Summary
효과적으로 담배에서 숙주 세포 단백질 (HCP가)의 90 % 이상을 제거 침전 방법 나타난 세 개의 열은 다른 정제 단계 이전에 추출한다. 공장 HCP가이 비가 역적으로 60 ° C 이상의 온도에서 집계.
Abstract
식물은 인간 식품, 사료 원료를 제공 할뿐만 아니라, 항체, 백신 후보로서 바이오 효소 단백질에 대한 경제적 인 생산 시스템으로 개발되었다 아닙니다. 이들은 식물 바이오 매스로부터 정제해야하지만, 크로마토 그래피 단계는 식물 추출물의 숙주 세포 단백질 (HCP가)의 높은 농도에 의해 방해된다. 그러나, 대부분의 HCP가 비가 역적 목적 단백질의 정제를 용이 이후 60 ° C 이상의 온도에서 응집. 여기에, 세 가지 방법은 그대로 잎 또는 추출물 중 하나에서 담배 HCP가의 열 침전을 달성하기 위해 제공됩니다. 그대로 잎의 창백 쉽게 기존 프로세스에 통합 될 수 있지만, 이후 여과 단계에 부정적인 영향을 미칠 수있다. 반대의 경우와 같은 처리 장치의 설계에 큰 변화 불구 하류 작업의 성능을 향상시킬 수있는 교반 용기 잎 추출물의 열 침전 사실이다균질 형상. 마지막으로, 열교환 기 설치 잘 열전달 조건의 관점에서 특성화 스케일 쉽지만 세정 어려울 수 있고, 필터의 용량에 부정적인 영향이있을 수있다. 디자인 수준의 실험 방법을 HCP 제거 및 생성물 회수에 영향을 미치는 가장 중요한 공정 매개 변수를 식별하는데 사용될 수있다. 이것은 다른 식 플랫폼의 각 방법 및 주어진 정제 전략을위한 최적의 방법의 식별의 적용을 용이하게한다.
Introduction
현대 의료 시스템은 점점 바이오 단백질 (1)에 따라 달라집니다. 식물에서 이들 단백질을 생산하는 통상의 발현 시스템 2-4에 비해 낮기 때문에 병원체 부담 더 확장하는 것이 유리하다. 파괴적 추출 절차 탁도 5,000 혼탁 탁도 유닛 (NTUs)를 초과하고, 숙주 세포 단백질 (HCP)의 농도는 종종 95을 초과하는, 높은 입자 부담을 초래하기 때문에, 식물 유래 의약품의 하류 처리 (DSP)가 어려울 수 %의 [m / m] 5,6.
정교한 정화 절차 분산 입자 7-9를 제거하기 위해 필요하지만 크로마토 그래피 장비 HCP에 10,11의 효율적인 제거에 대한 이전 단계가있는 경우 초기 생성물 회수 중에 바인드 - 및 - 용출 모드로 동작하도록 저렴된다. 이것은 floccul를 이용하여 표적 단백질을 침전에 의해 하나를 달성 할 수있다개미 12 낮은 pH 13, 14,뿐만 아니라 HCP가 집계하도록하여. 불로 오스 -1,5- 비스 포스페이트 카르 복실 / 시게나 (RUBISCO), 담배 (된 담배)으로 녹색 식물에서 가장 풍부한 HCP의 선택적 응집은 폴리에틸렌 글리콜 (15)을 첨가하여 촉진하지만, 이것은 고가이고 대형과 양립 할 수있다 -scale 제조. 열처리는 예컨대 Vax8 같은 단백질 말라리아 백신 후보 솔루션 16-18에서 안정적으로 유지하면서, 변성 및 담배 HCP가 95 % 이상을 침전하는 것으로 나타났다.
온도 조절은 혈관을 교반 (II) (I) 희게, 즉 고온의 액체는 그대로 잎의 침지, 및 (iii) 열교환 기 (세 가지 접근법은 담배 HCP에의 열 유도 된 침전을 달성하기 위해 사용 된 그림 1) 16. 그대로 잎의 경우, HCP가의 신속하고 효율적인 침전을 달성하고도 쉬웠다 희게확장 및 식물 바이오 매스 (19)를 세척하는 초기 단계를 포함 기존의 대규모 제조 공정과 호환합니다. 대조적으로, 온도 조절 용기 이미 일부 공정에 사용할 수 있으며 탱크의 표면 대 부피 비율이 점차 감소되기 때문에 식물의 열처리 (20)를 추출하지만, 그 확장 성 및 에너지 전송 속도가 제한되어 사용될 수 있으며 프로세스 규모에 적합하게된다. 열교환 교반 용기를 가열 할 수있는 기술적으로 잘 정의 된 대안이지만 가열 및 냉각 매체, 예를 들면 증기와 냉수의 풍부한 공급뿐만 아니라, 열 교환기 형상에 적응되는 엄격하게 제어 체적 유량을 필요 매체 특성, 예를 들면., 비열. 이 문서는 세 가지 방법이 일반적으로 담배 HCP가, 식물 HCP가의 가열에 의한 침전에 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 설립 및 EAC의 동작실험실 환경에서 H 방식은 대규모 프로세스의 적합성을 평가하기 위해 사용될 수있다. 주요 과제는 공정 규모의 제조시 사용되는 장치 및 조건을 닮은 각 작업에 대한 적절한 스케일 다운 모델과 실행 조건을 확인하는 것입니다. 여기에 제시된 데이터는 DsRed 16 말라리아 백신 후보 Vax8 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 담배 식물 실시한 실험을 참조하지만,이 방법은 성공적 N.에 적용된 benthamiana 식물 일시적 다른 바이오 21 단백질 발현.
