Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Jämförelse av tobak värdcell Protein borttagning metoder genom Blanche Intakta växter eller genom värmebehandling av extrakt

Published: August 8, 2016 doi: 10.3791/54343
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

Abstract

Växter inte bara livsmedel, foder och råvaror för människor, men har också tagits fram som ett ekonomiskt produktionssystem för biofarmaceutiska proteiner, såsom antikroppar, vaccinkandidater och enzymer. Dessa måste renas från växtbiomassa men kromatografisteg hindras av höga koncentrationer av värdcellproteiner (HCP) i växtextrakt. Dock de flesta HCP irreversibelt aggregera vid temperaturer över 60 ° C som underlättar efterföljande rening av målproteinet. Här är tre metoder presenteras för att uppnå värme utfällning av tobaks HCP i antingen intakta blad eller extrakt. Blanche av intakta blad kan lätt integreras i befintliga processer, men kan ha en negativ inverkan på efterföljande filtreringssteg. Det motsatta gäller för värme utfällning av bladextrakt i ett omrört kärl, som kan förbättra prestanda för operationer nedströms om än med stora förändringar i processutrustning konstruktion, såsomhomogenisator geometri. Slutligen är en värmeväxlare inställning väl karaktäriserade i termer av värmeöverföringsförhållanden och lätt att skala, men rengöring kan vara svår och det kan finnas en negativ inverkan på filterkapacitet. kan användas konstruktionen-of-experiment metod för att identifiera de mest relevanta processparametrar som påverkar HCP borttagning och produktåtervinning. Detta underlättar tillämpningen av varje metod i andra uttrycks plattformar och identifiering av den lämpligaste metoden för en viss reningsstrategi.

Introduction

Moderna sjukvårdssystem alltmer beroende av biofarmaceutiska proteiner 1. Producera dessa proteiner i växter är fördelaktigt på grund av den låga patogen bördan och större skalbarhet i jämförelse med konventionella expressionssystem 2-4. Däremot kan nedströms (DSP) av vegetabiliska läkemedel vara utmanande eftersom störande extraktionsförfaranden resulterar i en börda hög partikel, med turbiditet överstigande 5000 nefelometrisk grumligheter (NTUs), och värdcellprotein (HCP) koncentrationer ofta överstiger 95 % [m / m] 5,6.

Arbetade klargörande förfaranden krävs för att avlägsna dispergerade partiklar 7-9, men kromatografi utrustning är billigare att driva i bind-och-elueras läge under den inledande produktåtervinning om det finns ett tidigare steg för effektivt avlägsnande av HCP 10,11. Detta kan uppnås antingen genom utfällning av mål-proteinet genom användning av flocculmyror 12 eller låg pH 13,14, samt genom att orsaka HCP att aggregera. Den selektiva aggregering av ribulos-1,5-bisfosfatkarboxylas / oxygenas (RUBISCO), den vanligast förekommande HCP i gröna växter såsom tobak (Nicotiana tabacum), kan främjas genom att tillsätta polyetylenglykol 15, men det är dyrt och oförenligt med stor -Scale tillverkning. Värmebehandling har visat att denaturera och fälla mer än 95% av tobaks HCP, medan proteinmalariavaccinkandidater som Vax8 förblir stabila i lösning 16-18.

Tre olika metoder användes för att uppnå den värmeinducerad utfällning av tobaks HCP: (i) blanchering, dvs., nedsänkning av intakta blad i het vätska, (ii) ett temperaturreglerat omrört kärl, och (iii) en värmeväxlare ( Figur 1) 16. För intakta blad, skållning uppnås en snabb och effektiv utfällning av sjukvårdspersonal och var också lättatt skala upp och kompatibel med befintliga storskaliga tillverkningsprocesser som inkluderar ett första steg för att tvätta växtbiomassa 19. I kontrast, temperaturreglerade fartyg finns redan tillgängliga i vissa processer och kan användas för den termiska behandlingen av växtextrakt 20, men deras skalbarhet och energiöverföringstakten är begränsade eftersom förhållandet yta-till-volym av tankarna minskar gradvis och blir olämpligt vid process skala. En värmeväxlare är en tekniskt väldefinierat alternativ till värms omrörda kärl men kräver ett rikligt utbud av värme och kyla media, till exempel, ånga och kallt vatten, samt en hårt kontrollerad volymflödeshastighet som är anpassad till värmeväxlaren geometri och medier egenskaper, t.ex.., den specifika värmekapaciteten. Denna artikel visar hur alla tre metoder kan användas för värmeinducerad utfällning av tobaks HCP, och växt HCP i allmänhet. Etablering och drift av EACh metod i laboratoriemiljö kan användas för att utvärdera deras lämplighet för storskaliga processer. Den stora utmaningen är att identifiera lämpliga skal down-modeller och driftsförhållanden för varje operation som liknar de anordningar och betingelser som används under processen skala tillverkning. De data som presenteras här avser experiment genomförda med transgena tobaksplantor som uttrycker malariavaccin kandidaten Vax8 och fluorescerande protein DsRed 16, men metoden har också framgångsrikt tillämpats på N. benthamiana växter övergående uttrycker andra biofarmaceutiska proteiner 21.

