blanqueo se llevó a cabo en un baño de agua calentada con un termostato (T) en el que se sumerge una cesta que contiene las hojas intactas.. El baño de agua se agita para asegurar una temperatura homogénea y constante. B. Un recipiente que contiene un extracto de una barra de agitación magnética y de la hoja se sumergió en un baño de agua. La temperatura en el extracto se controla para asegurar que se alcance la temperatura requerida. C. Un intercambiador de calor (H) se conecta a una bomba (P) y un storag aislado térmicamentebuque correo que contiene el extracto de la planta. El intercambiador de calor se sumergió en un baño de agua y la temperatura del extracto calentado se controló. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de Tres Métodos de precipitación de calor que muestran su efecto en el rendimiento del proceso y la Purificación de dos proteínas objetivo a una.. Se identificaron las condiciones que apoyan la eliminación de más de 90% de los profesionales sanitarios para escaldar, un recipiente de agitación y una configuración de intercambiador de calor, todos los cuales se incrementó la pureza de las proteínas diana Vax8 y DsRed por un mínimo de 2,5 veces y un máximo de 19 -fold, con el escaldado mejor rendimiento. En contraste, sólo la configuración de recipiente de agitación se incrementó la capacidad de la subseqetapa de filtración en profundidad uente utilizado para la clarificación de las plantas tratadas con calor o extractos. Las barras de error indican la desviación estándar (n = 3). B. El contenido de HCP de las muestras después de diferentes condiciones de tratamiento térmico puede ser analizado y comparado el uso de geles de poliacrilamida teñidos con Coomassie. RuBisCO (flechas verdes) se retira junto con otros profesionales de la Salud como la temperatura durante los aumentos de tratamiento térmico, mientras que DsRed (flecha roja) permanece en solución. * Indica una muestra que fue expuesto al calor durante 0,5 minutos, todas las otras muestras fueron tratados durante 3,0 min o más. Vuelva a imprimir con permiso de 16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Precipitación térmica de los profesionales sanitarios en un recipiente agitado
Un recipiente de agitación para la precipitación de calor eliminado un máximo de 84 ± 1% (n = 3) PCH, logrando una pureza of 0,33 ± 0,02% (n = 3) para Vax8 y 20,2 ± 1,4% (n = 3) para DsRed (Figura 3). El tratamiento térmico se llevó a cabo en un recipiente separado del homogeneizador para evitar retrasos que reflejan ocupación dispositivo al procesar múltiples muestras en serie. El esfuerzo de manejo requerido para el proceso a escala de laboratorio fue similar a la de escaldado, pero se requiere un recipiente de acero inoxidable adicional y una etapa de enfriamiento dedicada. Además, la transferencia de calor al extracto fue más lento que durante el blanqueo, con tiempos de incubación de al menos 5 min, es decir, 10 veces más que para escaldar. El calentamiento retardado fue causado por el buque, lo que suponía una barrera adicional a la transferencia de calor y el ~ 300% mayor masa que se calentó en el recipiente debido a la presencia de tampón de extracción además de la biomasa de las plantas. La precipitación de las proteínas también se adhirieron a las paredes del recipiente, la progresiva consolidación de una barrera de transferencia de calor adicional y aumentar el esfuerzorequerido para la limpieza posterior. Ajuste de la temperatura del baño de agua 8 ° C por encima de la temperatura utilizada para la precipitación de calor compensado las pérdidas de energía en el sistema parcialmente abierto y alcanzado la temperatura deseada extracto. En contraste con el escaldado (sección 2) y la configuración del intercambiador de calor (sección 5), la precipitación HCP en un recipiente aumento de la capacidad de filtración en profundidad aguas abajo en 2,5 veces, lo que refleja las fuerzas de cizallamiento bajas en el recipiente en comparación con el bombeo de extracto a través del calor intercambiador u homogenización después del escaldado, probablemente como resultado de los agregados más grandes que eran más fáciles de eliminar en el paso bolsa de filtración.