디자인의-실험 (DOE는) 공정 개발을 용이하게 할 수있다 (22)에 접근, 이전 8 설명한 바와 같이 (23)는이 상황에서 도움이 될 수 있습니다 응집제. 창백 가열 용기 및 열교환 기의 주요 차이점은 창백 구약 반면 프로세스 초기에 그대로 잎에 적용된다그녀는 식물 추출물 (그림 1)에 적용됩니다.
그림 1 :. 담배 HCP 열 강수량에 대한 세 가지 다른 방법의 구현을 설명 프로세스 흐름 방식은 식물 재료 세척 및 정화 및 정화 전에 균질화한다. 희게 단계 (적색) 용 장비를 쉽게 기존의 장치에 추가 될 수있다. 대조적으로, 교반 용기 (오렌지) 특히 열교환 기 (파란색)를 사용하여 하나 또는 여러 개의 추가 장치 및 배관을 필요로한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. 담배 식물 육성
- 0.1 % [w / V] 비료 용액을 1 L로 1 탈 이온수 2 L이어서 각 미네랄 울 블록 플러시. 하나 담배 각 미네랄 울 블록의 씨앗과 씨앗 (16)을 멀리 세척하지 않고 비료 용액 0.25 L와 부드럽게 높이를 놓습니다.
- 70 %의 상대 습도와 온실에서 16 시간의 광주 칠주에 대한 담배 식물 육성 (- 1m - 180 μmol 초 2, λ = 400-700 nm의)과 22분의 25 ℃로 빛 / 어둠 온도 정권.
- 식물 줄기의 기지에있는 네 개의 자엽 잎을 제외한 모든 잎을 수확.
2. 선택 사항 : 열 강수량 표백제로
참고 : 창백하여 담배 HCP가 석출하기 위해 2.12에 단계 2.1 설명 된 단계를 수행합니다. HCP가이 침전 될 경우, 전체 섹션이 건너 뛰기가열 된 용기 (4 절) 또는 열교환 기 (섹션 5)를 사용한다.
- 식물 재료의 옆 50g을 설정하고 (3 장)를 희게하지 않고 추출을 실시한다. 이후 분석 (7) 동안 내부 통제로이 추출물의 샘플을 가져 가라.
- 열 절연 발포 폴리스티렌 통 또는 이와 유사한의 8 L 작업 볼륨 수조, 예를 들면, 50 X 40 X 40cm를 설정합니다. 이후의 온도 제어 (단계 2.7)의 물을 욕조에 조정 가능한 온도 조절기를 탑재합니다.
- 자기 볶음 접시에 전체 어셈블리를 전송하고 수조에서 자기 교반 막대를 배치합니다. 자기장은 교반 막대를 회전하기에 충분히 강한 지 확인합니다.
- 폴리 프로필렌 바구니 (단계 2.6)이 창백 과정에서 나중에 배치 될 때 적어도 네 개의 지원 타일로 교반 막대를 둘러싸고 있습니다. 서포트 타일은 비자 성 재료 (예를 들어, 스테인리스 스틸 합금, 니켈 함유)로 제조되어 있는지, 그들이스터 바 (그림 2)보다 높다.
- 수조에 탈 이온수 8 L을 추가합니다.
주 :. 낮은 pH 석출이 문제가되는 경우, 버퍼를 사용하여 예를 들어, 50 mM 인산 나트륨 (PH 7.5), 표적 단백질의 수율을 향상시킬 수있다. - 지원 타일에 23 X 23 X 23cm 폴리 프로필렌 바구니를 놓고 바구니가 교반 막대 회전을 방해하지 않도록하고 완전히 액체에 잠긴된다. 필요한 경우, 상기 바스켓이 완전히 잠길 때까지, 다시 바스켓을 제거 부가 물 / 버퍼를 추가한다.
주의 : 2.12까지 이후의 모든 단계는 뜨거운 액체의 처리를 포함한다. 열 절연 장갑을 포함하여 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. - 70 ° C (또는 실험에 필요한 온도)에 수조를 가지고 조정 가능한 온도 조절기를 사용합니다. 원하는 온도가 화력에 도달 전체 조립을 보장하기 위해 도달 한 후 적어도 15 분을 기다립니다리터 평형.
- 수확 된 담배 잎에서 150g 씩 준비. 찢어에 의해, 예를 들면 돌이킬 수없는 압축 및 잎의 손상을 피하면서 바구니에 하나 나누어 놓습니다. 식물 재료 또는 후자의 조밀 한 포장 바구니를 과도하게 채워지지 않도록합니다.
- 조심스럽게하지만 빠르게 뜨거운 액체에 바구니 잠수함과 지원 타일에 놓습니다. 부상을 방지하기 위해 바스켓의 상부에 스테인레스 스틸 블록을 놓는다.
