Summary
Tre calore metodi di precipitazione sono presentati che rimuove efficacemente oltre il 90% delle proteine della cellula ospite (HCP) da tabacco estrae prima di qualsiasi altra fase di purificazione. L'impianto di operatori sanitari in modo irreversibile aggregare a temperature superiori a 60 ° C.
Abstract
Le piante non solo forniscono alimenti, mangimi e materie prime per l'uomo, ma sono stati sviluppati come un sistema di produzione economica per le proteine biofarmaceutiche, come gli anticorpi, vaccini candidati ed enzimi. Questi devono essere purificati dalla biomassa vegetale, ma passaggi di cromatografia sono ostacolati dalle alte concentrazioni di proteine della cellula ospite (operatori sanitari) in estratti di piante. Tuttavia, la maggior parte HCPs irreversibilmente aggregano a temperature superiori a 60 ° C agevolare successiva purificazione della proteina bersaglio. Qui, tre metodi vengono presentati per ottenere la precipitazione di calore degli operatori sanitari del tabacco in foglie sia intatte o estratti. Il pallore di foglie intatte può essere facilmente incorporato in processi esistenti, ma può avere un impatto negativo sulle successive fasi di filtrazione. L'opposto è vero per la precipitazione di calore di estratti di foglie in un recipiente agitato, che può migliorare le prestazioni delle operazioni a valle anche se con grandi cambiamenti nella progettazione apparecchiature di processo, qualiGeometria omogeneizzatore. Infine, una configurazione scambiatore di calore è ben caratterizzato in termini di condizioni di trasferimento di calore e facile in scala, ma pulizia può essere difficile e potrebbe esserci un impatto negativo sulla capacità del filtro. L'approccio progettuale-di-esperimenti può essere utilizzato per identificare i parametri di processo più importanti che influenzano la rimozione HCP e recupero del prodotto. Questo facilita l'applicazione di ciascun metodo in altre piattaforme di espressione e l'identificazione del metodo più adatto per una data strategia di purificazione.
Introduction
I moderni sistemi di assistenza sanitaria dipendono sempre più sulle proteine biofarmaceutiche 1. Produrre queste proteine nelle piante è vantaggioso a causa del basso carico patogeno e maggiore scalabilità rispetto ai sistemi di espressione convenzionali 2-4. Tuttavia, la lavorazione a valle (DSP) di farmaci di origine vegetale può essere difficile perché le procedure di estrazione dirompenti si traducono in un onere elevato di particelle, con torbidità superiore a 5.000 unità nefelometrica torbidità (NTU), e di proteine della cellula ospite (HCP) concentrazioni spesso superiore a 95 % [m / m] 5,6.
Procedure di chiarificazione elaborati sono tenuti a rimuovere particelle disperse 7-9, ma l'apparecchiatura cromatografia è meno costoso per operare in modalità bind-and-eluire durante il recupero iniziale del prodotto se c'è un passaggio precedente per la rimozione efficiente degli operatori sanitari 10,11. Ciò può essere ottenuto sia da precipitare la proteina bersaglio utilizzando flocculformiche 12 o basso pH 13,14, così come provocando la operatori sanitari di aggregare. L'aggregazione selettiva di ribulosio-1,5-bisfosfato carbossilasi / ossigenasi (Rubisco), l'operatore sanitario più abbondante nelle piante verdi come il tabacco (Nicotiana tabacum), può essere promossa aggiungendo polietilene glicole 15, ma questo è costoso e incompatibile con grande la produzione -scale. Il trattamento termico è stato dimostrato per denaturare e precipitare più del 95% degli operatori sanitari tabacco, mentre vaccini candidati proteina malaria come Vax8 rimangono stabili in soluzione 16-18.
