Summary
Tre varme fældningsmetoder præsenteres som effektivt fjerner mere end 90% af værtscelleproteiner (HCPS) fra tobaksekstrakter forud for enhver anden oprensningstrin. Anlægget HCPS irreversibelt aggregerer ved temperaturer over 60 ° C.
Abstract
Planter ikke kun give fødevarer, foder og råvarer til mennesker, men er også blevet udviklet som et økonomisk system til biofarmaceutiske proteiner, såsom antistoffer, vaccinekandidater og enzymer produktion. Disse skal oprenses fra plantebiomassen men kromatografitrin hindres af de høje koncentrationer af værtscelleproteiner (HCPS) i planteekstrakter. Men de fleste HCPS irreversibelt aggregerer ved temperaturer over 60 ° C letter efterfølgende oprensning af målproteinet. Her er tre metoder præsenteres for at opnå den varme udfældning af tobak HCPS i enten intakte blade eller ekstrakter. Den blegning af intakte blade kan nemt indarbejdes i eksisterende processer, men kan have en negativ indvirkning på de efterfølgende filtrering trin. Det modsatte er tilfældet for varme udfældning af blade ekstrakter i en omrørt beholder, der kan forbedre ydeevnen af nedstrøms operationer omend med større ændringer i procesudstyr design, såsomhomogenisator geometri. Endelig er en varmeveksler setup godt karakteriseret i form af varmeoverførsel betingelser og let at skala, men rengøring kan være svært, og der kan være en negativ indvirkning på filter kapacitet. Udformningen-of-eksperimenter tilgang kan bruges til at identificere de mest relevante procesparametre påvirker HCP fjernelse og produkt opsving. Dette letter anvendelsen af hver metode i andre ekspressionssystemer platforme og identifikation af den mest egnede metode til en given oprensning strategi.
Introduction
Moderne sundhedssystemer i stigende afhængige af biofarmaceutiske proteiner 1. Producerer disse proteiner i planter er fordelagtig på grund af den lave patogen byrde og større skalerbarhed i forhold til konventionelle ekspressionssystemer 2-4. downstream (DSP) af planteafledte lægemidler kan imidlertid være udfordrende, fordi de forstyrrende ekstraktionsmetoder resulterer i en høj partikel byrde, med turbiditeter overstiger 5.000 nefelometrisk turbiditetsenheder (NTU'er), og værtscelleprotein (HCP) koncentrationer ofte overstiger 95 % [m / m] 5,6.
Udarbejde procedurer for præcisering er forpligtet til at fjerne spredte partikler 7-9, men kromatografi udstyr er billigere at operere i binde-og-elueringsmetode under indledende opsving produkt, hvis der er en tidligere trin til effektiv fjernelse af HCPS 10,11. Dette kan opnås enten ved udfældning målproteinet under anvendelse flocculmyrer 12 eller lav pH 13,14, samt ved at hjælpe HCPS at aggregere. Den selektive aggregering af ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase / oxygenase (RuBisCO), den mest udbredte HCP i grønne planter såsom tobak (Nicotiana tabacum), kan fremmes ved tilsætning af polyethylenglycol 15, men dette er dyrt og uforenelig med stor -skala produktion. Varmebehandling har vist sig at denaturere og bundfald mere end 95% af tobaksvarer HCPS, mens protein malaria vaccinekandidater såsom Vax8 forblive stabil i opløsning 16-18.
Tre forskellige fremgangsmåder blev anvendt til at opnå den varme-igangsat bundfældning af tobaksvarer HCPS: (i) blanchering, dvs. nedsænkning af intakte blade i varm væske, (ii) en temperaturreguleret omrørt beholder, og (iii) en varmeveksler ( Figur 1) 16. For intakte blade, blanchering opnås en hurtig og effektiv udfældning af HCPS og var også letat skalere op og forenelige med eksisterende store fremstillingsprocesser, der omfatter et første skridt til at vaske plantebiomassen 19. I modsætning hertil temperaturstyrede skibe er allerede tilgængelige i nogle processer, og kan bruges til termisk behandling af planteekstrakter 20, men deres skalerbarhed og energi overførselshastighed er begrænset, fordi overfladen-til-volumen-forhold af tankene nedsættes gradvis og bliver uegnet til proces skala. En varmeveksler er en teknisk veldefineret alternativ til opvarmet omrørte fartøjer, men kræver en rigelig forsyning af opvarmning og afkøling medier, fx damp og koldt vand, samt et tæt kontrolleret volumetriske strømningshastighed, der er indrettet til varmeveksleren geometri og medier egenskaber, f.eks., den specifikke varmekapacitet. Denne artikel viser, hvordan alle tre metoder kan anvendes til varmeinduceret udfældning af tobak HCPS og planteprodukter HCPS generelt. Etablering og drift af EACh metode i et laboratorium indstilling kan anvendes til at vurdere deres egnethed til større målestok processer. Den største udfordring er at identificere passende skala-down modeller og driftsforhold for hver operation, der ligner enheder og betingelser, der anvendes under processen skala produktion. De data, der præsenteres her refererer til eksperimenter udført med transgene tobaksplanter, der udtrykker malariavaccine kandidat Vax8 og fluorescerende protein DsRed 16, men metoden har også været anvendt med succes til N. benthamiana planter transient udtrykker andre biofarmaceutiske proteiner 21.
Et design-for-eksperimenter (DOE) nærmer 22 kan lette procesudvikling, og flokkuleringsmidler 23 kan også være en fordel i denne sammenhæng som tidligere beskrevet 8. Den væsentligste forskel mellem blanchering, opvarmede beholdere og varmevekslere er, at blanchering anvendes til intakte blade tidligt i processen hvorimod othendes anvendes på planteekstrakter (figur 1).
Figur 1:. Process Flow skema, der illustrerer gennemførelse af tre forskellige metoder til Tobacco HCP Heat Nedbør Plantematerialet vaskes og homogeniseres før afklaring og rensning. Udstyret til blancheringstrinnet (rød) kan let tilføjes til eksisterende maskineri. I modsætning hertil bruger en omrørt beholder (orange) og især en varmeveksler (blå) kræver en eller flere andre enheder og slanger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrk de tobaksplanter
- Skyl hvert mineraluld blok med 1 til 2 l deioniseret vand og derefter med 1 liter 0,1% [w / v] gødning opløsning. Placer en tobak frø i hver mineraluld blok og forsigtigt skylles med 0,25 liter gødning opløsning uden vask væk frøet 16.
- Dyrk de tobaksplanter i 7 uger i et drivhus med 70% relativ fugtighed, en 16 timer fotoperiode (180 pmol sek - 1 m - 2 λ = 400-700 nm) og en 25/22 ° C lys / mørke temperatur regime.
- Høst alle blade med undtagelse af de fire cotyledon blade, som er placeret i bunden af planten stilken.
2. Valgfrit: Heat Nedbør ved Blanchering
BEMÆRK: Udfør de trin, der er beskrevet i trin 2,1-2,12 for at udfælde tobak HCPS ved blanchering. Spring hele afsnittet 2, hvis HCPS vil blive udfældeti en opvarmet beholder (afsnit 4) eller ved hjælp af en varmeveksler (afsnit 5).
- Braklægning 50 g af plantemateriale og udføre ekstraktion uden blanchering (afsnit 3). Tag en prøve af denne ekstrakt som en intern kontrol under efterfølgende analyse (afsnit 7).
- Oprettet en 8-L arbejdsvolumen vandbad, f.eks 50 x 40 x 40 cm, i en termisk isoleret polystyrenskum spand eller lignende. Monter den justerbare termostat på vandbad til efterfølgende temperaturkontrol (trin 2.7).
- Overfør hele samlingen på en magnetomrører og placere en magnetisk omrører i vandbad. Sikre, at det magnetiske felt er stærkt nok til at rotere omrører.
- Surround røre bar med mindst fire support fliser, hvorpå en polypropylen kurv (trin 2.6) vil blive placeret senere under blanchering procedure. Sørge for, at støtteelementerne fliser er fremstillet af et ikke-magnetisk materiale (fx rustfrit stål legering, der indeholder nikkel), og at deer højere end omrører (figur 2).
- Tilsæt 8 l deioniseret vand til vandbad.
BEMÆRK:. Ved hjælp af en buffer, fx 50 mM natriumphosphat (pH 7,5), kan forbedre målproteinet udbytter hvis lav pH udfældning er et problem. - Placer en 23 x 23 x 23 cm polypropylen kurv på den støtte fliser og sørg for, at kurven ikke forstyrrer den omrører rotation, og at det er fuldt nedsænket i væsken. Om nødvendigt tilsættes ekstra vand / buffer, indtil kurven er helt nedsænket, og fjern kurven igen.
ADVARSEL: Alle efterfølgende trin op til 2,12 involverer håndtering af varm væske. Bær egnede personlige værnemidler, herunder termisk isolerede handsker. - Brug den justerbare termostat til at bringe vandbad til 70 ° C (eller den kræves til forsøgene temperatur). Vent mindst 15 minutter efter den ønskede temperatur er nået for at sikre hele konstruktionen har nået en Thermal ligevægt.
- Forbered 150 g portioner fra de høstede tobaksblade. Placer en alikvot i kurven og samtidig undgå irreversibel komprimering og beskadigelse af bladene, f.eks, ved rivning. Undgå at overfylde kurv med plantemateriale eller en tæt pakning af sidstnævnte.
- Forsigtigt men hurtigt nedsænkes kurven i den varme væske og placere den på den støtte fliser. Placer en rustfri stål blok oven på kurven for at forhindre flotation.
- Inkubér blade til 5 min i blanchering væske, eller vælg et tidspunkt der passer den eksperimentelle design. Overvåg væsketemperaturen under hele inkubationsperioden.
- Fjern forsigtigt kurven fra blanchering væske og lad resterende væske afløb fra bladene i 30 sek. Så kan planten blade ud af kurven, overføre dem til blenderen og straks begynde udvindingen (afsnit 3).