- 창백 유체의 5 분의 잎을 품어, 또는 시간 실험 설계를 양복지를 선택합니다. 전 배양 기간 동안 상기 액체의 온도를 모니터한다.
- 조심스럽게 창백 유체에서 바구니를 제거하고 30 초 동안 잎에서 잔류 액의 배출을 할 수 있습니다. 그런 식물이 바구니의 잎 걸릴 블렌더로 전송하고 즉시 추출 (3 절)를 시작합니다.
주 : 식물 희게 후 번째의 개시 전에 장시간 동안 유지 될 수있다전자 추출, 예를 들어, 30 개 이상의 얼음에 분 또는 몇 주 동안 -20 ℃에서 냉동이 성공적으로 테스트되었습니다. 그러나, 제품의 안정성은 저장 시간을 증가시키고, 따라서 즉시 처리가 권장으로 거부 할 수 있습니다. - 전체 수확 바이오 매스가 처리 될 때까지 반복 신선한 잎 재료로 2.11-2.8 단계를 반복합니다.
담배 잎 3. 단백질 추출
주의 : 다음 단계는 블레이드를 회전 믹서를 포함한다. 이 믹서 모터에 장착되는 동안 믹서 통에 작동하지 않습니다.
- 수확 (단계 1.3) 또는 연한 (단계 2.11)의 150g (젖은 질량)을 배치 믹서 잎 추출 완충액 (50 mM의 인산 나트륨, 500 mM 염화나트륨, 10 mM의 나트륨 디술, 산도 8.0) 450 ml에 추가 할 수 있습니다.
참고 : 추출 버퍼 조성물을 추출 할 수있는 단백질에 의존하여 다른 pH를 예를 들어, 조정, 사용을 필요로하거나 TR로 구성 요소를 버퍼링 할 수 있습니다이다. - 30 초는 휴식을 산재로 3 × 30 초 펄스의 잎을 균질화. 잎이 균질화하고 블렌더 버킷을 방해하지 않도록해야합니다. 믹서기를 중지하고 필요한 경우 막힘을 방지하기 위해 잎을 들어 올린 다음 균질화를 계속합니다.
- 이후 분석 (7) 용으로 제작 된 각 추출물의 1 ml의 샘플을 가져 가라. 식물 재료를 희게하는 경우, 그렇지 않으면 선택한 실험 방법에 따라 용기에 열 강수량 (4 장) 또는 열교환 기 (섹션 5) 계속 부 (6)를 계속합니다.
4. 선택 사항 : 열 강수량 교반 용기에
주 : 교반 용기에 담배 HCP가 석출하기 위해 4.11에 섹션 4.2에 설명 된 단계를 실시한다. HCP가가 (2 절)를 희게하여 침전 된 또는 열교환 기 (섹션 5)을 사용하여 침전 될 경우, 전체 부 (4)를 건너 뜁니다.
- 2 개의 8-L 작업 다량의 물을 설정화장실, 예를 들어, 단열 스티로폼 또는 유사한 50 X 40 X 40cm. 첫 번째 목욕, 이후의 온도 제어 (단계 4.6)에 대한 조정 가능한 온도 조절기를 탑재합니다. 두 번째에서, 탈 이온수 5 L 이후 냉각 (단계 4.9) 얼음의 2kg을 추가합니다.
- 자기 교반 플레이트 위에 제 수조로 이동하고, 용기의 중심이 교반 판의 중앙에 정렬되도록 수조에 2 L 스테인레스 스틸 용기를 배치했다.
- 스테인레스 스틸 용기에 자기 교반 막대를 놓습니다. 자기장은 교반 막대를 회전하기에 충분히 강한 지 확인합니다.
- 스테인레스 강 용기의 상부 에지 아래 5cm 탈 이온수로 물 중탕을 채운다. 그런 다음 추출 버퍼 용기를 입력합니다. 용기에 스티로폼 뚜껑을 놓습니다.
주의 : 4.9까지 이후의 모든 단계는 뜨거운 액체의 처리를 포함한다. 열 기능을 포함하여 적절한 개인 보호 장비를 착용ulated 장갑. - 폴리스티렌 발포체 뚜껑의 구멍을 통해 양복지 스테인리스 용기 내로 체온계를 삽입한다. 78 ° C의 물 중탕 온도를 설정하고, 열 평형에 도달하기 위해 15 분 동안 전 배양 한 조립체. 용기의 온도가 70 ° C의 물을 욕조의 세트 포인트 아래 약 8 °의 C 있는지 확인하십시오.
- 스테인레스 강 용기의 온도가 70 ° C 다르면, 수조의 온도를 적절하게 조절하고 시스템이 또 다른 15 분 동안 평형을 보자. 용기의 온도가 70 ℃가 될 때까지 또는, 실험에 필요한이 단계를 반복하고, 스테인리스 용기를 비우고.
- 이 수조에있는 동안 스테인레스 스틸 용기로 추출한다 (단계 3.2) 300 ㎖에 붓고 타이머를 시작한다. 150 rpm에서 추출물을 약동하고 5 분 동안 품어. 추출물이 배양 기간 동안 적어도 2 분, 70 ° C의 온도에 도달 할 것을 보장한다.
- , 자석 교반기에서 온수 목욕을 제거 스테인레스 스틸 용기를 꺼내 얼음처럼 차가운 통에 넣습니다. 자석 교반기에 후자를 놓고 스티로폼 뚜껑을 제거합니다.
- 식물 파쇄 잘 150 rpm에서 교반되는 것을 확인 추출물에 온도계를 배치하고 20 ° C의 온도 또는 실험 디자인에 의해 특정 온도에 도달 할 때까지 배양한다.
- 반복 4.7 모든 분취 4.9 단계를. 각 열을 1 ml의 샘플을 취하면 다음 섹션 6을 진행, 최종 온도에 도달하면 추출 침전.
5. 선택 사항 : 열교환 기에서 열 강수량
주 : 열 교환기를 사용하여 담배 HCP가 석출하기 위해 5.2 5.12 절에 설명 된 단계를 실시한다. HCP가가 (2 절)를 희게하거나 가열 된 용기 (4 절)에 침전 된 경우, 전체 섹션 5를 건너 뜁니다.
- 2 개의 8-L 가공 볼륨을 설정합니다물 목욕, 예를 들어, 열 절연 발포 폴리스티렌 버킷 또는 유사한 50 X 40 X 40cm. 첫 번째 목욕, 이후의 온도 제어 (단계 5.3)에 대한 조정 가능한 온도 조절기를 탑재합니다. 두 번째에서, 탈 이온수 5 L 이후 냉각 (단계 5.10) 얼음의 2kg을 추가합니다.
주의 : 5.9까지 이후의 모든 단계는 뜨거운 액체의 처리를 포함한다. 열 절연 장갑을 포함하여 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. - 8 L 탈 이온수로 첫 번째 수조를 입력합니다. 온도 조절 장치를 사용하여 74.5 ° C로 온도를 설정합니다. 열 평형에 도달하는 15 분 동안 어셈블리를 품어.
- 1-L 플라스틱 비커에 0.5 L 플라스틱 비커를 배치하여 절연 된 저장 용기를 준비하고 탈지면과 격차를 입력합니다. 또한, 0.5 L의 작업 볼륨으로 전용 단열 용기를 사용합니다.
- 일단과 인접 콘센트 호스 연동 펌프에 열 교환기를 연결R L / S (24) 튜브를 사용하여 종료. 두 튜브는 절연 된 저장 용기에 온도계와 함께 종료 놓고 300 ml의 추출 버퍼 (그림 2)와 함께 입력합니다.
- 온수 욕에 열교환기를 배치하고 300 mL의 분 -1의 속도로 연동 펌프를 시작한다. 선박의 결과 온도가 3 분 후, 70 ° C, 수조의 세트 포인트 아래 약 4.5 ° C인지 확인합니다.
- 절연 된 - 용기의 온도가 70 ° C 다르면 그에 따라 수조의 온도를 조정하고, 시스템을 15 분 동안 평형을 보자. 이하의 3 분에서 70 ° C로 주위에서 추출 완충액의 온도가 증가 될 때까지이 단계를 반복하거나, 실험에 필요한 것 같다 및 스테인리스 용기를 비우고.
- 절연 용기로부터 추출 버퍼를 취소하고 식물 추출물의 300 ml의 분취 량을 준비합니다. 하나 나누어으로 절연 용기를 입력합니다.
- 5 분 동안 분 -1에서 300㎖의 열교환을 통해 식물 추출물 (3.3) 펌프. 추출 온도가 3 분 후 70 ° C, 또는 실험 설계에 정의 된 온도에 해당하는지 확인하십시오.
- 추출액을 계속 펌핑되는 동안 5 분 후, 얼음 냉수 조 내에 열 교환기를 배치했다. 온도가 정확히 20 ° C에 도달하거나, 실험 설계에서 정의 된 온도까지이 설정 부화.
- 절연 된 용기로부터 연동 펌프에 접속되는 급수 호스를 분리하고 열교환 기 내에서 잔열 침전 식물 추출물을 수집하기 위해 펌핑 계속한다. 그런 다음 펌프를 중지합니다.
- 반복 5.7 모든 분취 5.10에 단계를 반복합니다. 그 다음 가방 여과 (6 절)에 추출물에 통과, 최종 온도에 도달하면 각 열 침전 추출물의 1 ml의 샘플을 가져 가라.
참고 : 첫 번째 사이클을 통해 5.10에 5.7 단계 이후에는 추출 버퍼가 없을 것단계 5.7에서 폐기하십시오.
플랜트 추출 6. 가방 여과
- 필터 하우징 내로 끼워가요 필터 재료에 대한 기계적지지를 제공하는 대응하는지지 바스켓에 백 필터를 탑재. 바구니 아래에 1 L 용기를 놓고 150 ml의 분 -1의 속도로 가방 (선택한 열처리에 따라 3.3, 4.10 또는 5.11) 추출물의 분취 량을 적용합니다.
- 여과 후, 탁도계를 사용하여 추출 완충액 여액 1:10 희석의 탁도를 측정한다.
- 예를 들면, 깊이 여과 및 크로마토 그래피 7,10를 1 ml의 샘플을 가지고 실험 설계에 정의 된 가방 여과 액을 처리합니다.
7. 샘플 분석
- 브래드 포드 (Bradford) 방법 (24, 25)를 사용하여 총 가용성 단백질 (TSP)의 양을 측정한다.
- 삼중에서, 하나의 웰에 각 샘플 2.5 μL 피펫96 웰 플레이트. 2,000 μg의 ml의 -1 - 범위 0을 포함 세중의 팔 소 혈청 알부민 (BSA) 표준을 포함합니다.
- 거품을 형성하지 않도록 부드럽게 충분히 각 웰에 200 ㎕의 브래드 포드 시약을 추가하고 아래로 pipetting에 의해 철저하게 혼합하지만.
- 22 ° C에서 10 분 동안 품어 분광 광도계로 595 nm에서 흡광도를 측정한다. BSA에 기준점을 통해 표준 곡선에 기초하여 샘플 내의 TSP 농도를 계산한다.
- 표면 플라스 몬 공명 분광기 (26)에 의해 정량화 Vax8.
- 설치 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)을 실행 완충액으로 표면 플라즈몬 공명 기기 (10 mM의 HEPES, 3mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1,500 mM 염화나트륨, 0.05 % V / V 폴리 소르 베이트 20, 산도 7.4) 장치로 카르복시 덱스 트란 표면에 칩을 탑재합니다. 시스템 플러시 주요한 기능을 사용하고 (30)의 유량을 갖는 수동 실행을 시작할μL 분 -1 플로우 셀 (1) 및 25 mM의 수산화 나트륨 60 초 산재 분사 회 60 초 2.를 주입 30mm의 염화수소 위에.
- 500 μg의 용액 200 ㎕를 -1 단클론 항체 5.2 10 MM의 아세트산 나트륨 (산도 4.0)에서 솔루션을 준비합니다. 해동 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필 ) 카 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC) 및 N의 -hydroxysuccinimide (NHS) 바이알 1 분 동안 16,000 × g으로 원심 분리하여 그들을. NHS의 70 μL와 EDC의 70 μl를 혼합하고 7 mm 플라스틱 병에 전송할 수 있습니다.
- 10 ㎕의 분 -1의 유속으로 10 분 동안 EDC / NHS 유동 세포 하나 이상의 혼합물이 주사하여 카르복시 메틸화 된 덱스 트란 표면 칩 표면을 활성화.
- 셀 2 만 흐름 흐름 경로를 설정합니다. 10 ㎕의 분 -1의 속도로 15 분 동안 주입하여 그것을 몇 단클론 5.2.
- 전지 1 및 2를 흘러 분 -1 표면을 비활성화 5 μL의 속도로 7 분 동안 에탄올을 주입하는 유로 전환. 티암탉 25 mM의 수산화 나트륨 60 초 산재 주입 60 초 동안 두번 30mm의 염화 수소를 주입.
- 30 μL 분의 속도로 19 기준 -1 180 초 - 샘플 및 MSP1을 주입한다. 1000 NG ml의-1 - Vax8 농도가 50 있는지 확인하십시오. HEPES에 미리 희석하여 준비가 필요 EDTA 및 폴리 소르 베이트 20 (HBSEP)를 포함하는 완충 식염수.
- 플로우 셀 (2)의 그것과 플로우 셀 (1)의 피크 신호를 빼고 MSP (1)의 신호에 기초하여 샘플 내의 Vax8 농도 계산의 차이를 사용하여 500 - NG 용액 -1 알려진 단백질 농도 19 주사.
- 30 ㎕의 분의 유속으로 60 초 동안 30mm의 염화 수소에 노출 19 주입 -1 - 각 시료 또는 MSP 한 후의 칩 표면을 재생성.
- 형광 분석법으로 정량을 DsRed
- 세중에서, 검은 반 아칸소의 단일 우물에 각 시료의 피펫 50 μL개 96 웰 플레이트. 225 μg의 ml의 -1 - 범위는 0 다루는 육을 DsRed 기준을 포함합니다.
- 530 ± 30 nm의 여기 필터와, 분광 광도계의 590 ± 35 nm의 방출 필터를 사용하여 중복에서 형광을 측정한다. 을 DsRed 기준점 통해 표준 곡선에 기초하여 상기 샘플을 DsRed의 농도를 계산한다.
- 입도 분포의 측정
- 1 ml의 이소프로판올로 큐벳을 세척 한 후 탈 이온수 2 ml의 먼지 입자를 제거 할 수 있습니다. 큐벳에 시료 850 μl를 피펫.
- 제타 전위 및 입자 크기 분석기로 큐벳을 놓습니다. "소프트웨어"를 열고 재료로 "단백질"및 분산제와 같은 "PBS"와 수동 측정을 시작합니다. 25 ° C의 온도 및 180 초의 평형 시간을 선택합니다.
- 173 °의 후방 산란에서 "DTS0012"셀 측정을 선택합니다. "자동"(SECURITY) 기능을 비활성화 확인측정 기간 동안 이온없이 산재 지연 3 회 측정을 선택합니다.
- 측정 실험 뷰 샘플의 3 회 측정을 선택하여 완료되면 입도 분포 피크 프로파일을 조사한다. 은 "볼륨 PSD"탭을 선택합니다.
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Representative Results
치면 담배 숙주 세포 단백질의 열 침전
제 2 항에 기재된 희게 절차가 성공적으로 담배는 96 ± 1 %까지 TSP를 감소 70 ° C로 나뭇잎 HCP가 석출 하였다 (N = 3) 따라서, Vax8 표적 단백질의 51 %까지 회복은 증가하면서 크로마토 그래피 분리 16 이전에 0.1 % ~ 1.2에서 순도. 이 64.1 %로 3.3 %에서 순도를 증가 형광 단백질을 DsRed 83 ± 1 % (N = 3)를 복구하는 것이 가능했다. 창백 절차는 쉽게 바이오 매스 세척, 균질화, 가방 여과과 깊이 여과로 구성된 표준 추출 및 설명 방식 (그림 1) 7에 통합되었다. 창백 장비를 준비 (그림 2) 정기적으로 20 분 소요 정화 장치의 설정 시간 약 5 분을 추가했다. 또 다른 7 분을 수행하기 위해 요구 된45 분의 전형적인 추출 및 정화 시간 이외에 그대로 나뭇잎 창백. 그러나, 추가 7 분의 2 분 실제 "손에"시간이었다. 또한, 1 분 미만의 짧은 배양 시간은 약 3 분, 7 분에서 창백 시간을 단축 가능하다. 따라서,뿐만 아니라 조 희게하는 식물 추출물 제품의 초기 순도를 증가 시키지만, 또한 신속 따라서 적어도 초기 크로마토 그래피 단계를 대체 할 수있는 가능성을 제공하고, 추가 처리 장치가 완성된다. 희게 욕 온도는 일정하게 유지 즉, <0.2 ° C 변동도 바로 주위 온도에서 수확 하였다 잎의 첨가 후 모든 실험 동안. 이것은 이후 정화 단계 TSP 감소, 제품 수율 및 필터 능력의 측면 (도 3 (N = 24) 처리는, 즉, 17 %의 변형 계수의 평균 반복했다 확보 9, 후 단백질 추출 (8) 및 필터 에이즈 후 응집제를 추가하여 해결할 수 있습니다. 60 ° C의 온도 (N = 3) HCP가 80 ± 3 %를 제거하고 필터의 용량에 영향을주지 않고 Vax8 순도를 2.6 ± 0.1 배 (N = 3)를 증가시키기에 충분했다. 따라서, 치면 HCP 제거 즉 중간 열 안정성, 70 ° C 27, 28 미만의 용융 온도를 목적 단백질과 호환된다. 그러나, 70 ° C 이상의 온도를 증가시키는 것은 95 % (도 3)의 HCP 제거 될 수있다. 이것은 대부분의 R의 신속한 식별을 허용 때문에 통계적인 방법 (22)를 사용하여 잘 설계된 방식으로 실험의 대응하는 세트를 실시 유용elevant 프로세스 파라미터, 즉, 가열 시간과 온도. 동시에, 암컷 방법은 프로세스 최적화 (16)을 용이하게하기 위해 예측 모델을 생성.
그림 2 :. 세 가지 방법의 도식 설치는 그 A. 창백 그대로 잎이 들어있는 바구니가 침수 된에 온도 (T)로 가열 된 수조에서 수행 하였다 본래 잎 또는 추출물에서 담배 HCP가를 침전. 수조는 균일하고 일정한 온도가되도록 교반 하였다. B. 마그네틱 교반 막대 및 잎 추출물을 함유하는 용기를 수욕에 침지 하였다. 추출액의 온도는 필요한 온도가 달성되었는지 확인하기 위해 측정 하였다. C. 열교환 (H)는 펌프 (P)와 단열 스토리지 박에 연결된식물 추출물을 함유하는 전자 용기. 열 교환기는 수욕 및 모니터링 하였다 가열 추출물의 온도에 잠겨 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 그들의 프로세스 성능에 미치는 영향과 두 대상 단백질의 정제보기 세 열 강수 방법의 비교. HCP가 90 % 이상 제거지지 조건은 교반 용기 및 2.5 배의 최소하여 표적 단백질 Vax8하고을 DsRed의 순도를 증가 모두 열교환 설정하고 (19)의 최대 희게 대해 식별 된 -fold와 창백 최고 성능. 대조적으로, 단지 교반 용기 설치는 subseq의 용량을 증대열처리 공장 또는 추출물의 설명에 사용 uent 깊이 여과 단계. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다 (n = 3)를 나타낸다. B한다. 다른 열처리 조건 후 샘플의 HCP 함량을 분석 한 결과, 쿠마시 염색 된 폴리 아크릴 아미드 겔을 사용하여 비교 될 수있다. RUBISCO (초록색 화살표)의 반면을 DsRed (적색 화살표) 용액에 남아 있고, 열처리 중에 온도 상승과 같은 다른 HCP가 함께 제거된다. * 0.5 분 동안 열에 노출 된 샘플은 다른 모든 샘플은 3.0 분 이상 치료를 받았다 나타냅니다. 다시 인쇄 (16)의 허가와. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
교반 용기 HCP가의 열 침전
열 침전 교반 된 용기를 84 ± 1 %의 최대 제거 (N = 3) HCP에, 순도 O 달성F 0.33 ± 0.02 % (N = 3) Vax8 및 20.2 ± 1.4 % (N = 3)을 DsRed 용 (그림 3). 열처리는 용기에 직렬로 다수의 시료를 처리 할 때 장치 점유 반영 지연을 방지하기 위해 균질화 분리 행했다. 실험실 규모의 공정 처리에 필요한 노력을 희게하지만 추가 스테인리스 용기 전용 냉각 단계가 필요 하였다 대한 것과 유사 하였다. 또한, 추출물의 열 전달은 희게보다 10 배 더 긴, 적어도 5 분의 배양 시간, 즉으로 희게 동안보다 느렸다. 지연된 가열 전사 가열 추가적인 장벽을 야기되는 혈관에 의해 야기 의한 식물 생물량 이외에 추출 완충액의 존재 용기에서 가열 하였다 ~ 300 % 더 큰 질량 하였다. 서서히 추가적인 열전달 장벽을 구축하고 작업량 증가 같은 용기의 벽에 부착 된 단백질을 침전이후 청소 필요합니다. 부분적으로 개방 시스템의 에너지 손실을 보상 열 침전에 사용되는 온도 이상으로 수조 온도 8 ℃로 설정하고 원하는 추출 온도를 달성했다. 용기에 (제 2), 열교환 기 설정 (5 장), HCP 침전 희게 달리 열을 추출 펌프에 비해 용기 내의 낮은 전단력을 반영 2.5 배 하류 심층 여과 용량을 증가 기 또는 균질화 희게 후, 아마도 가방 여과 단계에서 제거하는 것이 더 쉽다 큰 집계 결과.