Tre diversi approcci sono stati usati per ottenere la precipitazione indotta dal calore degli operatori sanitari tabacco: (i) la scottatura, cioè, l'immersione delle foglie intatte in liquido caldo, (ii) una temperatura controllata agitata nave, e (iii) uno scambiatore di calore ( Figura 1) 16. Per foglie intatte, scottatura raggiunto la precipitazione rapida ed efficace degli operatori sanitari ed era anche facilea scalare e compatibile con i processi di produzione su larga scala esistenti che includono un primo passo per lavare la biomassa vegetale 19. Al contrario, navi temperatura controllata sono già disponibili in alcuni processi e possono essere utilizzati per il trattamento termico di estratti vegetali 20, ma la loro scalabilità e velocità di trasferimento di energia è limitato perché il rapporto superficie-volume dei serbatoi è progressivamente ridotta e diventa inadatto a scala processo. Uno scambiatore di calore è un'alternativa tecnicamente ben definito per riscaldata navi agitate ma richiede un abbondante approvvigionamento di riscaldamento e mezzi di raffreddamento, ad esempio, vapore e acqua fredda, nonché una portata volumetrica strettamente controllato atto a geometria scambiatore di calore e proprietà dei media, ad esempio., la capacità termica specifica. Questo articolo mostra come tutti i tre metodi possono essere usati per la precipitazione indotta dal calore degli operatori sanitari tabacco e HCPs vegetali in genere. L'istituzione e il funzionamento di EACMetodo h in un ambiente di laboratorio può essere utilizzato per valutare la loro idoneità per processi su larga scala. La sfida principale è quello di individuare modelli in scala-down adeguati e condizioni di funzionamento per ogni operazione che assomigliano i dispositivi e le condizioni utilizzate durante la produzione processo di scala. I dati qui presentati si riferiscono ad esperimenti condotti con piante di tabacco transgeniche che esprimono la malaria candidato vaccino Vax8 e proteina fluorescente DsRed 16, ma il metodo è stato applicato con successo anche a N. piante benthamiana esprimere transitoriamente altre proteine biofarmaceutiche 21.
Un design-di-esperimenti (DOE) si avvicinano 22 può facilitare lo sviluppo di processo, e flocculanti 23 può anche essere utile in questo contesto, come descritto in precedenza 8. La differenza principale tra la scottatura, serbatoi riscaldati e scambiatori di calore è che sbiancamento viene applicata alle foglie intatte nelle prime fasi del processo mentre l'otlei sono applicati a estratti vegetali (Figura 1).
Figura 1:. Processo Schema di flusso che illustra la realizzazione di tre diversi metodi per il tabacco HCP calore Precipitazioni Il materiale vegetale è lavato ed omogeneizzato prima chiarificazione e purificazione. L'attrezzatura per il passo scottatura (rosso) può essere facilmente aggiunto al macchinario esistente. Al contrario, utilizzando un recipiente agitato (arancione) e, soprattutto, uno scambiatore di calore (blu) richiede uno o più dispositivi e tubi aggiuntivi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. Coltivare le piante di tabacco
- Lavare ogni blocco lana minerale con 1 a 2 L di acqua deionizzata e quindi con 1 L di 0,1% [w / v] Soluzione di concime. Mettere un seme di tabacco in ogni blocco lana minerale e delicatamente a filo con 0,25 L di soluzione fertilizzante senza lavare via il seme 16.
- Coltivare le piante di tabacco per 7 settimane in una serra con il 70% di umidità relativa, 16 hr fotoperiodo (180 mmol sec - 1 m - 2; λ = 400 - 700 nm) e un regime di temperatura 25/22 ° C luce / buio.
- Raccolto tutte le foglie, tranne le quattro foglie cotiledone, che si trovano alla base del fusto della pianta.
2. Opzionale: Heat precipitazione con Blanching
NOTA: Eseguire le operazioni descritte nei passaggi 2,1-2,12 allo scopo di precipitare operatori sanitari di tabacco da scottatura. Salta l'intera sezione 2, se saranno precipitati gli operatori sanitariin un recipiente riscaldato (sezione 4) o utilizzando uno scambiatore di calore (sezione 5).
- Mettere da parte 50 g di materiale vegetale ed effettuare l'estrazione senza scottatura (sezione 3). Prelevare un campione di questo estratto come controllo interno durante la successiva analisi (sezione 7).
- Impostare un bagno di 8-L volume di lavoro di acqua, ad esempio, 50 x 40 x 40 cm, in un secchio polistirolo espanso termicamente isolato o simili. Montare il termostato regolabile in bagno d'acqua per il controllo della temperatura successiva (passo 2,7).
- Trasferire l'intero gruppo su un piatto ancoretta magnetica e mettere un ancoretta magnetica nel bagno d'acqua. Assicurarsi che il campo magnetico è abbastanza forte per ruotare l'ancoretta.
- Circondano la ancoretta con almeno quattro mattonelle di supporto su cui un cestello in polipropilene (passo 2,6) sarà posto in seguito durante la procedura di sbiancamento. Assicurarsi che le piastrelle di supporto sono realizzati in un materiale non magnetico (per esempio, lega di acciaio inossidabile contenente nichel) e chesono superiori alla ancoretta (Figura 2).
- Aggiungere 8 L di acqua deionizzata per bagnomaria.
NOTA:. Utilizzando un buffer, per esempio, 50 mM sodio fosfato (pH 7,5), in grado di migliorare le rese di proteine bersaglio, se basse precipitazioni pH è un problema. - Inserire un cesto cm polipropilene 23 x 23 x 23 sulle piastrelle di supporto e assicurarsi che il cestello non interferisce con la rotazione ancoretta e che sia completamente immerso nel liquido. Se necessario, aggiungere altra acqua / buffer fino a quando il cestello è completamente sommerso, quindi rimuovere di nuovo il canestro.
ATTENZIONE: Tutte le successive fasi fino a 2.12 comportano la manipolazione di liquido caldo. Indossare dispositivi di protezione adeguati compresi i guanti isolati termicamente. - Utilizzare il termostato regolabile per portare bagnomaria a 70 ° C (o la temperatura desiderata per gli esperimenti). Attendere almeno 15 minuti dopo la temperatura desiderata viene raggiunta per garantire l'intero complesso ha raggiunto un thermal equilibrio.
- Preparare 150 g aliquote dalle foglie di tabacco raccolte. Mettere un'aliquota nel cestello evitando compressione irreversibile e danni alle foglie, ad esempio, per strappo. Evitare di riempire eccessivamente il cesto con materiale vegetale o densità della quest'ultima.
- Con attenzione ma subito immergere il cestello nel liquido caldo e posizionarlo sulle piastrelle di supporto. Posizionare un blocco di acciaio inox sulla parte superiore del cestello per prevenire il galleggiamento.
- Incubare le foglie per 5 minuti nel fluido scottatura, o selezionare un tempo atto a soddisfare il disegno sperimentale. Monitorare la temperatura del liquido durante l'intero periodo di incubazione.
- Rimuovere con cautela il cestello dal fluido sbiancamento e far scarico liquido residuo dalle foglie per 30 sec. Poi prendere la pianta lascia fuori del paniere, trasferirli al frullatore e iniziare subito l'estrazione (sezione 3).
NOTA: Le piante possono essere conservati per lunghi periodi di tempo dopo imbianchimento e prima dell'inizio di the di estrazione, ad esempio, più di 30 min in ghiaccio o congelati a -20 ° C per diverse settimane è stato testato con successo. Tuttavia, la stabilità del prodotto può diminuire con l'aumentare i tempi di conservazione e, quindi, si raccomanda l'elaborazione immediata. - Ripetere i passaggi 2,8-2,11 con materiale di foglia fresca fino a quando l'intera biomassa raccolta viene elaborato.
3. Proteine estrazione dalle foglie di tabacco
ATTENZIONE: I prossimi passi coinvolgere un frullatore con lame rotanti. Non lavorare nel secchio frullatore mentre è montato sul motore frullatore.
- Mettere 150 g (massa umida) di raccolta (passo 1.3) o scottati (passo 2.11) lascia nel frullatore e aggiungere 450 ml di tampone di estrazione (50 mm sodio fosfato, 500 mm di cloruro di sodio, 10 mM di sodio disolfito, pH 8,0).
NOTA: La composizione tampone di estrazione dipende proteina da estrarre e può quindi richiedere una regolazione, ad esempio, l'uso di un altro pH o buffer componente quale Trè. - Omogeneizzare le foglie per 3 x 30 impulsi sec con 30 secondi intervallati pause. Assicurarsi che le foglie sono omogeneizzati e non intasare il secchio frullatore. Fermare il frullatore e sollevare le foglie per evitare intasamenti, se necessario, e poi continuare l'omogeneizzazione.
- Prelevare un campione 1 ml di ciascun estratto che viene prodotto per la successiva analisi (sezione 7). Se il materiale vegetale s'imbianca, procedere alla sezione 6. Altrimenti continuare con precipitazione di calore in un recipiente (sezione 4) o scambiatore di calore (sezione 5), a seconda del metodo sperimentale selezionato.
4. Opzionale: Temperatura Precipitazione in un vaso mescolato
NOTA: Il comportamento delle operazioni descritte nei capitoli da 4.2 a 4.11, al fine di precipitare operatori sanitari del tabacco in un recipiente agitato. Salta l'intera sezione 4, se gli operatori sanitari sono stati precipitati da scottatura (sezione 2) o sarà precipitato utilizzando uno scambiatore di calore (sezione 5).
- Impostare due 8-L acqua volume di lavoroterme, ad esempio, 50 x 40 x 40 cm, in polistirolo isolato termicamente o simile. Nel primo bagno, montare il termostato regolabile per il controllo della temperatura successiva (passo 4.6). Nel secondo, aggiungere 5 L di acqua deionizzata e 2 kg di ghiaccio per raffreddamento successivo (passo 4.9).