BEMÆRK: Planter kan opbevares i længere tidsperioder efter blanchering og før starten af the ekstraktion, fx mere end 30 min på is eller nedfryses ved -20 ° C i flere uger er blevet testet med succes. Dog kan produktet stabilitet falde med stigende opbevaringstid og anbefales derfor øjeblikkelig behandling. - Gentag trin 2.8 til 2.11 med frisk bladmateriale indtil hele høstede biomasse behandles.
3. Protein Udsugning fra tobaksblade
ADVARSEL: De næste trin indebærer en blender med roterende knive. Arbejd ikke i blenderen spanden mens den er monteret på blenderen motor.
- Placer 150 g (våd masse) høstes (trin 1.3) eller blancheret (trin 2.11) blade i blenderen, og der tilsættes 450 ml ekstraktionsbuffer (50 mM natriumphosphat, 500 mM natriumchlorid, 10 mM natriumdisulfit, pH 8,0).
BEMÆRK: ekstraktionspuffer sammensætning afhænger af proteinet, der skal ekstraheres, og kan således kræve justering blandt andet anvendelse af en anden pH eller puffer komponent, såsom Trer. - Homogeniseres bladene i 3 x 30 sek pulser med 30 sek spækket pauser. Sørg for, at bladene er homogeniseret og ikke tilstoppe blenderen spand. Stop blenderen og løft bladene for at forhindre tilstopning om nødvendigt, og derefter fortsætte homogeniseringen.
- Tag en 1 ml prøve af hver ekstrakt, der er fremstillet til efterfølgende analyse (afsnit 7). Hvis plantematerialet er blancheret, fortsat afsnit 6. Ellers fortsætte med varme nedbør i en beholder (afsnit 4) eller varmeveksler (afsnit 5), afhængig af den valgte eksperimentelle tilgang.
4. Valgfrit: Heat Nedbør i en Stirred Vessel
BEMÆRK: Udfør de trin, der er beskrevet i afsnit 4.2 til 4.11 for at udfælde tobak HCPS i en omrørt beholder. Spring hele afsnit 4, hvis HCPS er udfældet ved blanchering (afsnit 2) eller vil blive udfældet ved hjælp af en varmeveksler (afsnit 5).
- Opsæt to 8-L arbejdsvolumen vandbade, fx 50 x 40 x 40 cm, i termisk isoleret polystyren skum eller lignende. I det første bad, montere justerbare termostat til efterfølgende temperaturkontrol (trin 4.6). I den anden, tilsættes 5 l deioniseret vand og 2 kg is for efterfølgende afkøling (trin 4.9).
- Overfør den første vandbad på en magnetomrører, og placer 2-L rustfri stålbeholder i vandbadet, så at midten af fartøjet er rettet ind til centrum af den omrørerplade.
- Placer en magnetisk omrører i rustfrit stålbeholder. Sikre, at det magnetiske felt er stærkt nok til at rotere omrører.
- Fyld vandbadet med deioniseret vand til 5 cm under den øvre kant af rustfri stålbeholder. Så fylder karret med ekstraktionsbuffer. Placer en polystyrenskum låg på beholderen.
ADVARSEL: Alle efterfølgende trin op til 4,9 involverer håndtering af varm væske. Bær egnede personlige værnemidler, herunder termisk insulated handsker. - Sæt et termometer i rustfri stålbeholder gennem et suiting hul i låget af polystyrenskum. Indstil vandbadstemperatur til 78 ° C og inkuberes hele samlingen i 15 minutter at nå termisk ligevægt. Sikre, at temperaturen i beholderen er 70 ° C, ca. 8 ° C under den indstillede punkt i vandbad.
- Hvis temperaturen i beholderen af rustfrit stål adskiller sig fra 70 ° C, justere temperaturen af vandbadet i overensstemmelse hermed og lade systemet i ligevægt i yderligere 15 minutter. Gentag dette trin, indtil temperaturen i beholderen er 70 ° C eller som kræves til eksperimentet, og tøm beholder af rustfrit stål.
- Hæld 300 ml ekstrakt (trin 3.2) i rustfrit stålbeholder mens det stadig er i vandbad og starte en timer. Omrør ekstrakten ved 150 rpm og inkuberes i 5 min. Sikre at ekstraktet når en temperatur på 70 ° C i mindst 2 minutter i løbet af denne inkubationsperiode.
- Tag varmt vandbad fra magnetomrører, tegne fartøj rustfrit stål og placere den i det iskolde spand. Placer sidstnævnte på magnetomrører og fjern låget polystyrenskum.
- Sikre, at anlægget homogenatet er godt omrørt ved 150 rpm, placere termometret i ekstraktet og inkuberes, indtil den når en temperatur på 20 ° C eller temperaturen angivet af eksperimentelle design.
- Gentag trin 4.7 til 4.9 alle alikvoter. Tag en 1 ml prøve af hver varme udfældet ekstrakt, når den har nået den endelige temperatur, derefter fortsætte med § 6.