En konstruktion-of-experiment (DOE) närmar 22 kan underlätta processutveckling, och flockningsmedel 23 kan också vara till nytta i detta sammanhang som tidigare beskrivits 8. Den största skillnaden mellan blanche, uppvärmda fartyg och värmeväxlare är att blanche appliceras på intakta blad tidigt i processen, medan den othennes tillämpas på växtextrakt (Figur 1).

Figur 1
Figur 1:. Process flödesschema som visar realiseringen av tre olika metoder för tobaks HCP Heat Fällning växtmaterial tvättas och homogeniseras innan förtydligande och rening. Utrustning för blancheringssteget (röd) kan enkelt läggas till det existerande maskiner. Däremot använder ett omrört kärl (orange) och speciellt en värmeväxlare (blå) kräver en eller flera ytterligare enheter och slangar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100P Portable Turbidimeter Hach 4650000 Turbidimeter
Amine Coupling Kit GE Healthcare BR100050  SPR chip coupling kit
Autoclaving basket Nalgene 6917-0230 Basket for leaf blanching
Biacore T200 GE Healthcare 28-9750-01 SPR device
Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM Sequip n.a. Particle size analyzer
Blender Waring 800EG Blender
BP-410 Furh 2632410001 Bag filter
Centrifuge 5415D Eppendorf 5424 000.410 Centrifuge
Centrifuge tube 15 ml Labomedic 2017106 Reaction tube
Centrifuge tube 50 ml self-standing Labomedic 1110504 Reaction tube
CM5 chip GE Healthcare BR100012  Chip for SPR measurements
Cuvette 10 x 10 x 45 Sarsted 67.754 Cuvette for Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8 Stat-Ease, Inc. n.a. DoE software
Disodium phosphate Carl Roth GmbH  4984.3  Media component
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Forma -86C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm Grodan 102446 Rockwool block
Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) n.a. (custom design) n.a. Heat exchanger
HEPES Carl Roth GmbH 9105.3 Media component
K200P 60D Pall 5302303 Depth filter layer
KS50P 60D Pall B12486 Depth filter layer
Lauda E300 Lauda Dr Wobser GmbH Z90010 Water bath thermostat
L/S 24 Masterflex SN-06508-24 Tubing
mAb 5.2 American Type Culture Collection HB-9148 Vax8 specific antibody
Masterflex L/S Masterflex HV-77921-75 Peristaltic pump
Miracloth Labomedic 475855-1R Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS WTW WTW_2020 pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Phytotron Ilka Zell n.a. For plant cultivation
Sodium disulfite Carl Roth GmbH 8554.1 Media component
Sodium chloride Carl Roth GmbH P029.2 Media component
Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm n.a. (custom design) n.a. Container for heat precipitation
Synergy HT BioTek SIAFRT Fluorescence and spectrometric plate reader
VelaPad 60 Pall VP60G03KNH4 Filter housing
Zetasizer Nano ZS Malvern ZEN3600 DLS particle size distribution measurement
Zetasizer Software v7.11 Malvern n.a. Software to operate the Zetasizer Nano ZS device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
  2. Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  3. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
  4. Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  9. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  11. Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
  12. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  13. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  14. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  15. Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
  16. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  17. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  18. Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
  19. Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
  20. Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
  21. Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
  22. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
  23. Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940 (2016).
  24. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
  25. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  26. Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
  27. Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
  28. Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
  29. Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
  30. Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
  31. Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
  32. Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
  33. Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
  34. Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
  35. Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
  36. Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
  37. Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
  38. Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
  39. Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
  40. Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336 (2006).
  41. Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
  42. Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).
Jämförelse av tobak värdcell Protein borttagning metoder genom Blanche Intakta växter eller genom värmebehandling av extrakt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer,… More

Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer, R. Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts. J. Vis. Exp. (114), e54343, doi:10.3791/54343 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter