Summary
Три тепла представлены методы осаждения, которые эффективно удалить более 90% белков клетки-хозяина (НСР) из экстракта табака до любой другой стадии очистки. Завод НСР необратимо агрегировать при температурах выше 60 ° C.
Abstract
Растения не только обеспечивают продуктов питания, кормов и сырья для человека, но также были разработаны в качестве экономичной системы производства для биофармацевтических белков, таких как антитела, вакцин-кандидатов и ферментов. Они должны быть очищены от биомассы растений, но хроматографические стадии мешают высокие концентрации белков клетки-хозяина (НСР) в растительных экстрактах. Тем не менее, большинство НСР необратимо агрегировать при температурах выше 60 ° C, облегчающих последующую очистку целевого белка. Здесь три метода представлены для достижения осаждению тепла табака ВДС в или интактными, листьев или экстрактов. Побледнение неповрежденных листьев можно легко встроить в существующие процессы, но может оказать негативное влияние на последующих стадиях фильтрации. Обратное верно для осаждения тепла листьев экстрактов в сосуде с мешалкой, которая может улучшить производительность последующих операций, хотя и с основными изменениями в конструкции технологического оборудования, таких какГомогенизатор геометрии. И, наконец, установка теплообменника хорошо характеризуется с точки зрения условий теплообмена и легко масштабировать, но очистка может быть затруднена и может быть негативное влияние на емкость фильтра. Подход дизайн-оф-экспериментов могут быть использованы для идентификации наиболее релевантных параметров процесса, влияющих на удаление HCP и восстановление продукта. Это облегчает применение каждого метода в других платформ экспрессии и определения наиболее подходящего метода для данной стратегии очистки.
Introduction
Современные системы здравоохранения все больше зависят от биофармацевтических белков 1. Производство этих белков в растениях является предпочтительным из - за низкой нагрузки патогена и большую масштабируемость по сравнению с традиционными системами экспрессии 2-4. Тем не менее, ниже по течению обработки (DSP) растительного происхождения, лекарственных средств может быть сложной задачей, поскольку подрывные процедуры извлечения приводят к высоким бременем частиц, мути превышающей 5000 нефелометрическая единиц мутности (модулей NTU), и клетка-хозяин белка (HCP) концентрации часто превышает 95 % [м / м] 5,6.
Сложные процедуры осветления необходимо удалить дисперсные частицы 7-9, но хроматографию оборудование является менее дорогостоящим для работы в режиме связывания-и-Элюции во время первоначального восстановления продукта , если есть более ранний шаг для эффективного удаления ВДС 10,11. Это может быть достигнуто либо путем осаждения белка-мишени с использованием flocculМуравьи 12 или с низким рН 13,14, а также в результате чего НСР в совокупности. Селективная агрегация рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы / оксигеназы (RuBisCO), наиболее распространенным НСР в зеленых растениях , таких как табак (Nicotiana аЬасит), может быть ускорена добавлением полиэтиленгликоль 15, но это дорого и несовместимыми с большой -scale производства. Термообработка Было показано , что денатурации и выпадают в осадок более 95% табака ВДС, в то время как кандидаты вакцинных белок малярии , такие как Vax8 остаются стабильными в растворе 16-18.
Три различных подхода были использованы для достижения осаждения термически индуцированные табака ВДС: (I) бланширование, т.е. погружение интактных листьев в горячей жидкости, (II) с регулируемой температурой с мешалкой, и (III) , теплообменник ( Рисунок 1) 16. Для неповрежденных листьев, бланширование достигается быстрое и эффективное осаждение ВДС и также легкодля расширения и совместимо с существующими производственными процессами крупномасштабных , которые включают начальный шаг для мытья биомассы растений 19. В противоположность этому , с контролем температуры сосуды уже доступны в некоторых процессах , и может быть использован для термической обработки растительных экстрактов 20, но их масштабируемость и скорость передачи энергии ограничены , так как отношение поверхности к объему резервуаров постепенно уменьшается и становится непригодным в процессе масштабе. Теплообменник представляет собой технически четко определенной альтернативой нагревали с мешалкой , но требует обильный запас нагрева и охлаждения сред, например, пара и холодной воды, а также жестко контролируемой объемной скорости потока , который адаптирован к геометрии теплообменника и СМИ свойствами, например., удельная теплоемкость. В этой статье показано, как все три метода могут быть использованы для осаждения термически индуцированные табака ВДС и растений ВДС в целом. Создание и эксплуатация EACМетод ч в лабораторных условиях могут быть использованы для оценки их пригодности для более масштабных процессов. Основная задача состоит в том, чтобы определить адекватные модели масштаба вниз и рабочие условия для каждой операции, напоминающие устройства и условия, используемые в процессе серийного производства. Данные , представленные здесь , относятся к экспериментов , проведенных с трансгенных растений табака , экспрессирующих вакцины от малярии кандидат Vax8 и флуоресцентный белок DsRed 16, но этот метод также был успешно применен к N. benthamiana растения скоротечно экспрессирующие другие биофармацевтические белки 21.