5. Valgfrit: Heat Nedbør i en varmeveksler
BEMÆRK: Udfør de trin, der er beskrevet i afsnit 5.2 til 5.12 for at udfælde tobak HCPS ved hjælp af en varmeveksler. Spring hele afsnit 5, hvis HCPS er udfældet ved blanchering (afsnit 2), eller i en opvarmet beholder (afsnit 4).
- Opsæt to 8-L arbejdsvolumenvandbade, fx 50 x 40 x 40 cm, i termisk isolerede polystyren skum spande eller lignende. I det første bad, montere justerbare termostat til efterfølgende temperaturkontrol (trin 5.3). I den anden, tilsættes 5 l deioniseret vand og 2 kg is for efterfølgende afkøling (trin 5.10).
ADVARSEL: Alle efterfølgende trin op til 5,9 involverer håndtering af varm væske. Bær egnede personlige værnemidler, herunder termisk isolerede handsker. - Fyld første vandbad med 8 I deioniseret vand. Indstil temperaturen til 74,5 ° C ved anvendelse af termostaten. Inkubér samlingen i 15 minutter at nå termisk ligevægt.
- Forbered en isoleret lagertank ved at placere en 0,5-L plastbæger i en 1-L plastbæger og udfylde hullerne med vat. Alternativt kan du bruge en dedikeret varmeisoleret beholder med en 0,5-L arbejdsvolumen.
- Slut varmeveksleren til den peristaltiske pumpe ved den ene ende og til en afløbsslange på other ende at bruge L / S 24 slange. Placer begge slangeenderne sammen med et termometer i det isolerede opbevaringsbeholder og fyld den med 300 ml ekstraktionsbuffer (figur 2).
- Placer varmeveksleren i det varme vandbad og starte den peristaltiske pumpe ved en hastighed på 300 ml min-1. Sikre, at den resulterende temperatur i beholderen er 70 ° C, ca. 4,5 ° C under den indstillede værdi på vandbadet, efter 3 min.
- Hvis temperaturen i den isolerede kar afviger fra 70 ° C, justere temperaturen af vandbadet i overensstemmelse hermed og lade systemet i ligevægt i yderligere 15 minutter. Gentag dette trin, indtil temperaturen i udvinding buffer stiger fra omgivelsestemperatur til 70 ° C på mindre end 3 min, eller lig, der kræves for eksperimentet, og tøm rustfrit stål fartøj.
- Kassér ekstraktionsbuffer fra den isolerede beholder og forberede 300-ml alikvoter af planteekstraktet. Fyld den isolerede beholder med en aliquot.
- Pump planteekstraktet (afsnit 3.3) gennem varmeveksleren ved 300 ml min -1 i 5 min. Sikre, at udsugningstemperaturen er 70 ° C efter 3 min, eller lig med temperaturen defineret i det eksperimentelle design.
- Efter 5 minutter placere varmeveksleren ind i iskoldt vandbad, mens ekstrakten stadig bliver pumpet. Inkuber i denne indstilling, indtil temperaturen når nøjagtigt 20 ° C, eller temperaturen er defineret i det eksperimentelle design.
- Fjern indløbsslangen tilsluttet den peristaltiske pumpe fra den isolerede beholder og fortsætte pumpning at indsamle restvarme-præcipiteret planteekstrakt inde fra varmeveksleren. Derefter stopper pumpen.
- Gentag trin 5.7 til 5.10 for alle alikvoter. Tag en 1-ml prøve af hvert heat-udfældet ekstrakt, når den har nået den endelige temperatur, derefter videregive ekstrakterne til pose filtrering (afsnit 6).
BEMÆRK: Efter en første cyklus gennem trin 5,7-5,10 der vil være nogen udvinding buffer tilskille i trin 5.7.
6. Bag Filtrering af planteekstrakt
- Montere et posefilter til den tilsvarende støtte kurv, som er monteret ind i filterhuset og tilvejebringer mekanisk støtte til det fleksible filtermateriale. Placer en 1-L beholder under kurven og anvende ekstrakt portioner (afsnit 3.3, 4.10 eller 5.11 afhængig af den valgte varmebehandlingen) til posen med en hastighed på 150 ml min-1.
- Efter filtrering, måle turbiditeten af en 1:10 fortynding af filtratet i ekstraktionsbuffer hjælp turbidimeteret.
- Tag en 1 ml prøve og behandle posen filtrat som defineret i det eksperimentelle design, f.eks dybdefiltrering og kromatografi 7,10.
7. Prøve Analysis
- Måle mængden af totalt opløseligt protein (TSP) under anvendelse af Bradford-metoden 24,25.
- I tre eksemplarer, pipette 2,5 pi af hver prøve i de enkelte brønde i en96-brønds plade. Omfatter otte bovint serumalbumin (BSA) standarder i tre eksemplarer, der dækker intervallet 0 - 2.000 ug ml-1.
- Tilsæt 200 pi Bradford reagens til hvert hul og blandes grundigt ved pipettering op og ned, men forsigtigt nok til at undgå at danne bobler.
- Inkuber i 10 minutter ved 22 ° C, og absorbansen måles ved 595 nm i et spektrofotometer. Beregn koncentrationen TSP i prøverne er baseret på en standard kurve gennem BSA referencepunkter.
- Kvantificere Vax8 ved overfladeplasmonresonans spektroskopi 26.
- Setup overfladeplasmonresonans instrument med 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) løbebuffer (10 mM HEPES, 3 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 1.500 mM natriumchlorid, 0,05% v / v polysorbat 20, pH 7,4) og montere en carboxymethyleret dextran overflade chip i enheden. Brug primære funktion at skylle systemet og starte en manuel kørsel med et flow på 30pi min -1 løbet flowceller 1 og 2. Injicer 30 mM hydrogenchlorid to gange i 60 sekunder med en 60 sek afbrudt injektion af 25 mM natriumhydroxid.
- Forbered 200 pi af en 500 ug ml -1 mAb 5.2 opløsning i 10 mM natriumacetat (pH 4,0). Tø 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid-hydrochlorid (EDC) og N-hydroxysuccinimid (NHS) hætteglas og centrifugere dem ved 16.000 x g i 1 min. Bland 70 ul EDC med 70 ul NHS og overføre til et hætteglas plast 7-mm.
- Aktivere carboxymethyleret dextran overflade chip overflade ved injektion af EDC / NHS blandingen over flowceller 1 og 2 i 10 minutter med en strømningshastighed på 10 pi min-1.
- Indstil strømningsvejen at strømme kun celle 2. Couple mAb 5.2 ved at injicere det i 15 minutter ved en hastighed på 10 pi min-1.
- Switch strømningsvejen at flyde cellerne 1 og 2 og injicere ethanolamin i 7 min med en hastighed på 5 pi min -1 for at deaktivere overfladen. Thøne injicere 30 mM hydrogenchlorid to gange i 60 sekunder med en 60 sek afbrudt injektion af 25 mM natriumhydroxid.
- Injicer prøver og MSP1 - 19 standarder med en hastighed på 30 pi min -1 for 180 sek. Sørg for, at Vax8 koncentrationen er 50 - 1000 ng ml -1. Forbered pre-fortyndinger i HEPES-bufret saltvand indeholdende EDTA og polysorbat 20 (HBSEP) om nødvendigt.
- Fratræk spidssignalet af flowcellen 1 fra den for flow celle 2 og anvende forskellen at beregne koncentrationen Vax8 i prøver baseret på signalet fra MSP 1 - 19 ud injektion med en kendt proteinkoncentration på 500 ng ml-1.
- Regenerere chippen overflade efter hver prøve eller MSP 1 - 19 ud injektion ved udsættelse for 30 mM hydrogenchlorid i 60 sekunder ved en strømningshastighed på 30 pi min-1.
- Kvantificere dsRed ved fluorescens spektrometri
- I tre eksemplarer, pipette 50 pi af hver prøve til de enkelte brønde i en sort halv-arEA 96-brønds plade. Medtag seks dsRed standarder, der dækker området 0 - 225 pg ml -1.
- Mål fluorescens in duplo under anvendelse af et 530 ± 30 nm excitation filter og en 590 ± 35 nm emission filter i et spektrofotometer. Beregn koncentrationen DsRed i prøverne er baseret på en standard kurve gennem dsRed referencepunkter.
- Bestemmelse af partikelstørrelsesfordelinger
- Vaske en kuvette med 1 ml isopropanol og derefter med 2 ml deioniseret vand for at fjerne støvpartikler. Pipette 850 pi af prøven i kuvetten.
- Anbring kuvetten i zeta-potentialet og partikelstørrelsesanalysator. Åbn "Software", og start en manuel måling med "Protein" som materiale og "PBS" som dispergeringsmiddel. Vælg en temperatur på 25 ° C og en ækvilibreringstid på 180 sek.
- Vælg "DTS0012" celle og foranstaltning 173 ° tilbagekastning. Check "auto" funktion til måling varighed og vælg tre målinger uden afbrudt forsinkelse.
