Summary
etkili bir tütün konakçı hücre proteinleri (HCp'ler) arasında% 90'dan daha fazla kaldırma çöktürme yöntemler sunulmuştur üç ısı başka saflaştırma aşamasından önce ayıklar. Bitki HCp'ler tersinmez 60 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklarda bir araya getirir.
Abstract
Bitkiler insanlar için yiyecek, yem ve hammadde sağlamak değil, aynı zamanda bu antikorların, aşı adayları ve enzimler gibi biyofarmasötik proteinler, ekonomik bir üretim sistemi olarak geliştirilmiştir değil sadece. Bu bitki biyokütlesinin saflaştırılması gerekir, ancak kromatografi aşamaları, bitki ekstrelerinde konakçı hücre proteinleri (HCp'ler) yüksek konsantrasyonlarda girmesi engellenir. Bununla birlikte, çoğu HCp'ler geri dönüşü olmayan hedef proteinin daha sonraki saflaştırmayı kolaylaştıran 60 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklarda bir araya getirir. Burada, üç yöntem sağlam yapraklar ya da özleri ya tütün CYp'lerine ısı yağış elde etmek için sunulmuştur. bozulmamış yaprakların blanching kolayca mevcut süreçlere dahil edilebilir ancak sonraki filtrasyon adımlar üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir. tersi gibi proses ekipman tasarımı büyük değişiklikler ile de olsa alt işlemleri performansını artırmak, karıştırılan kap içinde, yaprak ekstreleri ısı çökeltilmesi için de geçerlidirhomojenleştirici geometrisi. Son olarak, bir ısı değiştirici kurulumu iyi ısı transfer koşulları açısından karakterize ve ölçek kolay, ama temizlik zor olabilir ve filtre kapasitesi üzerinde olumsuz bir etki olabilir edilir. Tasarım-of-deneyler yaklaşımı HCP kaldırma ve ürün kurtarma etkileyen en uygun proses parametrelerini belirlemek için kullanılabilir. Bu, diğer sentezleme platformlarda her yöntemi ve belirli bir saflaştırma stratejisi için en uygun yöntem tanımlanması uygulamayı kolaylaştırır.
Introduction
Modern sağlık sistemleri giderek biofarmasötik proteinler 1 bağlıdır. Bitkilerde bu proteinlerin üretilmesi bilinen ekspresyon sistemleri 2-4 ile karşılaştırıldığında, düşük patojen yükü ve ölçeklenebilirlik avantajlıdır. yıkıcı çıkarma prosedürleri bulanıklıkları 5000 nefelometrik bulanıklık üniteleri (NTU) aşan ve konak hücre proteini (HCP) konsantrasyonları genellikle 95 aşan, yüksek parçacık yükü neden Ancak, bitkisel kökenli ilaçların aşağı işleme (DSP) zor olabilir % [m / m] 5,6.
Ayrıntılı açıklama prosedürleri dağınık parçacıklar 7-9 kaldırmak için gerekli, ancak kromatografi cihazı CYp'lerine 10,11 verimli çıkarılması için önceki bir adım varsa, ilk ürün kurtarma sırasında bağlama-ve-uzaklaştırma modunda çalışmaya daha pahalıdır vardır. Bu floccul kullanılarak hedef protein çökeltme yoluyla elde edilebilirkarıncalar 12 ya da düşük pH 13,14 yanı sıra HCp'ler araya neden olarak. Ribuloz-1,5-bisfosfat karboksilaz / oksijenaz (RUBISCO), tütün (Nicotiana tabacum), yeşil bitkilerde en bol HCP, seçici çekiş polietilen glikol 15 eklenmesi ile geliştirilebilir, ancak bu, pahalı ve geniş ile uyumsuz olabilir ölçeğindeki üretim. Isıl işlem örneğin Vax8 protein sıtma aşısı adayları çözelti 16-18 kararlı kalırken, denatüre ve tütün CYp'lerine fazla% 95 çökeltilmesi için gösterilmiştir.
Sıcaklık kontrollü bir kap karıştırılır (ii) (i) beyazlatma, örneğin, sıcak sıvı içinde sağlam yaprak daldırma, ve (iii) bir ısı eşanjörü (: Üç farklı yaklaşımlar, tütün CYp'lerine ısı kaynaklı çökelmesini elde etmek için kullanıldı Şekil 1) 16. sağlam yaprakları, CYp'lerine hızlı ve verimli yağış elde etti ve aynı zamanda kolay gerçekleştirilen ağartmabüyütmek ve bitki biyokütlesi 19 yıkamak için bir başlangıç aşamasını içerir mevcut büyük ölçekli üretim süreçleri ile uyumlu için. Bunun aksine, sıcaklık kontrollü DAMARLARIN bazı proseslerde kullanılabilir ve tank yüzey-hacim oranı, giderek azalır, çünkü bitkinin ısıl işlem 20 özler, ancak ölçeklenebilirlik ve enerji transferi hızı sınırlıdır için kullanılabilir ve süreç ölçeğinde uygun hale gelir. Bir ısı değiştirici de karıştırma kazanları ısıtıldı için teknik olarak iyi tanımlanmış bir alternatiftir ancak ısıtma ve soğutma ortamı, örn, buhar ve soğuk su bol miktarda bir kaynağı gibi ısı değiştirici geometrisine adapte edilmiş bir sıkı bir şekilde kontrol hacimsel akış hızı gerektirir medya özellikleri, örneğin., özgül ısı kapasitesi. Bu makalede, tüm üç yöntem, genel olarak, tütün CYp'lerine ve bitki CYp'lerine ısı kaynaklı çökeltme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. kurulması ve EAC operasyonbir laboratuvar ortamında H yöntemi büyük ölçekli işlemler için uygunluklarını değerlendirmek için de kullanılabilir. büyük bir sorun süreci ölçekli üretim sırasında kullanılan cihazlar ve şartları andırır her işlem için yeterli ölçek aşağı modelleri ve çalışan koşullarını tespit etmektir. Burada sunulan veriler DsRed 16 sıtma aşısı adayı Vax8 floresan proteini ifade eden transgenik tütün bitkileri ile yapılan deneyler bakınız, ancak yöntem de başarılı N'ye uygulanmış benthamiana bitkiler geçici diğer biofarmasötik proteinleri 21 dile getirdi.
Bir tasarım-of-deneyler (DoE) işlem gelişimini kolaylaştırabilir 22 yaklaşım ve daha önce 8 açıklandığı gibi 23 de bu bağlamda yararlı olabilir flokülantlar. , Haşlama ısıtmalı kap ve eşanjör arasındaki temel fark bu beyazlaşma ot ise sürecin başlarında sağlam yapraklara uygulanan bironun bitki ekstreleri (Şekil 1) uygulanır.
Şekil 1:. Tütün HCP Isı Yağış Üç Farklı Yöntemlerle uygulanmasını gösteren Süreç Akış Şeması bitki materyali yıkanmış ve açıklama ve arıtma önce homojenize edilir. ağartma adımı (kırmızı) için donatım kolayca mevcut makinelerin eklenebilir. Buna karşılık, bir karıştırılan gemi (turuncu) ve özellikle eşanjör (mavi) kullanarak bir veya birden fazla ek aygıtlar ve boru gerektirir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tütün bitkileri yetiştirmek
- 0.1 [% ağırlık / hacim] gübre çözeltisi 1 I 1 L deiyonize su 2'ye ve daha sonra her bir mineral yün blok yıkayın. Bir tütün her mineral yün bloğunda tohum ve tohum 16 yıkayarak olmadan gübre çözeltisi 0.25 L nazikçe yıkayın yerleştirin.
- % 70 nispi nemde bir serada, 16 saat fotoperiyot 7 hafta içinde tütün bitkileri yetiştirmek (1 - m - 180 umol sn 2; λ = 400-700 nm) ve 25/22 ° C açık / koyu sıcaklık rejimi.
- Bitki kök dibinde bulunan dört kotiledon yaprakları hariç tüm yaprakları hasat.
2. İsteğe bağlı: Isı Yağış Ağartma tarafından
NOT: beyazlaşma tütün Onör puanı çöktürmek için 2.12 adımlarla 2.1 açıklanan adımları uygulayın. CYp'ler çöktürülmüş olması durumunda, tüm bölüm 2 atlaısıtılmış kaba (bölüm 4) ya da bir ısı eşanjörü (bölüm 5) kullanarak.
- bitki materyali kenara 50 g Set ve (bölüm 3) beyazlaşma olmadan çıkarma yürütmek. sonraki analiz (bölüm 7) sırasında iç kontrol olarak bu özü bir örnek almak.
- Bir ısı yalıtımlı polistren köpük kova veya benzer bir 8-L çalışma hacimli su banyosu, örneğin, 50 x 40 x 40 cm, ayarlayın. sonraki sıcaklık kontrolü (adım 2.7) için su banyosu üzerinde ayarlanabilir termostat monte edin.
- Manyetik bir karıştırma plakası üzerine tüm düzeneği transferi ve bir su banyosunda, bir manyetik karıştırma çubuğu ile yerleştirin. manyetik alan karıştırma çubuğu döndürmek için yeterince güçlü olduğundan emin olun.
- polipropilen sepet (adım 2.6) haşlama işlemi sırasında daha sonra alınacaktır bunun üzerine en az dört destek çinileri ile karıştırma çubuğu çevreleyin. Destek karoları manyetik olmayan bir malzemeden (örneğin, paslanmaz çelik alaşımlı içeren nikel) yapılmış olduğundan emin olun ve onlarkarıştırma çubuğu (Şekil 2) daha yüksektir.
- su banyosu iyondan arındırılmış su, 8 ilave edin.
Not:., Düşük pH değerinde presipitasyon sorunu ise, bir tampon kullanılarak, örneğin, 50 mM sodyum fosfat (pH 7,5), hedef protein verimlerini arttırabilir. - destek karoların üzerinde bir 23 x 23 x 23 cm polipropilen sepet koyun ve sepet karıştırma çubuğu rotasyon ile karışmaz emin olun ve tam sıvıya emin olun. Gerekirse, sepet tamamen batık kadar sonra tekrar sepeti kaldırmak ilave su / tampon ekleyin.
DİKKAT: 2.12 kadar tüm sonraki adımlar sıcak sıvı taşıma içerir. ısıl yalıtımlı eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. - 70 ° C (veya deneyler için gerekli olan sıcaklık) su banyosu getirmek için ayarlanabilir termostat kullanın. İstenilen sıcaklık Therma ulaşmıştır tüm montaj sağlamak için ulaşıldıktan sonra en az 15 dakika bekleyinl denge.
- hasat tütün yapraklarından 150 gr alikotları hazırlayın. Yırtarak, örneğin geri dönüşümsüz sıkıştırma ve yaprakları zarar, kaçınarak sepet içinde bir kısım koyun. Bitki materyalinin veya ikinci bir yoğun ambalaj ile sepet fazla doldurmaktan kaçının.
- Dikkatli ama hızlı bir şekilde sıcak sıvı içinde sepeti batığın ve destek fayans üzerine yerleştirin. flotasyon önlemek için sepetin tepesinde paslanmaz çelik blok yerleştirin.
- beyazlatma sıvısı içinde 5 dakika boyunca yaprakları inkübe ya da bir zaman deney tasarımı çalışmalardaki seçin. Tüm inkübasyon dönemi sırasında sıvı sıcaklığını izlemek.
- Dikkatle haşlama sıvıdan sepeti çıkarınız ve 30 saniye süreyle yapraklardan kalan sıvı drenaj sağlar. Sonra bitki sepetin dışında bırakır almak, blender aktarmak ve hemen ekstraksiyon (Bölüm 3) başlatın.
NOT: Bitkiler haşlama sonra ve inci başlamadan önce uzun süre saklanabilire ekstraksiyon, örneğin, 30'dan fazla buz üzerinde dakika veya birkaç hafta içinde -20 ° C'de dondurulmuştur başarıyla test edilmiştir. Ancak, ürün istikrar depolama sürelerini artırarak ve böylece acil işlem tavsiye edilmektedir düşebilir. - Tüm hasat biyokütle işlenir yineleyerek taze yaprak malzemesi ile 2.11 2.8 adımları tekrarlayın.
Tütün Yapraklar 3. Protein Ekstraksiyonu
DİKKAT: Sonraki adımlar dönen bıçaklar ile bir blender içerir. o blender motora monte ederken blender kova işe yaramaz.
- Hasat (adım 1.3) ya da kabuksuz (aşama 2.11) 150 g (ıslak kütle) blender bırakır ve ekstraksiyon tamponu (50 mM sodyum fosfat, 500 mM sodyum klorid, 10 mM sodyum disülfit, pH 8.0) 450 ml ekle.
Not: ekstraksiyon tamponu bileşimi ekstre edilecek protein bağlıdır ve bu nedenle bir pH, örneğin ayarlı, kullanımını gerektiren ya da TR olarak bileşeni arabellekolduğunu. - 30 sn sonları serpiştirilmiş ile 3 x 30 saniye bakliyat için yaprakları homojenize. Yaprakları homojenize edilir ve blender kova yapışmasına neden yoktur emin olun. blender durdurmak ve gerekirse tıkanma önlemek için yaprakları kaldırın ve ardından homojenizasyon devam edin.
- Sonraki analiz (bölüm 7) için üretilir her ekstrenin 1 ml örneği alın. bitki materyali beyazlatılmış ise, Aksi seçilen deneysel yaklaşımına bağlı olarak, bir kap içinde ısı yağış (bölüm 4) veya ısı değiştirici (bölüm 5) devam bölüm 6. devam ediyor.
4. İsteğe bağlı: Isı Yağış karıştırılan kap içinde,
NOT: Bir karıştırma kabına tütün Onör puanı çökeltmek için 4.11, Bölüm 4.2 de tarif adımları yürütün. CYp'ler (bölüm 2) beyazlaşma ile çöktürülmüş edilmiş veya eşanjör (bölüm 5) kullanılarak çöktürülmüş edilecektir, tüm bölüm 4 atlayın.
- İki 8-L çalışma hacmi suyu kurmakbanyolar, örneğin, ısıl yalıtımlı polistiren köpük veya benzeri 50 x 40 x 40 cm. İlk banyosunda sonraki sıcaklık kontrolü (adım 4.6) için ayarlanabilir termostat monte edin. İkinci olarak, iyonu giderilmiş suyun 5 L ve daha sonraki soğutma (basamak 4.9) buz 2 kg ekleyin.
- Manyetik bir karıştırma plakası üzerine ilk su banyosu transferi ve teknenin merkez karıştırıcı plakasının merkezine hizalandığını su banyosu içine 2-litrelik bir paslanmaz çelik kap yerleştirmek.
- paslanmaz çelik bir kapta manyetik bir karıştırma çubuğu ile yerleştirin. manyetik alan karıştırma çubuğu döndürmek için yeterince güçlü olduğundan emin olun.
- Paslanmaz çelik kabın üst kenarının altına 5 cm kadar deiyonize su ile su banyosunda doldurun. Daha sonra ekstre tamponu ile kap doldurun. gemide bir polistiren köpük kapağı yerleştirin.
DİKKAT: 4.9 kadar tüm sonraki adımlar sıcak sıvı taşıma içerir. termal ins dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanınolup, bun- eldivenler. - Polistiren köpük kapaktaki bir takım elbise delikten paslanmaz çelik bir kaba, bir termometre takın. 78 ° C su banyosu sıcaklığında ayarlamak ve termal dengeye ulaşmak için 15 dakika boyunca tüm montaj inkübe edin. teknedeki sıcaklık 70 ° C, bir su banyosu içinde ayar noktasının altında, yaklaşık olarak 8 ° C olduğundan emin olun.
- paslanmaz çelik bir kapta sıcaklığı 70 ° C ila farklıysa, bir su banyosu içinde sıcaklığı buna göre ayarlamak ve sistem 15 dakika daha dengelenmesi sağlar. kap içinde sıcaklığı 70 ° C kadar ya da deney için gerekli olan bu adımı yineleyin ve paslanmaz çelik gemi boşaltın.
- Bu su banyosu içinde iken bu paslanmaz çelik bir kaba ekstrakt (aşama 3.2) 300 ml dökün ve zaman ölçeri başlat. 150 rpm'de özü ilave edin ve 5 dakika boyunca inkübe edin. Ekstre Bu inkübasyon süresi boyunca en az 2 dakika süreyle 70 ° C'lik bir sıcaklığa ulaşır emin olun.
- , Manyetik karıştırıcı sıcak su banyosu çıkarın paslanmaz çelik gemi çıkar ve buz gibi soğuk kova yerleştirin. Manyetik karıştırıcı üzerine ikinci yerleştirin ve polistren köpük kapağını kaldırın.
- Bitki homojenat de 150 rpm'de çalkalandı olduğundan emin olun özü termometre koyun ve 20 ° C bir sıcaklığa ya da deneysel tasarım ile belirtilen sıcaklığa ulaşana kadar inkübe edilir.
- Tekrarlayın 4.7 tüm alikotları 4.9 için yineleyin. Her ısı 1 ml örneği almak daha sonra bölüm 6 ile devam, son sıcaklığa ulaştığında özü çöktürülmüş.
5. İsteğe bağlı: Bir Eşanjör Isı Yağış
Not: bir ısı dönüştürücü kullanarak, tütün Onör puanı çökeltmek için 5,2 5.12 kısımlarda açıklanan adımları yürütün. CYp'ler (bölüm 2) beyazlaşma veya ısıtılmış kapta (bölüm 4) çöktürülür olması halinde, bütün bölüm 5 atlayın.
- İki 8-L çalışma hacmi kurmaksu banyoları, örneğin, ısı yalıtımlı polistren köpük kova veya benzeri 50 x 40 x 40 cm. İlk banyosunda sonraki sıcaklık kontrolü (adım 5.3) için ayarlanabilir termostat monte edin. İkinci olarak, iyonu giderilmiş suyun 5 L ve daha sonraki soğutma (basamak 5.10) buz 2 kg ekleyin.
DİKKAT: 5.9 kadar tüm sonraki adımlar sıcak sıvı taşıma içerir. ısıl yalıtımlı eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. - 8 L deiyonize su ile ilk su banyosu doldurun. termostat kullanılarak 74.5 ° C'ye sıcaklığı ayarlayın. Termal dengeye ulaşmak için 15 dakika için montaj inkübe edin.
- 1-L plastik geniş şişenin içine 0,5-L plastik kabı yerleştirerek yalıtımlı bir depolama kabı hazırlamak ve pamukla boşlukları doldurmak. Seçenek olarak ise, bir 0,5-L çalışma hacimli bir özel ısıl yalıtımlı kaplarından faydalanır.
- bir ucunda ve diğerleri bir çıkış hortumuna peristaltik pompa, ısı eşanjörünü iletişimer L / S 24 tüp kullanarak biter. Her iki boru yalıtımlı bir depolama kabı içinde bir termometre ile sonlandığı ve 300 ml ekstraksiyon tamponu (Şekil 2) ile doldurun.
- Sıcak su banyosu içine ısı eşanjöründen yerleştirin ve 300 ml dak-1 hızında peristaltik pompayı çalıştırın. kabında ortaya çıkan sıcaklık 3 dakika sonra, 70 ° C su banyosu ayar noktasının altında, yaklaşık 4.5 ° C olduğundan emin olun.
- izolasyonlu-kabı içinde sıcaklığı 70 ° C farklıysa, buna bağlı olarak, su banyosunun sıcaklığı ayarlamak ve sistem 15 dakika daha dengelenmesi sağlar. en az 3 dakika içinde 70 ° C'ye kadar ortam sıcaklığı ile ekstraksiyon tamponu artar sıcaklığına kadar yineleyin veya deney için gerekli olana eşittir ve paslanmaz çelik kap boşaltın.
- yalıtılmış tekneden ekstraksiyon tamponu atın ve bitki ekstresinin 300 ml'lik numuneler hazırlayın. bir bölümüyle izole gemi doldurun.
- 5 dakika boyunca dk -1 300 ml eşanjör sayesinde bitki özü (bölüm 3.3) pompa. Ekstre sıcaklığı 3 dakika sonra 70 ° C, ya da deney tasarımında belirlenen sıcaklık eşit olduğundan emin olun.
- Ekstre de pompalanır edilirken 5 dakika sonra, buz soğukluğunda su banyosu içine ısı eşanjöründen yerleştirin. Sıcaklık tam ulaşır 20 ° C, ya da deneysel tasarım tanımlanan sıcaklık kadar bu ortamda kuluçkaya yatmaktadır.
- yalıtımlı tekneden peristaltik pompaya bağlı giriş hortumunu sökün ve ısı değiştirici içinde kalan ısı çöktürülmüş bitki özü toplamak için pompalama devam edin. Sonra pompayı durdurun.
- Tekrarlayın 5.7 tüm alikotları için 5.10 için yineleyin. daha sonra torba filtreleme (bölüm 6) için özler geçmek, son sıcaklığına ulaştığında, her bir ısı-çöktürülmüş ekstresi 1 ml örnek almak.
NOT: birinci aşama boyunca 5.10 5.7 adımları sonra hiçbir ekstraksiyon tamponu olacakAdım 5.7 atın.
Bitki Özü 6. Torba Filtrasyon
- filtre gövdesine monte ve esnek filtre malzemesi için mekanik destek sağlar karşılık gelen destek sepet içine bir torba filtre monte edin. Sepetin altında bir 1-L kap yerleştirin ve 150 ml dak-1 hızında torbaya (seçilen ısıl işleme bağlı olarak bölüm 3.3, 4.10 ya da 5.11) ekstre alikotları uygulanır.
- Süzüldükten sonra Bulanıklık kullanarak ekstraksiyon tamponu içinde filtre 1:10 seyreltme bulanıklık ölçer.
- Örneğin, derin filtrasyon ve kromatografi 7,10 1 ml örneği alın ve deney tasarımı tanımlanan torba süzüntü işlem.
7. Numune Analizi
- Bradford yöntemi 24,25 ile toplam çözünür protein (TSP) miktarını ölçün.
- üç kopya olarak, tek kuyu içine her numunenin 2.5 ul pipet96 oyuklu plaka. 2.000 ug ml -1 - aralığı 0 kapsayan üç nüsha olarak sekiz sığır serum albümin (BSA) standartları içerir.
- kabarcıkları oluşturan önlemek için yavaşça yeterince iyi her 200 ul Bradford reaktif ekleyin ve aşağı yukarı pipetleme iyice karıştırın ama.
- 22 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin ve bir spektrofotometre ile 595 nm'de absorbans ölçümü. BSA referans noktaları yoluyla bir standart eğriye dayanarak örneklerde TSP konsantrasyonu hesaplanır.
- Yüzey plazmon rezonans spektroskopi 26 tarafından Vax8 niceliğini.
- Ayar 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) çalışan tamponu yüzey plasmon rezonans cihazı (10 mM HEPES, 3 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1.500 mM sodyum klorür,% 0.05 h / h polisorbat 20, pH 7.4) ve cihaza bir karboksimetilatlı dekstran yüzeyine çip monte edilir. sistemi temizlemek için asal işlevini kullanın ve 30 bir akış oranı ile manuel çalışma başlatmakul dk -1 akış hücreleri 1 ve 25 mM sodyum hidroksit, 60 sn serpiştirilmiş enjeksiyon ile iki kez 60 saniye boyunca 2 enjekte 30 mM hidrojen klorür üzerinde.
- 500 ug ml 200 ul -1 mAb 5.2, 10 mM sodyum asetat (pH 4.0) çözelti hazırlayın. Çözülme 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC) ve N-hidroksisukinimid (NHS) şişeler ve 1 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüj. NHS 70 ul EDC 70 ul karıştırın ve 7 mm plastik bir şişeye aktarın.
- 10 ul dak-1 bir akış hızı ile 10 dakika için EDC / NHS akış hücreleri 1 üzerine karışımı ve 2 enjekte karboksimetilatlı dekstran yüzeyine yonga yüzeyi etkinleştirir.
- hücre 2 sadece akmasına akış yolunu ayarlayın. 10 ul dak-1 hızında, 15 dakika boyunca enjekte ederek çift mAb 5.2.
- Hücreler, 1 ve 2 akım ve min -1 yüzeyi devre dışı bırakmak için, 5 ul bir oranda, 7 dakika için etanolamin enjekte akış yolunu geçin. TTavuk 25 mM sodyum hidroksit, 60 sn serpiştirilmiş enjeksiyonu ile 60 saniye boyunca iki kez, 30 mM hidrojen klorid enjekte edilir.
- 30 ul dk'lık bir hızda 19 standart -1 180 saniye - örnekleri ve MSP1 enjekte edilir. 1000 ng ml -1 - Vax8 konsantrasyonu 50 olduğundan emin olun. HEPES önceden dilüe gerektiğinde EDTA ve polisorbat 20 (HBSEP) ihtiva eden tamponlu tuz.
- Akış hücresinin 2 bu akış hücresinin 1 pik sinyali çıkart ve MSP 1 sinyaline dayalı örneklerinde Vax8 konsantrasyonunu hesaplamak için fark kullanmak - 500 ng ml -1 bilinen bir protein konsantrasyonu ile 19 enjeksiyon.
- 30 ul dk'lık bir akış oranında 60 saniye boyunca 30 mM hidrojen klorüre maruz bırakılarak 19 enjeksiyon -1 - her numune ya da MSP sonra 1 yonga yüzeyi yeniden.
- floresan spektrometresi ile DsRed ölçmek
- üç kopya olarak, siyah yarı ar, tekli oyuklar her bir numunenin pipet 50 ulEA 96 oyuklu plaka. 225 ug ml -1 - aralığı 0 kapsayan altı DsRed standartları içerir.
- 530 ± 30 nm eksitasyon filtresi ve bir spektrofotometre içinde 590 ± 35 nm emisyon filtre kullanılarak iki kez floresan ölçülür. DsRed referans noktaları yoluyla bir standart eğriye dayanarak örneklerde DsRed konsantrasyonu hesaplanır.
- parçacık boyutu dağılımlarının belirlenmesi
- 1 ml izopropanol ile bir küvet yıkanır ve daha sonra deiyonize su ve 2 ml Toz parçacıkları çıkarmak için. küvet içinde örnek 850 ul pipet.
- zeta potansiyeli ve parçacık büyüklüğü analizörü içine küvet yerleştirin. "Yazılım" açın ve malzeme olarak "Protein" ve dağıtıcı olarak "PBS" ile manuel ölçümü başlatın. 25 ° C'lik bir sıcaklık ve 180 saniyelik bir dengeleme süresi seçin.
- 173 ° backscatter de "DTS0012" hücre ve ölçü seçin. "Auto" fonksiyonu kontrolÖlçüm süresi boyunca iyon ve hiçbir serpiştirilmiş bir gecikme ile üç ölçüm seçin.
- Ölçüm deney görünümünde numunenin üç ölçüm seçerek tamamlandıktan sonra tanecik boyut dağılımı zirve profilini incelemek. "Cilt PSD" sekmesini seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beyazlaşma tütün konak hücre proteinlerinin ısı yağış
Bölüm 2'de açıklanan beyazlatma işlemi başarılı bir şekilde, tütün 96 ±% 1 TSP azaltarak 70 ° C ile yapraklardan Onör puanı çökeltmek için kullanılabilir (n = 3) bu şekilde, Vax8 hedef proteinin% 51 kadar geri kazanılması artan ise kromatografik ayırma 16 önce% 0.1% 1.2 ila saflık. 64.1% 3.3 den% saflığı artan floresan proteini DsRed 83 ± 1% (n = 3) kurtarmak da mümkün oldu. Beyazlatma işlemi kolay biyokütle yıkama, homojenleştirme, çanta, süzme ve derinlikli filtreleme oluşan standart ekstraksiyon ve arıtma şeması (Şekil 1) 7 entegre edildi. Haşlama ekipman hazırlanması (Şekil 2) rutin olarak 20 dakika sürer açıklama cihazlar için kurulum süresi yaklaşık 5 dakika ekledi. Başka bir 7 dk gerçekleştirmek için gerekli olan45 dakika tipik ekstraksiyon ve arıtma zaman ek olarak sağlam yaprak haşlama. Ancak, ek 7 dakika sadece 2 dakika gerçek "hands-on" zamanında oldu. Buna ek olarak, 1 dakikadan daha az bir kısa inkübasyon süreleri yaklaşık 3 dakika ile 7 min haşlama süresini azaltmak mümkündür. Bu nedenle, sadece beyazlatma, ham bitki ekstrelerinde bir ürünü ilk saflığı artırır, ama aynı zamanda hızlı bir şekilde ve böylece, en azından bir ilk kromatografi aşamasını yerine potansiyel sunan herhangi bir ek işlem ekipmanı ile tamamlanır. Beyazlaşma banyosu sıcaklığı, sabit kalmıştır, yani <0.2 ° C dalgalanma, hatta hemen ortam sıcaklığında olan hasat yaprakların eklendikten sonra tüm deneyler sırasında. Bu, sonraki durultma adımda TSP azalma, ürün verimi ve filtre kapasitesi açısından (Şekil 3'de (n = 24) işlemi, örneğin,% 17 değişim katsayısı ortalama tekrarlanabilir sağlanmalıdır 9, sonra protein ekstraksiyon 8 ve filtre yardımcıları sonra pıhtılaşmış ekleyerek ele alınabilir. 60 ° C'lik bir sıcaklık (n = 3) CYp'lerine 80 ±% 3 çıkarın ve filtre kapasitesi etkilemeden Vax8 saflık 2.6 ± 0.1 kat (n = 3) arttırılması için yeterli idi. Bu nedenle, haşlama ile HCP kaldırılması, yani orta derecede ısı stabilitesi, 70 ° C 27,28 arasında bir erime sıcaklığına sahip hedef proteinler ile uyumludur. Bununla birlikte, 70 ° C ya da daha fazla artan sıcaklık 95 üzerinden% (Şekil 3) bir HCP çıkarılması ile sonuçlanabilir. Bu en r hızla belirlenmesini izin çünkü istatistiksel bir yaklaşım 22 kullanılarak iyi tasarlanmış bir şekilde deney karşılık gelen bir dizi yapmak için yararlıElevant işlem parametreleri, yani, ısıtma süresi ve sıcaklık. Aynı zamanda, DoE yöntemi proses optimizasyonu 16 kolaylaştırmak için bir tahmin modeli oluşturulur.
Şekil 2:. Üç Yöntemleri şematik Kur Bunların A. Haşlama olduğu gibi bırakır ihtiva eden bir sepete daldırılmıştır içine bir termostat (T) ile ısıtılan bir su banyosu içinde gerçekleştirildiği gibi bırakır veya ekstreler tütün Onör puanı çökeltildi. Su banyosu, homojen ve sürekli bir ısı sağlamak için çalkalandı. B. Bir manyetik karıştırma çubuğu ve yaprak ekstresi ihtiva eden bir tekne, bir su banyosu içine daldırılmış olan. Özü sıcaklığı istenen sıcaklık elde emin olmak için gözlenmiştir. C'de bir ısı eşanjörü (H), bir pompa (P) ve termik olarak izole edilmiş Saklama bağlanmıştırBitki özü içeren e kap. Eşanjör bir su banyosu ve izlendi ısıtmalı ekstresinin sıcaklık batık oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Onların Süreç Performansı Üzerindeki Etkileri ve İki Hedef Proteinlerin Saflaştırılması A gösteriliyor Üç Isı Yağış Yöntemlerinin Karşılaştırılması. CYp'lerine fazla% 90 kaldırılmasını destekleyen koşullar, karıştırılmış bir kap ve 2.5 kat, en az hedef proteinleri Vax8 ve DsRed saflığını yüksek hepsi bir ısı değiştirici kurulum ve 19 en fazla beyazlatma tanımlandı kat, aletiyle en iyi performansı. Buna karşılık, sadece karıştırılan kabı ayar subseq kapasitesini artmışısıl işlem görmüş bitki veya ekstrelerin açıklama için kullanılan uent derinlemesine filtrasyon adım. Hata çubukları standart sapmayı belirtir (n = 3). B. Farklı ısı işlemi koşulları sonra örneklerin HCP içeriği analiz edilir ve Coomassie boyalı poliakrilamid jelleri kullanılarak karşılaştırılabilir. RUBISCO (yeşil oklar) DsRed oysa (kırmızı ok) çözelti içinde kalır, ısıl işlem süresince artar sıcaklık gibi diğer CYp'lerine birlikte kaldırılır. X 0.5 dakika boyunca, ısıya maruz kaldığında bir numune, tüm diğer numuneler 3.0 dakika ya da daha fazla tedavi edildi gösterir. Yeniden baskı 16'dan izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Karıştırılan kap içinde, CYp'lerine ısı çöktürme
Isı çökeltilmesi için bir karıştırılan kabı 84 ±% 1 bir maksimum çıkarıldı (n = 3) HCp'ler, bir saflığa O eldef 0.33 ±% 0.02 (N = 3) Vax8 ve 20.2 ± 1.4% (n = 3) DsRed için (Şekil 3). ısıl işlem bir kap seri birden fazla numune işleme cihaz doluluk yansıtan gecikmeleri önlemek için homojenleştiricide ayrı olarak yürütülmüştür. Laboratuar ölçekli işlem için gerekli kullanma çabası beyazlatma ancak ek Paslanmaz çelik kap ve özel bir soğutma aşaması gerekmiştir için olana benzerdi. Bundan başka, ekstre ısı transfer haşlama için olandan 10 kat daha uzun, en az 5 dakika inkübasyon süreleri, yani ile, haşlama sırasında daha yavaş olmuştur. Gecikmeli ısıtma ısı transferine karşı ek bir koruma teşkil kap, neden olduğu ve bağlı bitki biyokütlesinin ilave öz çıkarma tamponu içerisinde varlığı bir tekne içerisinde ısıtıldı ~% 300 daha büyük bir kütle edildi. yavaş yavaş ilave bir ısı transferi bariyer oluşturmak ve çaba artan da kabın duvarlarına yapışan proteinler çökeltmesonraki temizlik için gerekli. kısmen açık sistemde enerji kayıpları telafi ısı yağış için kullanılan sıcaklığın üzerinde su banyosu sıcaklığı 8 ° C ayarlanması ve istenilen özü sıcaklığı elde etti. Bir kap içinde (bölüm 2) ve ısı değiştirici kurulumu (bölüm 5), HCP yağış haşlama aksine ısı ile özü pompalama göre geminin alt sırf kuvvetleri yansıtan, 2,5 kat ile aşağı derinlik filtreleme kapasitesini artırdı eşanjör veya homojenizasyon beyazlaşma sonra, muhtemelen çanta filtrasyon adımda kaldırmak için daha kolay olduğu büyük agrega sonuçlanır.
Bir ısı değiştirici içinde CYp'lerine ısı çöktürme
Yaklaşık 88.3 ± 0.7% (n = 12) HCP içeriğinin sürekli olarak sıcaklık aralığında bir ısı değiştirici kullanılarak ekstre çıkarıldı 60-70 ° C, Vax8 için 0.31 ± 0.01,% (n = 12) 'in bir saflığa sağlanması ve 27.6 ± 2.0% (n = 12) DsRed için (Şekil 3). varyasyon ortalama katsayısı bu prosedürün tekrarlanabilirlik haşlama daha iyi olduğunu belirten% 13 (n = 24) idi. su banyosu sıcaklığı yüksek 4,5 ° C kurulmuştur istenen özü sıcaklığı ~ 3 dakika sonra elde edilmiştir. ısıtılmış kap için olduğu gibi, özel bir soğutma aşaması ısı işlemden sonra gerekli oldu. eşanjör nedeniyle yoğun temizlik gerekli pompalama cihazları ve eşanjör nedeniyle dar delik paslanmaz çelik boru duvarlarına yapışan çökelti diğer yöntemlere göre daha taşıma çaba çıkıyor. Eşanjör da tıkanma önce sadece 13.5 ± 6.0 (n = 3) L m -2 açıklayan en aşağı derinlik filtre kapasitesi, elde etti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklanan ısı yağış için üç yöntem etkili bir şekilde kromatografik saflaştırma adımı 16,17 önce tütün Onör puanı kaldırabilirsiniz. Bunlar, örneğin, ilk ürün saflığı, damlama 29 salgılanmış proteinler ile sınırlıdır hepsi rhizosecretion 30 ya da santrifüjlü ekstraksiyon 31,32 artırılmasını amaçlayan diğer metodlar tamamlar. hedef protein fazla 1 dakika boyunca ~ 60 ° C'de en az çökelme sıcaklığı dayanabilir arıtılacak Bununla birlikte, ısı dayalı yöntemler, sadece anlamlı bir şekilde kullanılabilir. Bu nedenle, üç yöntemden birini ilk adım 16,18,21 antijenler, çeşitli Plasmodium falciparum farklı bölgelerinden oluşan birçok sıtma aşısı adayı proteinleri için anlatılmıştır yeterince yüksek bir erime sıcaklığına sahip bir hedef molekülü tasarlamaktır. Hedef proteinin termal stabilitesi göstermiştir sonra, tek birüç yöntem mevcut ekipman ve medya, beklenen son işlem ölçeği ve sonraki DSP işlemleri 16 dayanarak seçilmelidir edilebilir.
Ağartma az yöntemler ve ek ekipman taleplerini hızlı idi, bu nedenle kolayca bitkisel kaynaklı rekombinant proteinler için mevcut laboratuar ölçekli saflaştırma protokolleri uygulanabilir. Haşlama sıvının sertçe çalkalama ampirik veriler ve teorik hesaplamalar 21,33 hem dayalı HCP yağış verimliliğini etkileyen önemli bir proses parametresidir. Ev sahibi proteazlar aktif 21,34 kalırsa bu da ürün açısından zararlı olabilir, ancak kısmen HCP kaldırılması ısı transferi sonucu bozabilir iyi bir karışım elde etmek için başarısız. Birçok diğer parametreler de örneğin HCP yağış, ısıtma sıcaklığı ve inkübasyon süresini etkileyebilir ve DoE yaklaşımı, bu nedenle en uygun fa karakterize etmek yararlı olabilirvektörlerin içine klonlanabilir ve sağlamak tahmini modelleri, ürün saflığı, kurtarma ve DSP 22 adımları sonraki performansı olarak yanıtlar üzerindeki etkilerini ölçmek için.
damar kurulumunda, uzun inkübasyon süreleri tam HCP yağış elde etmek için gerekli ve bu yüksek sıcaklıklara uzun pozlama yansıtan istenmeyen hedef protein denatürasyonu olasılığını artırabilir. kap içinde daha kapsamlı karıştırma ısı transferini artırmak ve ısıtma süresini azaltabilir. Ekstresi 21,34 yılında proteazlar ürün kayıplara neden, son ısı inaktivasyon öncesinde daha aktif hale gelirse bu kurulum uzun sıcaklık rampası da zor olabilir.