열교환 기에서의 열교환 HCP에 침전
약 88.3 ± 0.7 % (N = 12)에 HCP 콘텐츠의 지속적 온도 범위 내에서 열교환기를 이용하여 추출 제거 하였다 60-70 ° C, Vax8 대해 0.31 ± 0.01 % (N = 12)의 순도를 달성하고 27.6 ± 2.0 % (N = 12)을 DsRed 용 (그림 3). 변화의 평균 계수는이 절차의 반복성이 창백보다 더 나은 것을 나타내는 13 % (N = 24)이었다. 수조 온도가 높은 4.5 ° C를 설정 한 경우, 원하는 추출 온도는 2 ~ 3 분 후에 달성되었다. 가열 된 용기에 관해서는, 전용의 냉각 공정은 열처리 후에 요구되었다. 열교환 기 때문에 집중 청소 필요 펌핑 장치 및 열교환 기인 좁은 내경 스테인레스 스틸 튜브의 벽에 부착 된 침전물 다른 방법보다 처리 노력을 포함했다. 열 교환기는 폐색 전 13.5 ± 6.0 (N = 3)의 L m -2 명확히 최저 하류 깊이 필터의 용량을 달성했다.
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Discussion
상기 열 강수량의 세 가지 방법을 효과적으로 모든 크로마토 그래피 정제 단계 (16, 17) 이전에 담배 HCP가 제거 할 수 있습니다. 그들은 예를 들어, 초기 제품 순도, guttation (29), 분비 단백질로 제한됩니다 모두 rhizosecretion 30 원심 추출 (31, 32)을, 증가하는 것을 목표로 다른 전략을 보완합니다. 표적 단백질은 1 개 이상의 분 ~ 60 ° C의 최소의 석출 온도를 견딜 수있는 정제 할 경우, 열 기반의 방법 만 의미있는 방식으로 사용될 수있다. 따라서, 상기 세 가지 방법 중 첫 번째 단계는 16,18,21을 항원 여러 열대열 원충에서 다른 도메인으로 이루어진 여러 말라리아 백신 후보 단백질 설명한 충분히 높은 용융 온도와 타겟 분자를 설계하는 것이다. 표적 단백질의 열 안정성이 증명되면 번세 가지 방법이 이용 가능한 기기와 매체, 예상되는 최종 공정 규모 이후 DSP (16) 동작에 기초하여 선택 될 수있다.
희게하는 최소한의 방법 및 장치의 추가 요구 빠른 하였다, 그래서 그것은 쉽게 식물 유래 재조합 단백질에 대한 기존의 실험실 규모 정제 프로토콜로 구현 될 수있다. 창백 액체의 철저한 교반 실험 데이터와 이론적 계산 21,33 모두에 따라 HCP 침전의 효율에 영향을 미치는 중요한 과정 매개 변수입니다. 호스트 프로테아제 활성 21,34 남아 있으면 결국 제품에 해로울 수있는 부분적인 제거에 HCP 열전달 결과를 손상시킬 수 양호한 혼합을 달성하는 데 실패. 몇몇 다른 파라미터는 예 HCP 침전, 가열 온도 및 배양 시간에 영향을 미칠 수 있고, 회절 광학 접근 따라서 가장 중요한 FA를 특성화하는 것이 유용 할 수있다ctors 및 제공 예측 모델은 제품의 순도, 복구 및 DSP (22) 단계 이후의 성능과 같은 반응에 미치는 영향을 정량화한다.