А дизайн-оф-экспериментов (DOE) подход 22 может способствовать развитию процесса, и флокулянтов 23 также может быть полезным в этом контексте , как описано выше 8. Основное различие между бланширование, нагреваемых сосудов и теплообменников, что бланширование применяется к неповрежденным листьев на ранней стадии процесса, тогда как ВЗее наносят на растительные экстракты (рисунок 1).
Рисунок 1:. Схема процесса Схема Иллюстрируя реализации трех различных методов Tobacco HCP тепла Осадки Растительный материал промывают и гомогенизируют перед осветлением и очистки. Оборудование для бланширования (красного цвета), могут быть легко добавлены к существующей техники. В противоположность этому , используя перемешанную сосуд (оранжевый) и особенно теплообменник (синий) требуется один или несколько дополнительных устройств и трубок. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. культивировать растений табака
- Промыть каждую шерсть блок минерал с 1 до 2 л деионизированной воды, а затем 1 л 0,1% [вес / объем] раствора удобрений. Поместите один семени табака в каждом блоке из минеральной ваты и осторожно вровень с 0,25 л раствора удобрений без вымывания семян 16.
- Культивировать растения табака в течение 7 недель в теплице с 70% относительной влажности воздуха, 16 ч фотопериода (180 мкмоль сек - 1 м - 2; λ = 400 - 700 нм) и 25/22 ° C свет / темный режим температуры.
- Заготавливают все листья, за исключением четырех семядольных листочков, которые расположены у основания стебля растения.
2. Необязательно: Heat Осаждение Бланшировка
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните действия, описанные в пунктах 2.1 до 2.12, чтобы осадить табака HCPS путем бланширования. Пропустить весь раздел 2, если будет осаждаются НСРв нагретом сосуде (раздел 4) или с помощью теплообменника (раздел 5).
- Отложите 50 г растительного материала и осуществляют добычу без бланширования (раздел 3). Возьмите пробу этого экстракта в качестве внутреннего контроля в ходе последующего анализа (раздел 7).
- Установить водяной бане 8-L рабочий объем, например, 50 х 40 х 40 см, в теплоизоляцией из пенополистирола ведра или аналогичный. Установить регулируемый термостат на водяной бане для последующего контроля температуры (шаг 2.7).
- Перенесите всю сборку на магнитную мешалке и помещают магнитную мешалку на водяной бане. Убедитесь в том, что магнитное поле является достаточно сильным, чтобы вращать мешалку.
- Окружите мешалку по меньшей мере, четыре опорных плиток, на которых полипропиленовый корзина (шаг 2.6) будут размещены позже во время процедуры бланшировки. Убедитесь , что опорные плитки выполнены из немагнитного материала (например, стальной сплав , содержащий никель нержавеющая) , и что онивыше , чем перемешивающий стержень (рисунок 2).
- Добавить 8 л деионизированной воды на водяной бане.
Примечание:. Использование буфера, например, 50 мМ фосфата натрия (рН 7,5), может повысить урожайность белка - мишени , если количество осадков с низким рН является проблемой. - Поместите 23 х 23 х 23 см полипропилен корзины на опорные плитки и убедитесь, что корзина не мешает вращению на размешать бар и что он полностью погружен в жидкость. При необходимости добавьте дополнительную воду / буфер, пока корзина не будет полностью погружен, а затем удалить корзины снова.
ВНИМАНИЕ: Все последующие шаги до 2.12 включают обработку горячей жидкости. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая теплоизолированных перчатки. - С помощью регулируемого термостата, чтобы довести ванну воды до 70 ° C (или температуры, необходимой для проведения экспериментов). Подождите, по крайней мере 15 минут после того, как требуемая температура будет достигнута, чтобы обеспечить всю сборку достиг Thermaл равновесие.
- Подготовьте 150 г аликвот из заготовленной листьев табака. Положите одну аликвоту в корзине, избегая при этом необратимое сжатие и повреждение листьев, например, путем разрыва. Избегайте переполнения корзины с растительным материалом или плотной упаковки последнего.
- Тщательно, но быстро погрузить корзины в горячей жидкости и поместите его на опорные плитки. Поместите блок из нержавеющей стали на верхней части корзины, чтобы предотвратить плавучесть.
- Выдержите листья в течение 5 мин в бланширования жидкости, или выбрать время устраивающего дизайн эксперимента. Монитор температуры жидкости в течение всего периода инкубации.
- Осторожно снимите корзины из бланширования жидкости и пусть остаточный слив жидкости из листьев в течение 30 сек. Затем возьмите листья растений из корзины, передать их в блендере и сразу же начать извлечение (раздел 3).
Примечание: Растения могут храниться в течение длительного периода времени после того, как бланширование и до начала годобыча е, например, более чем на 30 мин на льду или замораживали при -20 ° С в течение нескольких недель была успешно протестирована. Тем не менее, стабильность продукта может снижаться с увеличением сроков хранения и, таким образом, рекомендуется немедленная обработка. - Повторите шаги 2.8 до 2.11 со свежим листом материала, пока весь урожай биомассы не обрабатывается.
3. Белки экстракции из листьев табака
ВНИМАНИЕ: Следующие шаги включают блендер с вращающимися лопастями. Не работать в блендере ведро в то время как он установлен на блендера двигателя.
- Поместите 150 г (сырой массы) заготовленной (этап 1.3) или бланшированные (этап 2.11) уходит в блендере и добавить 450 мл экстракционного буфера (50 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорида натрия, 10 мМ дисульфита натрия, рН 8,0).
Примечание: Состав буфера экстракции зависит от белка , предназначенных для извлечения , и может , таким образом , требуют корректировки, например, использование другого рН или буфер компонент , такой как Trявляется. - Перемешать листья в течение 3 х 30 импульсов сек с 30 сек перемежаются перерывы. Убедитесь в том, что листья гомогенизируют и не забивают блендера ведро. Остановите блендер и поднимите листья, чтобы предотвратить засорение при необходимости, а затем продолжить гомогенизацию.
- Возьмите пробу 1 мл каждого экстракта, который производится для последующего анализа (раздел 7). Если растительный материал бланшируют, перейдите к разделу 6. В противном случае продолжайте с осадками тепла в сосуде (раздел 4) или теплообменник (раздел 5), в зависимости от выбранного экспериментального подхода.
4. Необязательно: Тепло Осадки в перемешиваемом сосуде
Примечание: Провести шаги, описанные в разделах 4.2 до 4.11, чтобы осадить табака ВДС в сосуде с мешалкой. Пропустить весь раздел 4, если НСР были осаждают побледнение (раздел 2) или будет осаждают с помощью теплообменника (раздел 5).
- Установите два 8-L рабочий объем водыванны, например, 50 х 40 х 40 см, в теплоизолированной пенополистирола или аналогичный. В первой ванне, установите регулируемый термостат для последующего контроля температуры (шаг 4.6). Во втором случае, добавляют 5 л деионизированной воды и 2 кг льда для последующего охлаждения (этап 4.9).
- Перенести первую ванну воды на магнитной мешалке, и поместите 2-L сосуд из нержавеющей стали в ванну с водой таким образом, что центр судна совмещен с центром мешалке.
- Поместите магнитную мешалку в нержавеющей стали судна. Убедитесь в том, что магнитное поле является достаточно сильным, чтобы вращать мешалку.
- Наполните ванну водой деионизированной водой до 5 см ниже верхнего края сосуд из нержавеющей стали. Затем заполнить емкость с буфером для экстракции. Поместите пенополистиролом крышку на судне.
ВНИМАНИЕ: Все последующие шаги до 4.9 включают обработку горячей жидкости. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая термически иновнерегулируемом перчатки. - Вставьте термометр в сосуд из нержавеющей стали через Suiting отверстие в крышке пенополистирола. Установите температуру водяной бане до 78 ° С и инкубировать всю сборку в течение 15 мин для достижения теплового равновесия. Убедитесь, что температура в сосуде составляет 70 ° С, приблизительно на 8 ° С ниже заданного значения водяной бани.
- Если температура в сосуде из нержавеющей стали отличается от 70 ° C, регулировать температуру воды в ванне, соответственно, и позволить системе уравновешивания в течение еще 15 мин. Повторите этот шаг, пока температура в сосуде не 70 ° С или по мере необходимости для эксперимента, и опорожнить сосуд из нержавеющей стали.
- Налейте 300 мл экстракта (шаг 3,2) в нержавеющей стали сосуд, пока он еще в водяной бане и запустить таймер. Перемешать экстракта при 150 оборотах в минуту и инкубировать в течение 5 мин. Убедитесь, что экстракт достигнет температуры 70 ° С в течение не менее 2 мин в течение этого периода инкубации.
- Удалите ванну с горячей водой из магнитной мешалкой, вынуть сосуд из нержавеющей стали и поместить его в ледяной ведро. Поместите последний на магнитной мешалкой и снимите крышку пенополистирола.
- Убедитесь, что гомогенат растение хорошо перемешивают со скоростью 150 оборотов в минуту, поместите термометр в экстракте и инкубировать, пока он не достигнет температуры 20 ° С или температуру, указанную в экспериментальной конструкции.
- Повторите шаги 4,7 до 4,9 для всех аликвот. Возьмите пробу 1 мл каждого осажденного нагреванием экстракта после достижения конечной температуры, а затем продолжить с разделом 6.
5. Необязательно: Тепло Осадки в теплообменнике
Примечание: Провести шаги, описанные в разделах 5.2 до 5,12 для осаждения табака HCPS помощью теплообменника. Пропустить весь раздел 5, если НСР были осаждают побледнение (раздел 2) или в нагретом сосуде (раздел 4).
- Установить два рабочего объема 8-Lводяные бани, например, 50 х 40 х 40 см, в теплоизоляцией из пенополистирола ведра или аналогичные. В первой ванне, установите регулируемый термостат для последующего контроля температуры (шаг 5.3). Во втором случае, добавляют 5 л деионизированной воды и 2 кг льда для последующего охлаждения (этап 5.10).
ВНИМАНИЕ: Все последующие шаги до 5.9 включают обработку горячей жидкости. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая теплоизолированных перчатки. - Заполните первую ванну воды с 8 л деионизированной воды. Установите температуру до 74,5 ° С с помощью термостата. Выдержите сборку в течение 15 мин для достижения теплового равновесия.
- Подготовьте изолированный сосуд для хранения путем размещения пластиковый стакан на 0,5 л в пластиковый стакан объемом 1 л и заполнить пробелы с ватой. В качестве альтернативы, использовать посвященный теплоизолированный сосуд с рабочим объемом 0,5 л.
- Подключение теплообменника к перистальтического насоса на одном конце и выпускной шланг на флористикуг конец с помощью L / S 24 трубки. Поместите обе трубки заканчивается вместе с термометром в изолированной емкости для хранения и залейте его 300 мл буфера для экстракции (рисунок 2).
- Поместите теплообменник в ванну с горячей водой и начать перистальтического насоса со скоростью 300 мл мин - 1. Убедитесь, что полученный в результате температура в сосуде составляет 70 ° С, приблизительно 4,5 ° С ниже заданного значения водяной бани, через 3 мин.
- Если температура в изолированном сосуде отличается от 70 ° C, регулировать температуру воды в ванне, соответственно, и позволить системе уравновешивания в течение еще 15 мин. Повторите этот шаг, пока температура буфера экстракции увеличивается от температуры окружающей среды до 70 ° C менее чем за 3 мин, или равно, что требуется для эксперимента, и слейте из нержавеющей стали сосуд.
- Выбросите буфера для экстракции из изолированного сосуда, и готовят 300 мл аликвоты растительного экстракта. Заполните изолированный сосуд с одной аликвоте.
- Насос растительного экстракта (раздел 3.3) через теплообменник в 300 мл мин -1 в течение 5 мин. Убедитесь, что температура экстракта составляет 70 ° C через 3 мин или равна температуре, определенной в экспериментальной конструкции.
- Через 5 мин, поместить теплообменник в водяную баню с охлажденным льдом в то время как экстракт еще закачивается. Выдержите в этой установке до тех пор, пока температура не достигнет ровно 20 ° С, или температура определяется в экспериментальной конструкции.
- Снять впускной шланг, соединенный с перистальтическим насосом из изолированного сосуда и продолжают откачки для сбора остаточного тепла осаждают растительного экстракта из внутри теплообменника. Затем остановите насос.
- Повторите шаги 5.7 до 5.10 для всех аликвот. Возьмите образец 1 мл каждого теплового высаживают экстракта после достижения конечной температуры, затем переходят на экстрактах в мешок фильтрации (раздел 6).
ПРИМЕЧАНИЕ: После первого цикла через шаги 5.7 до 5.10 не будет никакого буфера экстрактуоткинуть на шаге 5.7.
6. Мешок фильтрации растительного экстракта
- Установите рукавного фильтра в соответствующий коробом, которая установлена в корпус фильтра, и обеспечивает механическую опору для гибкого материала фильтра. Поместите 1-литровый сосуд , под корзиной и применять экстракте аликвот (раздел 3.3, 4.10 или 5.11 , в зависимости от выбранного теплового режима) в сумке со скоростью 150 мл мин - 1.
- После фильтрации, измерения мутности 1:10 разбавления фильтрата в буфере для экстракции с использованием турбидиметра.
- Возьмем образец 1 мл и обрабатывают мешок фильтрата , как это определено в экспериментальной конструкции, например, объемной фильтрации и хроматографии 7,10.
7. Анализ проб
- Измеряют количество общего растворимого белка (TSP) с помощью метода Бредфорд 24,25.
- В трех экземплярах, пипеткой 2,5 мкл каждого образца в отдельные лунки96-луночного планшета. Включает восемь стандартов бычьего сывороточного альбумина (БСА) в трех экземплярах , охватывающих диапазон от 0 - 2000 мкг мл -1.
- Добавить 200 мкл реагента Брэдфорда в каждую лунку и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, но достаточно осторожно, чтобы избежать образования пузырьков.
- Инкубировать в течение 10 мин при 22 ° С и измеряют оптическую плотность при длине волны 595 нм в спектрофотометре. Вычислить концентрацию TSP в образцах на основе стандартной кривой, проходящей через опорные точки БСА.
- Количественно Vax8 с помощью поверхностного плазмонного резонанса 26.
- Настройка поверхности плазмонного резонанса прибор с 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) проточном буфере (10 мМ HEPES, 3 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1500 мМ хлорида натрия, 0,05% об / об полисорбат 20, рН 7,4) и смонтировать карбоксиметилированная декстран чип поверхности в устройство. Используйте главную функцию, чтобы промывать систему и начать ручного запуска со скоростью потока 30мкл мин -1 в течение проточных ячеек 1 и 2. Вводят 30 мМ хлористого водорода в два раза в течение 60 секунд с 60 сек перемежаются инъекции 25 мМ гидроксида натрия.
- Подготовьте 200 мкл 500 мкг мл -1 мАт 5,2 раствора в 10 мМ ацетата натрия (рН 4,0). Оттепели гидрохлорид 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) , и N -hydroxysuccinimide (NHS) Флаконы и отцентрифугированы при 16000 х г в течение 1 мин. Смешайте 70 мкл EDC 70 мкл НГС и передать в пластиковом флаконе 7 мм.
- Активация Карбоксиметилированное декстран поверхность поверхности чипа путем инжекции смеси EDC / NHS над проточных кювет 1 и 2 в течение 10 мин при скорости потока 10 мкл мин -1.
- Установить путь потока течь только ячейки 2. Пара мАт 5,2 путем введения его в течение 15 мин со скоростью 10 мкл мин -1.
- Переключение канала потока для потока ячеек 1 и 2 и вводят этаноламина в течение 7 мин при скорости 5 мкл мин -1 , чтобы дезактивировать поверхность. Tкурица вводят 30 мМ хлористого водорода в два раза в течение 60 секунд с 60 сек перемежаются инъекции 25 мМ гидроксида натрия.
- Вводят образцы и MSP1 - 19 стандартов со скоростью 30 мкл мин -1 в течение 180 сек. Убедитесь в том, что концентрация Vax8 составляет 50 - 1000 нг мл -1. Подготовка предварительных разведений в HEPES-солевой буферный раствор, содержащий ЭДТА и полисорбат 20 (HBSEP), если это необходимо.
- Вычитание пиковый сигнал потока ячейки 1 от такового потока через измерительную ячейку 2 и использовать разность для расчета концентрации Vax8 в образцах на основе сигнала МПВ 1 - 19 инъекций с известной концентрацией белка 500 нг мл -1.
- Регенерация поверхности чипа после каждого образца или MSP 1 - 19 инъекций за счет воздействия 30 мМ хлористого водорода в течение 60 с при скорости потока 30 мкл мин -1.
- QUANTIFY Dsred методом флуоресцентной спектрометрии
- В трех экземплярах, 50 мкл каждого образца в отдельные лунки черного половинной А.Р.еа 96-луночного планшета. Включает шесть Dsred стандартов , охватывающих диапазон от 0 - 225 мкг мл -1.
- Измерьте флуоресценции в двух экземплярах с использованием 530 ± 30 нм фильтра возбуждения и фильтра излучения на 590 ± 35 нм в спектрофотометре. Вычислить концентрацию DsRed в образцах на основе стандартной кривой, проходящей через опорные точки DsRed.
- Определение распределений частиц по размерам
- Промыть кювета с 1 мл изопропанола и затем с помощью 2 мл деионизированной воды для удаления частиц пыли. Пипетировать 850 мкл образца в кювету.
- Поместите кювету в дзета-потенциал и анализатора размера частиц. Откройте «Программное обеспечение» и начать измерение вручную с "белок" в качестве материала и «PBS» в качестве диспергатора. Выберите температуру 25 ° С, а время уравновешивания 180 сек.
- Выберите "DTS0012" ячейку и измерьте 173 ° обратного рассеяния. Проверьте "авто" FUNCTиона для измерения длительности и выбрать три измерения с не перемежаются задержки.
- Исследовать от размера частиц пиковую профиль распределения, как только измерение завершено путем выбора трех измерений образца с точки зрения эксперимента. Выберите вкладку "Volume" PSD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тепло осаждение клеток табака белков хозяина побледнение
Побледнение процедуру, описанную в разделе 2. был успешно использован для осаждения HCPS из листьев табака с 70 ° C, уменьшая ПБО 96 ± 1% (п = 3) при восстановлении до 51% белка-мишени Vax8, тем самым увеличивая его чистота от 0,1% до 1,2% перед хроматографическим разделением 16. Также можно было восстановить 83 ± 1% (N = 3) флуоресцентного белка DsRed, увеличивая его чистоту от 3,3% до 64,1%. Побледнение процедура была легко интегрирована в стандартной экстракции и осветления схемы , состоящей из промывки биомассы, гомогенизации, мешок фильтрации и глубинной фильтрации (рисунок 1) 7. Подготовка бланширования оборудования (Рисунок 2) прибавили около 5 мин до времени наладки для выяснения устройств, которые обычно занимает от 20 мин. Еще 7 мин требуется для выполнениябланширование интактных листьев в дополнение к типичным для экстракции и осветления времени 45 мин. Тем не менее, только 2 мин дополнительного 7 мин было фактические "практический" время. Кроме того, короткое время инкубации в течение менее 1 мин возможны, уменьшая время бланширования от 7 мин до примерно 3 мин. Таким образом, побледнение не только увеличивает первоначальную чистоту продукта в экстрактах сырых растений, но также быстро завершена без дополнительного технологического оборудования, тем самым предоставляя возможность для замены, по меньшей мере первоначальный этап хроматографии. Бланширование температура ванны оставалась постоянной, то есть, <0,2 ° С колебание, во всех экспериментах , даже сразу же после добавления заготовленной листьев , которые были при температуре окружающей среды. Это обеспечило процесс повторялся, т.е. средний коэффициент вариации 17% (п = 24), с точки зрения сокращения TSP, выхода продукта и мощности фильтра в последующих стадиях осветления (рисунок 3 8 и фильтрующих средств после того, как мешок фильтрации 9, которая может восстановить или даже увеличить фильтр мощностей. Температура 60 ° С было достаточно для удаления 80 ± 3% (n = 3) ВДС и увеличить чистоту Vax8 2,6 ± 0,1 раза (N = 3), не затрагивая мощности фильтра. Таким образом, удаление HCP путем бланширования совместим с белками - мишенями , которые имеют умеренную термическую стабильность, т.е. температуру плавления ниже 70 ° C 27,28. Тем не менее, повышение температуры до 70 ° С или выше , может привести к удалению HCP более чем на 95% (рисунок 3). Это было полезно провести соответствующий набор экспериментов в хорошо спроектированной образом с использованием статистического подхода 22 , поскольку это позволило быстро идентифицировать наиболее гElevant параметры процесса, то есть, время и температура нагрева. В то же время, метод МЭ генерируется прогнозирующей модели для облегчения оптимизации процесса 16.
Рисунок 2: Схема установки трех методов осаждаться Tobacco HCPS в интактных листьев или их фрагментов А. Бланшировка осуществлялось на водяной бане , нагретой с термостатом (Т) , в который была погружена корзины , содержащей интактные листья.. Ванну воды перемешивали , чтобы обеспечить однородную и постоянную температуру. Б. сосуд , содержащий магнитную мешалку и экстракт листьев погружали в ванну с водой. Температура в экстракте контролируют , чтобы гарантировать , что требуемая температура была достигнута. С. Теплообменник (H) , был соединен с насосом (Р) и теплоизолированной Storagе сосуд, содержащий растительный экстракт. Теплообменник был погружен в водяной бане и температуру нагретого экстракта контролировали. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Сравнение трех тепловых методов атмосферных осадков Показано их влияние на производительность процесса и очистку двух белков - мишеней. A. Условия, поддерживающие удаление более чем на 90% ВДС были идентифицированы для бланширования, перемешанную сосуд и установку теплообменника, все из которых повышенной чистоты целевых белков Vax8 и DsRed как минимум в 2,5 раза, а максимум 19 -кратно с побледнение выполнения лучше всего. В противоположность этому, только перемешанную установки судна увеличена емкость после-uent шаг глубины фильтрации используется для уточнения термообработанных растений или экстрактов. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение (n = 3). B. Содержание НСР образцов после различных условий термообработки могут быть проанализированы и сравнены с использованием Кумасси окрашивали полиакриламидном геле. RuBisCO (зеленые стрелки), удаляется вместе с другими ВДС как температура во время лечения увеличивается тепла, в то время как DsRed (красная стрелка) остается в растворе. * Указывает на образцы, которые подвергали воздействию тепла в течение 0,5 мин, все остальные образцы обрабатывали в течение 3,0 мин или более. Повторная печать с разрешением от 16 лет . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Тепло осаждение ВДС в сосуде с мешалкой
Перемешиваемый резервуар для осаждения тепла удаляется максимум 84 ± 1% (n = 3) НСР, достижение чистоты уплотнительноеF 0,33 ± 0,02% (п = 3) для Vax8 и 20,2 ± 1,4% (n = 3) для DsRed (Рисунок 3). Тепловую обработку проводят в сосуде отдельно от гомогенизатора, чтобы предотвратить задержки отражающими размещение устройства при обработке нескольких образцов в серии. Усилие, необходимое для обработки процесса лабораторного масштаба была аналогична для бланширования, но требовалось дополнительное сосуд из нержавеющей стали и специальной стадии охлаждения. Кроме того, перенос тепла к экстракту был медленнее , чем во время бланшировки, с инкубационным время не менее 5 минут, то есть в 10 раз дольше , чем для бланширования. Отсроченное нагревание было вызвано судна, которая выдавала дополнительный барьер теплопередаче, и ~ 300% больше массы, которую нагревали в сосуде из-за наличия буфера для экстракции в дополнение к растительной биомассы. Осаждение белков также прилипшие к стенкам сосуда, постепенно вырабатывая дополнительный барьер теплопередачи и увеличивая усилиетребуется для последующей очистки. Установка водяной бане температура 8 ° C выше температуры, используемой для осаждения тепла компенсируются потери энергии в частично открытой системе и достиг желаемой температуры экстракта. В отличие от бланширования (раздел 2) и установки теплообменника (раздел 5), осаждение HCP в сосуде увеличилась емкость ниже по течению глубинной фильтрации в 2,5 раза, что отражает более низкие козлового силы в емкости по сравнению с насосное экстракта через тепла теплообменник или гомогенизацию после бланширования, вероятно, в результате чего более крупные агрегаты, которые были легче удалить на этапе мешок фильтрации.
Тепло осаждение ВДС в теплообменнике
Приблизительно 88,3 ± 0,7% (п = 12) содержания HCP был последовательно удал лс из экстракта с помощью теплообменника в диапазоне температур 60 - 70 ° С, достигая чистоты 0,31 ± 0,01% (n = 12) для Vax8 и 27.6 ± 2,0% (п = 12) для DsRed (рисунок 3). Средний коэффициент вариации составил 13% (п = 24), что указывает на повторяемость этой процедуры была даже лучше, чем бланшировки. Требуемая температура экстракта была достигнута после ~ 3 мин, если температура воды бани устанавливали на 4,5 ° C выше. Что касается нагреваемого сосуда, специальной стадии охлаждения требуется после термообработки. Теплообменник участвует больше усилий, чем обработки другими методами, так как откачка аппарат и теплообменник требуется интенсивная очистка из-за осадка приставшей к стенкам узкого внутреннего диаметра из нержавеющей стальной трубы. Теплообменник также достигли самого низкого вниз по течению емкости глубина фильтра, уточняющие только 13,5 ± 6,0 (n = 3) L м -2 до забивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Три метода для осаждения тепла , описанные выше , могут эффективно удалить табака HCPS до какого - либо хроматографической стадии очистки 16,17. Они дополняют другие стратегии , которые направлены на увеличение первоначальной чистоты продукта, например, гуттация 29, rhizosecretion 30 или центробежной экстракции 31,32, все из которых ограничены секретируемых белков. Тем не менее, тепло на основе метода могут быть использованы только в значимым образом, если целевой белок должен быть очищен может выдерживать минимальную температуру осаждению ~ 60 ° С в течение более 1 мин. Таким образом, первый шаг в любом из трех методов заключается в разработке молекулу - мишень , с достаточно высокой температурой плавления, которая была описана для нескольких малярии кандидатов вакцины белки , состоящие из различных доменов от нескольких малярийного плазмодия антигенов 16,18,21. После того, как термическая стабильность белка-мишени было продемонстрировано, одинот того, могут быть выбраны три метода на основе имеющегося оборудования и средств массовой информации, предполагаемого окончательного масштаба процесса и последующих операций DSP 16.
Отбеливание был самым быстрым из методов и дополнительных требований к оборудованию были минимальны, поэтому он может быть легко реализована в существующих лабораторном масштабе протоколов очистки для растительного происхождения рекомбинантных белков. Тщательное перемешивание бланширования жидкости является важным параметром процесса , который влияет на эффективность осаждения HCP , основанный на обоих эмпирических данных и теоретических расчетов 21,33. В противном случае добиться хорошего перемешивания может привести к ухудшению теплопередачи и в результате только частичного удаления HCP, что в свою очередь может быть вредным для продукта , если хозяева протеаз остаются активными 21,34. Несколько других параметров также могут влиять на HCP осадков, например, температуры нагрева и инкубационный время, и поэтому подход МЭ может быть полезным , чтобы охарактеризовать наиболее релевантную фаctors и обеспечивают прогностические модели для количественной оценки их влияния на ответы , такие как чистота продукта, восстановления и осуществления последующих DSP шаги 22.
В установке сосуда, более длительное время инкубации были необходимы для достижения полного осаждения HCP и это может увеличить вероятность нежелательных денатурации белка-мишени, отражающую Длительное воздействие высоких температур. Более тщательное перемешивание в сосуде может улучшить передачу тепла и уменьшить продолжительность нагрева. Длинная температура рампы в этой установки также может быть сложной задачей , если протеаз в экстракте 21,34 становятся более активными перед окончательным термоинактивации, в результате чего потери продукта.