- Trasferire il primo bagno di acqua su una piastra di agitazione magnetica, e posizionare il recipiente in acciaio inox 2-L nel bagno d'acqua tale che il centro del serbatoio è allineato al centro della piastra di agitazione.
- Posizionare un ancoretta magnetica nel recipiente di acciaio inox. Assicurarsi che il campo magnetico è abbastanza forte per ruotare l'ancoretta.
- Riempire la vasca con acqua deionizzata per 5 cm sotto il bordo superiore del contenitore in acciaio inossidabile. Poi riempire il vaso con tampone di estrazione. Mettere un coperchio polistirene espanso sulla nave.
ATTENZIONE: Tutte le successive fasi fino a 4,9 comportano la manipolazione di liquido caldo. Indossare dispositivi di protezione adeguati tra cui ins termicamenteGuanti ulated. - Inserire un termometro nel recipiente di acciaio inossidabile attraverso un foro adattandosi nel coperchio polistirolo espanso. Impostare la temperatura del bagno di acqua a 78 ° C e incubare l'intero gruppo per 15 minuti per raggiungere l'equilibrio termico. Assicurarsi che la temperatura nel serbatoio è di 70 ° C, circa 8 ° C inferiore alla soglia del bagnomaria.
- Se la temperatura nel recipiente di acciaio inossidabile differisce da 70 ° C, regolare la temperatura del bagno di acqua di conseguenza e lasciare che il sistema stabilizzi per altri 15 min. Ripetere questo passaggio finché la temperatura nel serbatoio è di 70 ° C o come richiesto per l'esperimento, e svuotare il contenitore in acciaio inossidabile.
- Versare 300 ml di estratto (passo 3.2) nel recipiente di acciaio inossidabile, mentre è ancora in bagnomaria e avviare un timer. Mescolare l'estratto a 150 rpm ed incubare per 5 min. Assicurarsi che l'estratto raggiunge una temperatura di 70 ° C per almeno 2 min durante questo periodo di incubazione.
- Rimuovere il bagno di acqua calda dal agitatore magnetico, estrarre il contenitore in acciaio inox e metterlo nel secchio di ghiaccio freddo. Posizionare quest'ultimo sul agitatore magnetico e rimuovere il coperchio polistirolo espanso.
- Assicurarsi che l'omogeneizzato pianta è ben agitata a 150 rpm, posizionare il termometro nell'estratto e incubare fino a raggiungere una temperatura di 20 ° C oppure la temperatura specificata dal disegno sperimentale.
- Ripetere i passaggi 4,7-4,9 per tutte le aliquote. Prelevare un campione 1 ml di ciascuna calore precipitato estratto una volta raggiunta la temperatura finale, quindi procedere con la sezione 6.
5. Opzionale: precipitazioni di calore in uno scambiatore di calore
NOTA: Il comportamento delle operazioni descritte nei capitoli 5.2 a 5.12 allo scopo di precipitare operatori sanitari tabacco utilizzando uno scambiatore di calore. Salta l'intera sezione 5, se gli operatori sanitari sono stati precipitati da scottatura (sezione 2) o in un recipiente riscaldato (sezione 4).
- Impostare due volumi di lavoro 8-Lbagni di acqua, ad esempio, 50 x 40 x 40 cm, in secchi in schiuma di polistirene termicamente isolati o simili. Nel primo bagno, montare il termostato regolabile per il controllo della temperatura successiva (passo 5.3). Nel secondo, aggiungere 5 L di acqua deionizzata e 2 kg di ghiaccio per raffreddamento successivo (passo 5.10).
ATTENZIONE: Tutte le successive fasi fino a 5,9 comportano la manipolazione di liquido caldo. Indossare dispositivi di protezione adeguati compresi i guanti isolati termicamente. - Riempire il primo bagno d'acqua con 8 L acqua deionizzata. Impostare la temperatura di 74,5 ° C mediante il termostato. Incubare il gruppo per 15 minuti per raggiungere l'equilibrio termico.
- Preparare un serbatoio di stoccaggio isolata mettendo un bicchiere di plastica da 0,5 L in un bicchiere di plastica 1-L e colmare le lacune con cotone idrofilo. In alternativa, utilizzare un contenitore isolato termicamente dedicato con un volume di lavoro di 0,5-L.
- Collegare lo scambiatore di calore alla pompa peristaltica ad una estremità e ad un tubo di scarico sul otheR finire con L / S 24 tubi. Inserire entrambe tubo termina con un termometro nel recipiente di accumulo coibentato e riempirlo con 300 ml di tampone di estrazione (figura 2).