용기 설정에서 긴 배양 시간은 완전한 HCP 석출을 달성하기 위해 필요하고, 이러한 고온에 장시간 노출을 반영 바람직 표적 단백질 변성의 가능성을 증가시킬 수있다. 용기의 철저한 혼합은 열 전달을 향상시키고, 가열 시간을 줄일 수있다. 추출물 21,34에 단백질 분해 효소 제품 손실의 원인, 최종 열 불 활성화하기 전에 더 활성화 될 경우,이 설정에 긴 온도 램프도 도전 할 수있다.
용기 설치 관찰 증가 깊이 필터 용량이 큰 개수의 샘플이 고정 예산 프로젝트에서 취급 할 수 있도록하거나 experim의 주어진 세트에 대한 전체 자금 요구를 감소 소모품 비용을 줄이는 데 도움엔트. 그러나,이 효과는 암컷의 일환으로 여러 추출 실행은 예를 들어, 실험 일련의 필요한 경우 프로세스 홀드 단계의 도입을 방지하기 위해 균질화 외에 필요한 부가 용기의 비용이 크다고 할 수있다 접근. 더 많이 혼합 체제 위에서 제안 가열 시간을 단축하는 데 사용되는 경우 필터의 용량에 대한 긍정적 인 효과도 감소시킬 수있다.
전용 냉각 단계는 추가 자원뿐만 아니라, 또한 유창 교육청 절차 또는 일반적으로 실험 순서와 충돌 할 수있는 샘플 당 전체 처리 시간을 연장뿐만 아니라 필요로하는 모두 추출물 기반 열 침전 방법에 대한 필요가있다. 열교환 기 설치 잘 엔지니어링 관점 (35)로부터 특징으로 쉽게 스케일 업 동안 표면 대 부피 비율을 변경 용기 대조적 설계 및 특정 온도 차이를 확장 할 수있다. 방법열교환 기의 크기가 정의되면 이제까지, 그것의 길이를 따라서 전열 면적이 고정되어 있기 때문에 다른 온도 차이로 조정하기 어려울 수있다.
등의 체류 시간 등의 파라미터 (또는 유속)과 열교환 매체의 온도를 변화 어느 정도의 유연성을 복원 할 수 있지만, 소규모 실험에서 이러한 요인은 전형적으로 공정 스케일 조작 인해에게의 좁은 윈도우에서 작동되기 때문에 사용 가능한 장비와 미디어에 의해 부과 된 제한. 5 분 및 40의 온도차 - - (3)의 짧은 배양 시간의 조합에 대한 수요 60 ° C는 열교환 기의 크기가 커지기 때문에, 처리 규모가 증가함에 따라 소자의 레벨에서 해결하기가 점점 어려워진다. 매체 원하는 추출 온도 사이의 온도 차이는 종종 작기 때문에 냉각 공정에 특히 참 (ΔT = 10 ~ 15 ° C)대형 장비 치수 이상 냉각 시간의 결과로 가열 단계 (ΔT = 20 ~ 40 °의 C)보다.
미래에, 프로토콜은 본 연구에서 특별히 열 안정성을 위해 설계되었다 백신 후보들 이외에 바이오 단백질에 적용 할 수있다. 대부분의 항체는 이미 현재 열처리 프로토콜과 호환되는> 70 ° C (36, 37)의 온도를 견딜 수있다. 이 자연 열 안정성하여 여기에 제시된 방법 (및 그 변형)을 실시 할 수있는 단백질의 수를 증가시키는, 상이한 항체 도메인 38 엔지니어링 더욱 증가 될 수있다. 희게 방법은 이미 열 안정성 또는 단백질 공학에 대한 선택의 대상이되지 않은 모노클로 날 항체 (2G12) (17)를 발현하는 형질 전환 담배 식물에 적용되었다. 65 ° C에서 열처리 배 항체의 순도를 증가두 이전의 크로마토 그래피 정제에 복구 희게없이 관찰 된 것과 유사한 동안.
고온 단시간 39 : 또한, 발현 시스템의 개별 HCP의 융점을 특성화하는 것은 공정이 우유의 살균 유사한 수행 될 수있는 온도의 식별을 용이하게 할 수있다. 열처리 (희게 제외)과 같은 제품에 필요한 온도를 견딜 수 있다면 HCP가 제거 다른 생물학적 출발 물질에 적용 할 수있다. 후자는 포유 동물 세포 배양 상청액 다른 식 플랫폼이 처리되는 경우 여기서 설명하는 것과 일탈있다. 어떤 경우에, 비용 편익 비, 즉 감소 HCP 레벨의 장점은 추가적인 투자 비용을 발생시키는 열처리 공정을 구현하기위한 비용을 능가하지 고려 처리 시간을 증가시키고 제품 yie을 감소되어야LD 16. 이러한 맥락에서 중요한 매개 변수는 제품 활동이다. 그것은 어떤 단백질 - 기반 백신 선형 에피토프의 존재에 의존한다면, 열처리 효과 (40)를 가질 가능성이있다. 단백질 구조는 구조적 에피토프를 들어, 예를 들어 중요하다면 대조적으로, 효소의 활성 부위의 아미노산 측쇄의 정확한 방향 또는 영역을 결정 항체의 상보성의 정확한 폴딩은 열처리 단백질 활성 (41, 42)를 방해 할 수있다. 따라서, 적절한 분석 분석은 전 열처리 후의 제품의 성능을 모니터링하기 위해 설립되어야한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
| Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
| Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
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