damar kurulumu için gözlenen artmış derin filtre kapasitesi örneklerinin daha çok sayıda sabit bir bütçe ile bir projede ele alınması için izin veya experim kümesi verilen genel fonlama ihtiyaçlarını azaltarak, sarf maliyetlerini azaltmaya yardımcı olabilirhastalar. Bununla birlikte, bu yarar DOE bir parçası olarak, çok sayıda ekstraksiyon çalışır, örneğin deney, bir dizi gerekiyorsa işlemi tutma adımları girmesini önlemek için homojenizatör ek olarak gerekli olan ek kabın maliyet önüne geçebilir yaklaşım. daha yoğun karıştırma rejim yukarıda önerildiği gibi ısıtma sürelerini azaltmak için kullanılır eğer filtre kapasitesi üzerinde olumlu etkisi de azalabilir.
Özel bir soğutma aşaması ek bilgi aynı zamanda da akıcı DoE prosedürleri ya da genel olarak deney dizileri ile çakışabilir örnek başına toplam işlem süresi, uzatma sadece gerektiren iki özü bazlı ısı çökeltme yöntemleri için gereklidir. Eşanjör kurulumu iyi bir mühendislik perspektifinden 35 karakterizedir ve kolayca ölçek sırasında yüzey-hacim oranı değişiklikleri gemiye, aksine, tasarlanmış ve belirli sıcaklık farklılıkları için ölçeklendirilebilir. Nasıleşanjör boyutu tanımlanır kez hiç, onun uzunluğu ve dolayısıyla ısı transfer alanı sabit olduğundan alternatif sıcaklık farklılıkları ayarlamak için zor olabilir.
gibi diğer kalma süresi gibi parametreler, (veya akış hızı) ve ısı eşanjörü ortamının sıcaklığının değiştirilmesi, bir dereceye kadar esneklik geri ancak sadece küçük ölçekli deneylerde bu faktörler genellikle proses ölçekli operasyonlar nedeniyle dar pencere ameliyat nedeniyle mevcut ekipman ve medya tarafından dayatılan kısıtlamalara. 5 dakika ve 40 bir sıcaklık farkı - - 3 kısa kuluçka süreleri bir kombinasyonu talebi 60 ° C ısı değiştirici boyutları daha büyük hale çünkü süreç ölçek arttıkça cihaz seviyesinde çözmek için giderek daha zor hale gelir. orta ve arzu edilen ekstre sıcaklığı arasındaki sıcaklık farkı genellikle küçük olduğundan, bu, soğutma aşaması için de geçerlidir (DT = 10-15 ° C)Büyük ekipman boyutları ya da daha uzun soğuma süreleri sonuçlanan ısıtma aşaması (DT = 20-40 ° C) den.
Gelecekte, protokol, bu çalışmada, özellikle termal stabilite için tasarlanmış aşı adaylarının dışında biyofarmasötik proteinler uyarlanabilir. Birçok antikorlar zaten mevcut ısıl işlem protokolü ile uyumlu olan> 70 ° C 36,37 sıcaklığa dayanabilir. Bu doğal termal stabilite ve böylece burada sunulan yöntem (ve varyasyonlar) tabi tutulabilir proteinlerin sayısının artırılması, farklı antikor alanları 38 mühendislik ile daha da arttırılabilir. Beyazlatma Yöntem, termal stabilite ya da protein mühendisliği seçime tabi tutulmamış olan bir monoklonal antikor (2G12) 17 ifade eden transgenik tütün bitkilerine uygulanmıştır. 65 ° C sıcaklıkta ısıl işleme tabi bir faktör ile antikorun saflığı artmışönceki iki kromatografik saflaştırma kazanımı beyazlatma olmadan gözlenene benzer olmuştur.
Yüksek sıcaklık, kısa bir süre 39: Ek olarak, bir ekspresyon sisteminin münferit HCP erime sıcaklıkları karakterize bir işlem süt pastörize benzer yapılabileceğine hangi sıcaklık belirlenmesini kolaylaştırabilir. Isıl işlem (beyazlaşma hariç), aynı zamanda ürünün gerekli sıcaklıklara dayanabilen halinde Onör puanı kaldırmak için başka biyolojik başlangıç malzemelerine uygulanabilir. ikinci tür memeli hücre kültürü süpernatanları diğer sentezleme platformlar işleniyor burada tartışılan farklı olabilir. Her durumda, maliyet-fayda oranı, yani azaltılmış HCP düzeylerinin faydası ek yatırım maliyetlerini neden olan bir ısıl işlem adımını uygulamak için maliyeti ağır basmaktadır yapar dikkate alınması süreci süresini uzatır ve ürün Yie azaltabilir olmalıdırld 16. Bu bağlamda önemli bir parametre ürünün aktivitedir. Bazı protein esaslı aşılar için doğrusal epitopları varlığına bağlıdır, daha sonra ısı muamelesi etkisi 40 olması pek mümkün değildir. Protein yapı konformasyonel epitoplar için, örneğin, önemli ise aksine, bir enzimin aktif amino asit yan zincirlerinin Tam bir yönlendirme veya bölgelerinin belirlenmesi antikor tamamlayıcılığı doğru katlama, bir ısı işleminin protein aktivitesi 41,42 müdahale edebilir. Bu nedenle, uygun analiz deneyleri öncesi ve ısıl işlem sonrası ürün performansını izlemek için kurulmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çıkar çatışmaları var.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
| Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
| Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
- PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
- Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
- Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
- Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
- Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
- Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940 (2016).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
- Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
- Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
- Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
- Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
- Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
- Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
- Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
- Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
- Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
- Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
- Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
- Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
- Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
- Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336 (2006).
- Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
- Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).