Precipitación de calor de los profesionales sanitarios en un intercambiador de calor
Aproximadamente el 88,3 ± 0,7% (n = 12) del contenido de HCP se eliminó sistemáticamente a partir del extracto utilizando un intercambiador de calor dentro del rango de temperatura de 60-70 ° C, logrando una pureza de 0,31 ± 0,01% (n = 12) para Vax8 y 27.6 ± 2,0% (n = 12) para DsRed (Figura 3). El coeficiente de variación promedio fue del 13% (n = 24) que indica que la capacidad de repetición de este procedimiento fue incluso mejor que el escaldado. se alcanzó la temperatura deseada después de extracto de ~ 3 min si se fijó la temperatura del baño de agua 4,5 ° C más alta. En cuanto a la recipiente calentado, se requería una etapa de enfriamiento dedicada después del tratamiento térmico. El intercambiador de calor implicado más de esfuerzo de manipulación que los otros métodos debido a que el intercambiador aparato de bombeo y el calor requerido limpieza intensiva debido a el precipitado se adhiere a las paredes de la tubería de acero inoxidable de diámetro interior estrecho. El intercambiador de calor también logra la capacidad de filtro de profundidad de aguas abajo más bajo, aclarando solamente 13,5 ± 6,0 (n = 3) L m -2 antes de la obstrucción.
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Discussion
Los tres métodos de precipitación de calor descritas anteriormente pueden eliminar eficazmente los PCH de tabaco antes de cualquier etapa de purificación cromatográfica 16,17. Se complementan otras estrategias que tienen por objeto aumentar la pureza inicial del producto, por ejemplo, gutación 29, 30 o rhizosecretion centrífuga extracción de 31,32, todas las cuales se limita a las proteínas secretadas. Sin embargo, los métodos basados en el calor sólo se pueden utilizar de una manera significativa si la proteína diana que va a purificarse puede soportar la temperatura mínima precipitación de ~ 60 ° C durante más de 1 min. Por lo tanto, el primer paso en cualquiera de los tres métodos es el diseño de una molécula diana con una temperatura suficientemente alta de fusión, que ha sido descrito por varios proteínas candidatas vacuna contra la malaria que consisten en diferentes dominios de varios Plasmodium falciparum antígenos 16.18.21. Una vez que la estabilidad térmica de la proteína diana se ha demostrado, unade los tres métodos pueden ser seleccionados en base a la disponibilidad del equipo y los medios de comunicación, la escala proceso final anticipado y las operaciones posteriores DSP 16.
El blanqueo fue el más rápido de los métodos y las necesidades de equipo adicionales fueron mínimas, por lo que se puede implementar fácilmente en los protocolos de purificación a escala de laboratorio existentes para las proteínas recombinantes derivados de las plantas. Agitación vigorosa del líquido de escaldado es un parámetro de proceso importante que afecta a la eficacia de precipitación HCP basado en datos empíricos y cálculos teóricos 21,33. El no poder lograr un buen mezclado puede perjudicar la transferencia de calor y el resultado sólo en la eliminación HCP parcial, que a su vez puede ser perjudicial para el producto si proteasas del huésped permanecen activas 21,34. Varios otros parámetros también pueden afectar a la precipitación HCP, por ejemplo, el tiempo de incubación y temperatura de calentamiento, y por lo tanto un enfoque DoE pueden ser útiles para caracterizar la fa más relevantesctors y proporcionar modelos predictivos para cuantificar sus efectos sobre las respuestas tales como la pureza del producto, la recuperación y el rendimiento de la posterior DSP 22 pasos.
En la configuración del buque, se requieren tiempos de incubación más largos para lograr la precipitación completa HCP y esto puede aumentar la probabilidad de destino indeseable desnaturalización de las proteínas que refleja la exposición prolongada a altas temperaturas. Más mezcla a fondo en el recipiente podría mejorar la transferencia de calor y reducir la duración del calentamiento. La larga rampa de temperatura en esta configuración también puede ser difícil si las proteasas en el extracto 21,34 vuelven más activos antes de la inactivación final de calor, causando pérdidas de producto.
La capacidad de filtración en profundidad aumento observado para la configuración buque puede ayudar a reducir los costos de los consumibles, lo que permite un mayor número de muestras que se maneja en un proyecto con un presupuesto fijo o reducir las necesidades globales de financiación para un conjunto dado de experimentos. Sin embargo, este beneficio puede ser compensado por el coste del recipiente adicional, que es necesario, además de la homogeneizador para prevenir la introducción de medidas de retención proceso si se requieren varias operaciones de extracción en una serie de experimentos, por ejemplo, como parte de un DoE enfoque. El efecto positivo sobre la capacidad de filtro también puede disminuir si un régimen de mezcla más intensivo se utiliza para reducir los tiempos de calentamiento como se sugirió anteriormente.