- Posizionare lo scambiatore di calore nel bagno di acqua calda e avvia la pompa peristaltica ad una velocità di 300 ml min -1. Assicurarsi che la temperatura risultante nel recipiente è di 70 ° C, circa 4,5 ° C al di sotto del set point del bagno d'acqua, dopo 3 min.
- Se la temperatura nel recipiente-isolata differisce da 70 ° C, regolare la temperatura del bagno di acqua di conseguenza e lasciare che il sistema stabilizzi per altri 15 min. Ripetere questo passaggio finché la temperatura del tampone di estrazione aumenta da ambiente a 70 ° C in meno di 3 minuti, o pari a quella necessaria per l'esperimento, e svuotare il recipiente di acciaio inossidabile.
- Scartare il tampone di estrazione dalla nave isolata e preparare aliquote di 300 ml di estratto vegetale. Riempire il serbatoio coibentato con un'aliquota.
- Pompa l'estratto vegetale (punto 3.3) attraverso lo scambiatore di calore a 300 ml min -1 per 5 min. Assicurarsi che la temperatura estratto è 70 ° C dopo 3 min, o uguale alla temperatura definita nel disegno sperimentale.
- Dopo 5 min, posizionare lo scambiatore di calore in bagno d'acqua ghiacciata mentre l'estratto è ancora pompato. Incubare in questa impostazione finché la temperatura raggiunge esattamente 20 ° C, o la temperatura definita nel disegno sperimentale.
- Rimuovere il tubo di aspirazione collegato alla pompa peristaltica dal recipiente isolato e continuare a pompare a raccogliere estratto residuo impianto termico precipitato all'interno dello scambiatore di calore. Poi fermare la pompa.
- Ripetere i passaggi 5,7-5,10 per tutte le aliquote. Prelevare un campione da 1 ml di ciascun estratto calore precipitato una volta raggiunta la temperatura finale, quindi passare sugli estratti per filtrazione a sacco (punto 6).
NOTA: Dopo un primo ciclo passaggi attraverso 5.7 a 5.10 non ci sarà alcun tampone di estrazione pergettare nella fase 5.7.
6. Borsa filtrazione della Estratto di piante
- Montare un filtro a sacco nel cesto di supporto corrispondente che viene inserito nel corpo del filtro e fornisce supporto meccanico per il materiale filtrante flessibile. Collocare un recipiente 1-L sotto il canestro e applicare le aliquote estratto (sezione 3.3, 4.10 o 5.11 a seconda del trattamento termico selezionato) al sacchetto ad una velocità di 150 ml min -1.
- Dopo filtrazione, misurare la torbidità di una diluizione 1:10 del filtrato in tampone di estrazione usando il torbidimetro.
- Prelevare un campione 1 ml ed elaborare il filtrato sacchetto come definito nel disegno sperimentale, ad esempio, filtrazione di profondità e cromatografia 7,10.
Analisi 7. Campione
- Misurare la quantità di proteine totali solubili (TSP) utilizzando il metodo Bradford 24,25.
- In triplice copia, pipettare 2,5 ml di ogni campione nei singoli pozzetti di unapiastra a 96 pozzetti. Include otto albumina sierica bovina (BSA) norme in triplice copia che coprono la gamma di 0 - 2.000 mcg ml -1.
- Aggiungere 200 ml di reagente di Bradford in ogni pozzetto e mescolare accuratamente pipettando su e giù, ma abbastanza delicatamente per evitare la formazione di bolle.
- Incubare per 10 minuti a 22 ° C e misurare l'assorbanza a 595 nm in uno spettrofotometro. Calcolare la concentrazione TSP nei campioni sulla base di una curva standard per i punti di riferimento BSA.
- Quantificare Vax8 dalla risonanza plasmonica di superficie spettroscopia 26.
- Setup strumento risonanza plasmonica superficiale con 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) tampone di corsa (10 mM HEPES, 3 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1,500 mM cloruro di sodio, 0,05% v / v polisorbato 20, pH 7,4) e montare un chip di superficie destrano carbossimetilato nel dispositivo. Utilizzare la funzione primaria per lavare il sistema e avviare un ciclo manuale con una portata di 30min -1 microlitri su celle di flusso 1 e 2. Iniettare 30 mM cloruro di idrogeno due volte per 60 secondi con 60 secondi di iniezione intervallati di idrossido di sodio 25 mM.
- Preparare 200 ml di una 500 mcg ml -1 mAb 5,2 soluzione in acetato di sodio 10 mM (pH 4,0). Scongelare-etil-1 3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) e flaconi N -hydroxysuccinimide (NHS) e centrifugare a 16.000 xg per 1 min. Mescolare 70 ml di EDC con 70 ml di NHS e trasferire in una fiala di plastica da 7 mm.