- Undersøg partikelstørrelsesfordelingen peak fordelingsprofil når målingen er færdig ved at vælge tre målinger af prøven i eksperimentet visning. Vælg fanebladet "Volume PSD".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Heat udfældning af tobak værtscelleproteiner ved blanchering
Fremgangsmåden beskrevet i afsnit 2. blanchering fremgangsmåde blev med held anvendt til udfældning HCPS fra tobaksblade med 70 ° C, hvilket reducerer TSP ved 96 ± 1% (n = 3), mens overvinde op til 51% af den Vax8 målproteinet, hvilket øger dens renhed fra 0,1% til 1,2% før kromatografisk separation 16. Det var også muligt at genvinde 83 ± 1% (n = 3) af det fluorescerende protein DsRed, øge dets renhed fra 3,3% til 64,1%. Den blanchering procedure blev let integreres i et standard ekstraktion og afklaring ordningen består af biomasse vask, homogenisering, posefiltrering og dybdefiltrering (figur 1) 7. Forberedelse af blanchering udstyr (figur 2) tilføjede omkring 5 min til set-up tid for afklarende enheder, der rutinemæssigt tager 20 min. En anden 7 min var forpligtet til at udføreblancheringen af intakte blade ud over den typiske ekstraktion og afklaring på cirka 45 minutter. Men kun to minutter af den yderligere 7 min var egentlige "hands-on" tid. Derudover korte inkubationstider på mindre end 1 min er mulige, hvilket reducerer blanchering tid fra 7 min til ca. 3 min. Derfor blanchering ikke kun øger den indledende renhed af et produkt i rå planteekstrakter, men også hurtigt afsluttet uden yderligere procesudstyr, hvilket giver potentiale til at erstatte mindst en første kromatografitrin. Den blanchering badtemperatur forblev konstant, dvs. <0,2 ° C udsving, under alle forsøg, selv umiddelbart efter tilsætningen af høstede blade, som var ved omgivelsestemperatur. Dette sikrede processen var reproducerbar, dvs., en gennemsnitlig variationskoefficient på 17% (n = 24), i form af TSP reduktion, produktudbytter og filter kapacitet i de efterfølgende præcisering trin (figur 3 8 og filter hjælpemidler efter pose filtrering 9, som kan genskabe eller endda øge filter kapacitet. En temperatur på 60 ° C var tilstrækkelig til at fjerne 80 ± 3% (n = 3) af HCPS og øge Vax8 renhed 2,6 ± 0,1-fold (n = 3) uden at påvirke filter kapacitet. Derfor HCP fjernelse ved blanchering er forenelig med målproteiner, der har moderat varme stabilitet, dvs. en smeltetemperatur på under 70 ° C 27,28. Forøgelse af temperaturen til 70 ° C eller mere, kan dog resultere i en HCP fjernelse af over 95% (figur 3). Det var nyttigt at udføre den tilsvarende sæt eksperimenter i en veldesignet måde ved hjælp af en statistisk metode 22, fordi dette tillod hurtig identifikation af de mest rElevant parametre proces, dvs., varme tid og temperatur. På samme tid, DoE metode genereres en prædiktiv model til at lette procesoptimering 16.
Figur 2: Skematisk opsætning af tre metoder til fældning Tobacco HCPS i intakte blade eller ekstrakter heraf A. Blanchering blev udført i et vandbad opvarmet med en termostat (T), i hvilken en kurv med intakte blade blev oversvømmet.. Vandbadet blev omrørt for at sikre en homogen og konstant temperatur. B. En beholder indeholdende en magnetisk omrørerstav og blade ekstrakt blev nedsænket i et vandbad. Temperaturen i ekstrakten blev overvåget for at sikre, at den ønskede temperatur er opnået. C. En varmeveksler (H) blev forbundet til en pumpe (P) og et varmeisoleret opbevare beholder indeholdende planteekstraktet. Varmeveksleren blev nedsænket i et vandbad, og temperaturen af den opvarmede ekstrakt blev overvåget. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenligning af tre Heat Nedbør Metoder Viser deres effekt på Process Performance og Oprensning af to Target Proteiner A.. Betingelser understøtter fjernelsen af mere end 90% af HCPS blev identificeret for blanchering, en omrørt beholder og en varmeveksler setup, som alle forøgede renheden af målproteinerne Vax8 og dsRed med mindst 2,5 gange og højst 19 fold, med blanchering klarer sig bedst. I modsætning hertil kun den omrørte setup fartøj øget kapacitet subseqgelige dybdefiltreringstrin bruges til afklaring af de varmebehandlede planter eller ekstrakter. Fejl søjler indikerer standardafvigelsen (n = 3). B. Indholdet HCP af prøver efter forskellige varmebehandlingsbetingelserne kan analyseres og sammenlignes ved anvendelse af Coomassie-farvede polyacrylamidgeler. RuBisCO (grønne pile) fjernes sammen med andre HCPS som temperaturen under varmebehandling stiger, hvorimod DsRed (rød pil) forbliver i opløsning. * Viser en prøver, der blev udsat for varme i 0,5 minutter blev alle prøver behandlet i 3,0 min eller mere. Re-print med tilladelse fra 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Heat udfældning af HCPS i en omrørt beholder
En omrørt beholder til varme nedbør fjernet maksimalt 84 ± 1% (n = 3) HCPS, opnå en renhed of 0,33 ± 0,02% (n = 3) for Vax8 og 20,2 ± 1,4% (n = 3) for DsRed (figur 3). Varmebehandlingen blev udført i et fartøj adskilt fra homogenisatoren for at forhindre forsinkelser afspejler enhedens belægning ved behandling af flere prøver i serie. Håndteringsdelen indsats, der kræves for laboratorieskala proces var den samme som for blanchering men en yderligere rustfri stålbeholder og en dedikeret afkølingstrin var påkrævet. Endvidere varmeoverførsel til ekstrakten var langsommere end under blanchering, med inkubationstider på mindst 5 min, dvs., 10 gange længere end for blanchering. Den forsinkede opvarmning var forårsaget af fartøjet, som udgjorde en yderligere hindring for varmeoverførsel, og ~ 300% større masse, der blev opvarmet i beholderen på grund af tilstedeværelsen af ekstraktionsbuffer foruden plantebiomassen. Fældning af proteiner også klæbet til væggene i skibet, efterhånden opbygge en ekstra varmeoverførsel barriere og øge indsatsenpåkrævet for efterfølgende rengøring. Indstilling af vandbadstemperatur 8 ° C over den temperatur, der anvendes til varme- udfældning kompenseres for energitab i den delvist åbne system og opnået den ønskede ekstrakt temperatur. I modsætning til blanchering (afsnit 2) og varmeveksleren setup (afsnit 5), HCP nedbør i en beholder øget kapaciteten af downstream dybde filtrering med 2,5 gange, hvilket afspejler de lavere stejle kræfter i karret i forhold til at pumpe ekstrakt gennem varmen veksleren eller homogenisering efter blanchering, formentlig resulterer i større aggregater, der var lettere at fjerne i posen filtreringen.