Увеличенная емкость Глубинный фильтр наблюдается для установки сосуда может помочь снизить расходные затраты, позволяя большее количество образцов, которые будут обрабатываться в проекте с фиксированным бюджетом или сокращения общих потребностей в финансировании для данного набора experimЭнты. Тем не менее, это преимущество может быть перевешивают стоимости дополнительного судна, которое необходимо в дополнение к гомогенизатор , чтобы предотвратить введение шагов трюмных процесс , если несколько трасс добычи требуются в ряде экспериментов, например, в рамках DoE подход. Положительный эффект от емкости фильтра может также уменьшить, если более интенсивное смешивание режим используется для уменьшения времени нагрева, как было предложено выше.
Выделенный этап охлаждения необходим для обоих на основе экстракта методы осаждения тепла, что требует не только дополнительные ресурсы, но и продлевая общее время обработки каждого образца, который также может вступать в противоречие с беглый процедурами Doe или экспериментальных последовательностей в целом. Установка теплообменника хорошо характеризуется с инженерной точки зрения 35 и может быть легко разработаны и расширены для конкретных перепадов температур, в отличие от судна, поверхность которого к объему соотношение меняется в процессе расширения масштабов. Каккогда-либо, как только размер теплообменника определен, он может быть трудно приспособиться к альтернативным температурным перепадам, поскольку его длина и, следовательно, площадь теплопередачи фиксированы.
Изменение других параметров, таких как время удерживания (или расхода) и температуры теплообменника среды, может восстановить гибкость в некоторой степени, но только в небольших экспериментов, так как эти факторы, как правило, работают в узких окнах в процессе масштабных операций за с ограничениями, введенными имеющегося оборудования и средств массовой информации. Спрос на комбинации короткого времени инкубации в 3 - 5 мин и разности температур 40 - 60 ° С, становится все более и более трудно решить на уровне устройства, что и процесс масштаба возрастает, так как размеры теплообменника становятся больше. Это особенно верно для стадии охлаждения, так как разность температур между средой и желаемой температуры экстракта часто меньше (& Delta; t = 10-15 ° С)чем на стадии нагрева (t = 20-40 ° C), в результате больших размеров оборудования или более раз круто вниз.
В дальнейшем, этот протокол может быть адаптирован к другим, чем вакцин-кандидатов, которые в данном исследовании, были специально разработаны для термической стабильности биофармацевтических белков. Многие антитела могут выдерживать температуру> 70 ° C 36,37 , который уже совместим с текущим протоколом термообработки. Эта естественная термическая стабильность может быть увеличена в дальнейшем инженерными различные домены антител 38, тем самым увеличивая количество белков , которые могут быть подвергнуты методу (и его варианты) , представленной здесь. Метод бланширования уже применяется к трансгенных растений табака , экспрессирующих моноклональное антитело (2G12) 17 , которая не подлежала отбора тепловой устойчивости или белковой инженерии. Термическая обработка при 65 ° C увеличивали чистоту антитела на фактордва до хроматографической очистки в то время как восстановление было подобен наблюдаемому без бланшировки.
Кроме того, характеристика отдельных температур плавления HCP системы экспрессии может облегчить идентификацию температуры , с которой процесс может проводиться аналогично пастеризации молока: высокая температура, короткое время 39. Термическая обработка (за исключением бланширование) также могут быть применены к другим биологическим исходных веществ для удаления ВДС, если продукт может выдерживать необходимые температуры. Последнее может отклоняться от тех, которые обсуждались здесь, если другое выражение платформ, таких как надосадочной жидкости культуры клеток млекопитающих находятся в стадии обработки. В любом случае, затрат и выгод, соотношение должно быть принято во внимание, то есть, делает польза от снижения уровней HCP перевешивают затраты на реализацию стадии термообработки , что вызывает дополнительные инвестиционные затраты, увеличивает время процесса и может привести к снижению Yie продуктаЛД 16. Критическим параметром в данном контексте является активность этого продукта. Если это зависит от наличия линейных эпитопов , как для некоторых белковых вакцин на основе, то термообработка вряд ли будет иметь эффект 40. В противоположность этому , если структура белка имеет важное значение, например, для конформационных эпитопов, точная ориентация боковых цепей аминокислот в активном сайте ферменту или правильное складывание комплементарность антитела определения областей, термообработка может помешать активности белка 41,42. Таким образом, подходящие анализы анализа должны быть установлены для мониторинга производительности продукта до и после термообработки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
| Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
| Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
- PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
- Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
- Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
- Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
- Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
- Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940 (2016).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
- Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
- Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
- Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
- Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
- Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
- Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
- Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
- Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
- Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
- Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
- Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
- Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
- Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
- Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336 (2006).
- Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
- Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).