- Attivare la superficie del chip superficie destrano carbossimetilata iniettando la miscela EDC / NHS sulle celle di flusso 1 e 2 per 10 minuti con una portata di 10 min microlitri -1.
- Impostare il percorso di flusso di fluire cella 2 soltanto. Coppia mAb 5.2 iniettando per 15 minuti ad una velocità di 10 ml min -1.
- Passare il percorso di flusso di fluire celle 1 e 2 e iniettare etanolammina per 7 minuti ad una velocità di 5 ml min -1 per disattivare la superficie. Tgallina iniettare acido cloridrico 30 mM due volte per 60 secondi con 60 secondi di iniezione intervallati di 25 mM sodio idrossido.
- Iniettare i campioni e MSP1 - 19 standard ad una velocità di 30 ml min -1 per 180 sec. Assicurarsi che la concentrazione Vax8 è 50 - 1000 ng ml -1. Preparare pre-diluizioni in soluzione salina tamponata HEPES contenente EDTA e polisorbato 20 (HBSEP) se necessario.
- Sottrarre il segnale di picco della cella di flusso 1 da quello della cella di flusso 2 e utilizzare la differenza per calcolare la concentrazione Vax8 in campioni sulla base del segnale del MSP 1 - iniezione 19 con una concentrazione di proteina nota di 500 ng ml -1.
- Rigenerare la superficie del chip dopo ogni campione o MSP 1 - 19 iniezione dall'esposizione a 30 mM di cloruro di idrogeno per 60 sec ad una portata di 30 ml min -1.
- Quantificare DsRed mediante spettrometria a fluorescenza
- In triplice copia, pipette 50 ml di ogni campione nelle singole pozzetti di una nera semi-arEA piastra a 96 pozzetti. Include sei standard DsRed che coprono la gamma 0 - 225 mcg ml -1.
- Misurare la fluorescenza in duplicato utilizzando un 530 ± 30 nm filtro di eccitazione ed un filtro di emissione 590 ± 35 nm in uno spettrofotometro. Calcolare la concentrazione DsRed nei campioni sulla base di una curva standard attraverso i punti di riferimento DsRed.
- Determinazione delle distribuzioni di dimensione delle particelle
- Lavare una cuvetta con 1 ml di isopropanolo e poi con 2 ml di acqua deionizzata per rimuovere le particelle di polvere. Pipettare 850 ml di campione nella cuvetta.
- Posizionare la cuvetta del potenziale e delle particelle analizzatore di dimensione zeta. Aprire il "Software" e iniziare una misurazione manuale con "proteine", come il materiale e "PBS" come il disperdente. Selezionare una temperatura di 25 ° C e un tempo di equilibrazione di 180 sec.
- Scegliere la cella "DTS0012" e misurare in 173 ° backscatter. Controllare il funct "auto"ione per la durata della misura e selezionare tre misurazioni senza ritardo intervallati.
- Analizzare la granulometria profilo di distribuzione picco volta completata la misurazione selezionando le tre misure del campione nella vista esperimento. Scegliere la scheda "Volume PSD".