Heat udfældning af HCPS i en varmeveksler
Ca. 88,3 ± 0,7% (n = 12) af HCP indhold blev konsekvent fjernes fra ekstraktet ved hjælp af en varmeveksler i temperaturområdet fra 60 - 70 ° C, opnås en renhed på 0,31 ± 0,01% (n = 12) til Vax8 og 27.6 ± 2,0% (n = 12) til DsRed (figur 3). Den gennemsnitlige variationskoefficient var 13% (n = 24), hvilket indikerer, at repeterbarhed af denne procedure var endnu bedre end blanchering. Den ønskede ekstrakt temperatur blev opnået efter ~ 3 min, hvis vandbadet blev sat 4,5 ° C højere. Som for opvarmet beholder blev en dedikeret køletrin kræves efter varmebehandling. Varmeveksleren er involveret mere håndtering indsats end de andre metoder, fordi det pumpeindretning og varmeveksler kræves intensiv rengøring på grund af bundfaldet klæber til væggene i den smalle udboring rustfrit stålrør. Varmeveksleren opnåede også det laveste downstream dybde filter kapacitet, afklaring kun 13,5 ± 6,0 (n = 3) F m -2 før tilstopning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tre metoder til varme nedbør beskrevet ovenfor effektivt kan fjerne tobak HCPS før enhver kromatografisk oprensning trin 16,17. De supplerer andre strategier, der tager sigte på at øge oprindelige produkt renhed, f.eks guttation 29, rhizosecretion 30 eller centrifugal udvinding 31,32, som alle er begrænset til udskilte proteiner. Imidlertid kan varme-baserede metoder kun anvendes på en meningsfuld måde, hvis målproteinet der skal oprenses kan modstå den minimale nedbør temperatur på ~ 60 ° C i mere end 1 min. Derfor er det første trin i enhver af de tre metoder er at designe et målmolekyle med en tilstrækkelig høj smeltetemperatur, som er blevet beskrevet i adskillige malaria vaccinekandidat proteiner bestående af forskellige domæner fra flere Plasmodium falciparum antigener 16,18,21. Når den termiske stabilitet af target-protein er blevet påvist, enaf de tre metoder kan vælges baseret på tilgængelige udstyr og medier, forventede endelige proces skala og efterfølgende DSP operationer 16.
Blanchering var den hurtigste af de metoder, og yderligere krav til udstyr var minimal, så det let kan implementeres i eksisterende laboratorie-skala rensning protokoller for plante-afledte rekombinante proteiner. Grundig opblanding af blanchering væske er en vigtig proces parameter, som påvirker effektiviteten af HCP udfældning baseret på både empiriske data og teoretiske beregninger 21,33. Undlade at opnå god blanding kan forringe varmeoverførsel og resultat i kun delvis HCP fjernelse, som igen kan være til skade for produktet, hvis værtsproteaser forbliver aktive 21,34. Flere andre parametre kan også påvirke HCP udfældning, f.eks opvarmningstemperaturen og inkuberingstiden, og en doe tilgang kan derfor være nyttigt at karakterisere det mest relevante factors og giver prædiktive modeller til at kvantificere deres virkninger på reaktioner såsom produkt renhed, nyttiggørelse og udførelsen af efterfølgende DSP trin 22.
I opsætningen fartøj, blev længere inkuberingstider der kræves for at opnå fuldstændig HCP nedbør og det kan øge sandsynligheden for uønskede target proteindenaturering afspejler den udvidede eksponering for høje temperaturer. Mere grundig blanding i beholderen kunne forbedre varmeoverførsel og reducere varigheden af opvarmningen. Den lange temperatur rampe i dette setup kan også være en udfordring, hvis proteaser i ekstraktet 21,34 blive mere aktive inden endelig varmeinaktivering, der forårsager tab produkt.