Una etapa de enfriamiento dedicado es necesario que los dos métodos de precipitación de calor a base de extracto, lo que requiere no sólo los recursos adicionales, sino también a prolongar el tiempo de procesamiento global por muestra, que también puede entrar en conflicto con los procedimientos del Departamento de energía fluida o secuencias experimentales en general. La configuración de intercambiador de calor está bien caracterizada desde una perspectiva de ingeniería 35 y fácilmente puede ser diseñado y ampliarse las diferencias de temperatura específicos, a diferencia de la embarcación, cuya superficie-volumen durante cambios de relación de escala hacia arriba. Cómocada vez, una vez que se define el tamaño de intercambiador de calor, que puede ser difícil para adaptarse a las diferencias de temperatura alternativos debido a que su longitud y por lo tanto el área de transferencia de calor son fijos.
Cambio de otros parámetros, tales como el tiempo de residencia (o velocidad de flujo) y la temperatura del medio intercambiador de calor, se puede restaurar la flexibilidad en cierta medida, pero sólo en experimentos a pequeña escala debido a que estos factores son típicamente operados en ventanas estrechas en operaciones a escala de proceso debido a las restricciones impuestas por el equipamiento y los medios de comunicación. La demanda de una combinación de tiempos de incubación cortos de 3-5 min y una diferencia de temperatura de 40 - 60 ° C se vuelve cada vez más difícil de resolver en el nivel del dispositivo a medida que aumenta la escala proceso porque las dimensiones del intercambiador de calor se hacen más grandes. Esto es especialmente cierto para la etapa de enfriamiento debido a que la diferencia de temperatura entre el medio y la temperatura extracto deseado es a menudo más pequeñas (? T = 10-15 ° C)que la etapa de calentamiento (? T = 20 a 40 ° C) lo que resulta en grandes dimensiones del equipo o más veces de enfriamiento.
En el futuro, el protocolo se puede adaptar a las proteínas biofarmacéuticas distintos candidatos de vacunas que en este estudio fueron diseñados específicamente para la estabilidad térmica. Muchos anticuerpos pueden soportar temperaturas de> 70 ° C 36,37 que ya es compatible con el protocolo de tratamiento térmico actual. Esta estabilidad térmica natural puede aumentarse aún más mediante el diseño de los diferentes dominios de anticuerpo 38, aumentando así el número de proteínas que pueden ser sometidas al método (y sus variaciones) se presenta aquí. El método de blanqueo ya se ha aplicado a las plantas de tabaco transgénicas que expresan un anticuerpo monoclonal (2G12) 17 que no ha sido objeto de selección para la estabilidad térmica o la ingeniería de proteínas. tratamiento térmico a 65 ° C se incrementó la pureza del anticuerpo por un factor dedos antes de la purificación cromatográfica mientras que la recuperación fue similar a la observada sin escaldado.
Además, la caracterización de las temperaturas de fusión HCP individuales de un sistema de expresión podría facilitar la identificación de una temperatura con la que el proceso podría llevarse a cabo similar a la pasteurización de la leche: alta temperatura, tiempo corto 39. El tratamiento térmico (a excepción de escaldado) también puede ser aplicado a otros materiales de partida biológicos para eliminar los PCH si el producto puede soportar las temperaturas necesarias. Este último puede desviarse de los discutidos aquí si otras plataformas de expresión tales como sobrenadantes de cultivo de células de mamíferos se encuentran en trámite. En cualquier caso, el beneficio-relación coste se debe tener en cuenta, es decir, lo hace en beneficio de los niveles de HCP reducidos superar el costo de la implementación de una etapa de tratamiento térmico que provoca costes de inversión adicionales, aumenta el tiempo de proceso y puede reducir el Yie productoLD 16. Un parámetro crítico en este contexto es la actividad del producto. Si depende de la presencia de epítopos lineales como para algunas vacunas a base de proteínas, a continuación, tratamiento térmico es poco probable que tenga un efecto 40. Por el contrario, si la estructura de proteínas es importante, por ejemplo, para los epítopos conformacionales, la orientación precisa de las cadenas laterales de aminoácidos en el sitio activo de una enzima o el plegamiento correcto de la complementariedad de anticuerpos regiones determinantes de, un tratamiento térmico pueden interferir con la actividad de la proteína 41,42. Por lo tanto, los ensayos de análisis adecuadas deben ser establecidos para supervisar el rendimiento del producto antes y después del tratamiento térmico.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
| Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
| Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
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