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Representative Results
La precipitazione di calore delle proteine della cellula ospite tabacco da scottatura
La procedura di sbiancamento descritto nella sezione 2. è stato utilizzato con successo per far precipitare operatori sanitari da foglie di tabacco con 70 ° C, la riduzione del TSP del 96 ± 1% (n = 3), mentre il recupero fino al 51% della proteina bersaglio Vax8, aumentando così la sua purezza dal 0,1% al 1,2% prima della separazione cromatografica 16. Era anche possibile recuperare 83 ± 1% (n = 3) della fluorescenza proteine DsRed, aumentando la sua purezza dal 3,3% al 64,1%. La procedura scottatura è stato facilmente integrato in un sistema di estrazione e chiarificazione standard costituito da lavaggio biomassa, omogeneizzazione, filtrazione a sacco e filtrazione di profondità (Figura 1) 7. Preparare l'attrezzatura scottatura (Figura 2), ha aggiunto circa 5 minuti per il tempo di set-up per i dispositivi di chiarificazione, che prende abitualmente 20 min. Un altro 7 min è stato costretto a compiereil pallore delle foglie intatte oltre al tempo tipico di estrazione e chiarificazione di 45 min. Tuttavia, solo 2 min conto degli ulteriori 7 min era reale "hands-on" del tempo. Inoltre, brevi tempi di incubazione inferiori a 1 min, consentendo di ridurre il tempo di scottatura da 7 min a circa 3 min. Pertanto, scottare non solo aumenta la purezza iniziale di un prodotto di estratti vegetali grezzi, ma è anche rapidamente completata senza apparecchiature di processo aggiuntivi, offrendo così la possibilità di sostituire almeno una fase di cromatografia iniziale. La temperatura del bagno scottatura rimasto costante, cioè, <0,2 ° C fluttuazione, durante tutti gli esperimenti anche immediatamente dopo l'aggiunta di foglie raccolte che erano a temperatura ambiente. Questo assicurato il processo era ripetibile, cioè, un coefficiente medio di variazione del 17% (n = 24), in termini di riduzione TSP, rese di prodotto e capacità filtrante nelle successive fasi di chiarificazione (Figura 3 8 e filtro aiuti dopo borsa filtrazione 9, che può ripristinare o addirittura aumentare le capacità di filtro. Una temperatura di 60 ° C è sufficiente per eliminare 80 ± 3% (n = 3) degli operatori sanitari e aumentare Vax8 purezza 2,6 ± 0,1 volte (n = 3) senza compromettere la capacità del filtro. Pertanto, HCP rimozione dalla scottatura è compatibile con proteine bersaglio che hanno stabilità al calore moderato, cioè una temperatura di fusione inferiore a 70 ° C 27,28. Tuttavia, aumentando la temperatura a 70 ° C o più può provocare una rimozione HCP superiore al 95% (Figura 3). Era utile condurre la corrispondente serie di esperimenti in maniera ben progettato utilizzando un approccio statistico 22 perché questo ha permesso l'identificazione rapida dei più rparametri Elevant di processo, vale a dire, il tempo di riscaldamento e la temperatura. Allo stesso tempo, il metodo DoE generato un modello predittivo per facilitare l'ottimizzazione dei processi 16.
Figura 2: Configurazione schematica di tre metodi per precipitare Tabacco operatori sanitari in lascia intatto o estratti A. imbiancamento è stata effettuata in un bagno d'acqua riscaldata con un termostato (T) in cui è stato sommerso un cestino contenente foglie intatte.. Il bagno d'acqua era agitata per garantire una temperatura omogenea e costante. B. Un recipiente contenente una ancoretta magnetica e foglia estratto è stato sommerso in un bagno d'acqua. La temperatura nella estratto è stato verificato che la temperatura desiderata è stata raggiunta. C. Uno scambiatore di calore (H) è stato collegato ad una pompa (P) e un storag termicamente isolatoe recipiente contenente l'estratto vegetale. Lo scambiatore di calore è stato immerso in un bagno di acqua e la temperatura dell'estratto riscaldato è stata monitorata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: confronto tra tre termico di precipitazione metodi che mostrano il loro effetto sulle prestazioni del processo e la purificazione di due proteine bersaglio A.. Condizioni sostengono la rimozione di oltre il 90% degli operatori sanitari sono stati identificati per scottatura, un recipiente agitato e una configurazione scambiatore di calore, tutti che ha aumentato la purezza delle proteine bersaglio Vax8 e DsRed da un minimo di 2,5 volte e un massimo di 19 fold, con scottatura esecuzione migliore. Al contrario, soltanto la configurazione dell'imbarcazione agitata aumentato la capacità del subseqpasso confluente profondità di filtrazione utilizzato per chiarire le piante o estratti trattati termicamente. Le barre di errore indicano la deviazione standard (n = 3). B. Il contenuto HCP di campioni dopo diverse condizioni di trattamento termico può essere analizzato e confrontato con gel di poliacrilammide Coomassie-macchiati. Rubisco (frecce verdi) viene rimosso insieme ad altri operatori sanitari, come la temperatura durante gli aumenti di trattamento termico, mentre DsRed (freccia rossa) rimane in soluzione. * Indica un campione che è stato esposto al calore per 0,5 minuti, tutti gli altri campioni sono stati trattati per 3.0 minuti o più. Re-stampa con il permesso di 16. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Precipitazioni calore degli operatori sanitari in un recipiente agitato