Den øgede dybde filter kapacitet observeret for opsætningen fartøj kan bidrage til at reducere hjælpematerialer omkostninger, giver et større antal prøver, der skal håndteres i et projekt med et fast budget eller reducere de samlede finansieringsbehov for et givet sæt af experimenser. Dog kan denne fordel opvejes af omkostningerne ved den ekstra beholder, som er nødvendig foruden homogenisatoren at forhindre indførelsen af processen hold trin, hvis flere udvinding kørsler er påkrævet i en række eksperimenter, fx som en del af en DoE nærme sig. Den positive effekt på filter kapacitet kan også mindske, hvis en mere intensiv blanding regime bruges til at reducere varme gange som foreslået ovenfor.
En dedikeret køling trin er nødvendigt for både ekstrakt-baserede varme nedbør metoder, der kræver ikke kun yderligere ressourcer, men også forlænge den samlede behandlingstid per prøve, som også kan være i konflikt med flydende ministeriets procedurer eller eksperimentelle sekvenser i almindelighed. Varmeveksleren setup er velkarakteriseret fra en ingeniør perspektiv 35 og kan let konstrueres og skaleres op til specifikke temperaturforskelle, i modsætning til beholderen, hvis overflade-til-volumen-forhold ændrer sig under opskalering. Hvordannogensinde, når varmeveksleren størrelse er defineret, kan det være vanskeligt at tilpasse til alternative temperaturforskelle fordi dens længde og dermed varmeoverførselsarealet er faste.
Ændring (eller flow rate) andre parametre, såsom opholdstiden og temperatur af varmeveksleren medium, kan genoprette fleksibilitet til en vis grad, men kun i små eksperimenter, fordi disse faktorer er typisk drives i smalle vinduer i processen stordrift grund restriktioner pålagt af tilgængelige udstyr og medier. Kravet om en kombination af korte inkuberingstider på 3 - 5 minutter og en temperaturforskel på i 40 - 60 ° C bliver vanskeligere at løse på komponentniveau som den proces målestoksforhold op, fordi dimensionerne af varmeveksleren bliver større. Dette gælder især for afkølingstrinnet fordi temperaturforskellen mellem mediet og ønskede ekstrakt temperatur er ofte mindre (AT = 10-15 ° C)end opvarmningstrinnet (AT = 20-40 ° C), hvilket resulterer i store udstyr dimensioner eller længere cool-down gange.
I fremtiden kan protokollen tilpasses andre end vaccinekandidater der i denne undersøgelse blev specielt designet til termisk stabilitet biofarmaceutiske proteiner. Mange antistoffer kan modstå temperaturer på> 70 ° C 36,37, som allerede kompatibel med den aktuelle varmebehandling protokol. Denne naturlige termiske stabilitet kan øges yderligere ved at manipulere de forskellige antistofdomæner 38 og dermed øge antallet af proteiner, som kan underkastes fremgangsmåden (og dens variationer) præsenteres her. Den blanchering Metoden er allerede blevet anvendt på transgene tobaksplanter, der udtrykker et monoklonalt antistof (2G12) 17, som ikke har været genstand for udvælgelse til termisk stabilitet eller protein engineering. Varmebehandling ved 65 ° C forøgede renheden af antistoffet med en faktorto før kromatografisk oprensning, mens opsvinget svarede til observeret uden blanchering.
Derudover karakterisere de enkelte HCP smeltende temperaturer et udtryk system kan lette identifikationen af en temperatur, som processen kan gennemføres ligner pasteurisering af mælk: høj temperatur, kort tid 39. Varmebehandlingen (bortset blanchering) kan også anvendes på andre biologiske udgangsmaterialer til fjernelse HCPS hvis produktet kan modstå de nødvendige temperaturer. Sidstnævnte kan afvige fra dem, der diskuteres her, hvis andre udtryk platforme såsom pattedyr cellekultursupernatanter bliver behandlet. Under alle omstændigheder skal der tages cost-benefit-forholdet i betragtning, dvs. gør gavn af reducerede HCP niveauer opvejer omkostningerne til gennemførelse varmebehandling, der forårsager ekstra investeringsomkostninger, øger procestiden og kan reducere produktets Yield 16. En kritisk parameter i denne sammenhæng er produktet aktivitet. Hvis det afhænger af tilstedeværelsen af lineære epitoper som for nogle protein-baserede vacciner, så varmebehandling er usandsynligt, at have en effekt 40. Hvis derimod proteinstruktur er vigtigt, fx for konformationelle epitoper, den præcise orientering af aminosyresidekæder i et enzyms aktive sted eller den korrekte foldning af antistof komplementaritetsbestemmende regioner, en varmebehandling kan forstyrre proteinaktivitet 41,42. Derfor bør der etableres passende analyse analyser til at overvåge produkternes ydeevne før og efter varmebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
| Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
| Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
- PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
- Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
- Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
- Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
- Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
- Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940 (2016).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
- Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
- Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
- Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
- Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
- Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
- Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
- Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
- Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
- Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
- Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
- Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
- Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
- Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
- Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336 (2006).
- Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
- Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).