Un recipiente agitato per precipitazione calore rimosso un massimo di 84 ± 1% (n = 3) operatori sanitari, ottenendo una purezza of 0,33 ± 0,02% (n = 3) per Vax8 e 20,2 ± 1,4% (n = 3) per DsRed (Figura 3). Il trattamento termico è stata effettuata in un recipiente separato dal omogeneizzatore per evitare ritardi riflettono occupazione dispositivo quando trattare più campioni in serie. Lo sforzo richiesto per gestire il processo di scala di laboratorio era simile a quello per imbiancamento ma occorresse un contenitore in acciaio inossidabile aggiuntivo e una fase di raffreddamento dedicato. Inoltre, il trasferimento di calore per l'estratto è stato più lento che durante la scottatura, con tempi di incubazione di almeno 5 minuti, vale a dire, 10 volte di più rispetto a scottare. Il riscaldamento ritardo è stato causato dalla nave, che pone un ulteriore ostacolo allo scambio di calore, e la massa ~ 300% maggiore che era riscaldata nel recipiente per la presenza di tampone di estrazione in aggiunta alla biomassa vegetale. Precipitante proteine anche aderito alle pareti del recipiente, costruendo gradualmente una barriera trasferimento di calore supplementare e aumentare lo sforzorichiesto per la successiva pulizia. Regolazione della temperatura del bagnomaria e 8 ° C al di sopra della temperatura utilizzata per la precipitazione di calore compensato le perdite di energia nel sistema parzialmente aperta e ha raggiunto la temperatura desiderata estratto. In contrasto scottatura (sezione 2) e la configurazione dello scambiatore di calore (punto 5), HCP precipitazione in un recipiente aumentato la capacità di filtrazione di profondità a valle da 2,5 volte, riflettendo le forze di taglio inferiori della nave rispetto al pompaggio estratto attraverso il calore scambiatore o omogeneizzazione dopo scottatura, probabilmente conseguente aggregati più grandi che erano più facili da rimuovere nella fase sacchetto di filtrazione.
Precipitazione calore degli operatori sanitari in uno scambiatore di calore
Circa 88,3 ± 0,7% (n = 12) del contenuto HCP era costantemente rimossi dall'estratto mediante uno scambiatore di calore all'interno del campo di temperatura 60 - 70 ° C, ottenendo una purezza di 0,31 ± 0,01% (n = 12) per Vax8 e 27.6 ± 2,0% (n = 12) per DsRed (Figura 3). Il coefficiente medio di variazione è stata del 13% (n = 24), indicando che la ripetibilità di questa procedura era anche meglio di scottatura. La temperatura estratto desiderato è stato raggiunto dopo ~ 3 min se la temperatura del bagnomaria stata impostata 4,5 ° C più elevata. Per quanto riguarda la pozza riscaldata, una fase di raffreddamento dedicato è richiesto dopo il trattamento termico. Lo scambiatore di calore ha coinvolto uno sforzo maggiore maneggevolezza rispetto agli altri metodi in quanto il dispositivo di pompaggio e scambiatore di calore necessaria una pulizia approfondita causa il precipitato che aderisce alle pareti del foro stretto tubo di acciaio inossidabile. Lo scambiatore di calore realizzato anche la capacità del filtro di profondità valle disponibilità, chiarendo solo il 13,5 ± 6,0 (n = 3) L m -2 prima intasamento.
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Discussion
I tre metodi per la precipitazione di calore sopra descritti possono rimuovere efficacemente operatori sanitari tabacco prima di ogni fase di purificazione cromatografica 16,17. Esse completano altre strategie che mirano ad aumentare la purezza iniziale del prodotto, ad esempio, guttazione 29, rhizosecretion 30 o centrifuga estrazione 31,32, che sono tutti limitati alle proteine secrete. Tuttavia, i metodi di calore a base possono essere usati solo in modo significativo se la proteina bersaglio da purificare in grado di sopportare la temperatura minima precipitazione di ~ 60 ° C per più di 1 min. Pertanto, il primo passo in qualsiasi dei tre metodi è quello di progettare una molecola bersaglio con una temperatura sufficientemente elevata di fusione, che è stato descritto per diverse proteine candidato vaccino malaria costituiti da diversi domini da vari Plasmodium falciparum antigeni 16,18,21. Una volta che la stabilità termica della proteina bersaglio è stata dimostrata, unodei tre metodi possono essere selezionati in base ai dispositivi disponibili e dei media, scala processo finale anticipato e le successive operazioni di DSP 16.
Blanching stato il più veloce dei metodi e dei requisiti delle apparecchiature supplementari sono state minime, in modo che possa essere facilmente implementato in protocolli di purificazione su scala di laboratorio esistenti per proteine ricombinanti di origine vegetale. Un'accurata agitazione del liquido scottatura è un parametro di processo importante che influisce sull'efficienza della HCP precipitazione basato su entrambi i dati empirici e calcoli teorici 21,33. Non riuscendo a ottenere una buona miscelazione può compromettere il trasferimento di calore e di conseguenza solo la rimozione HCP parziale, che a sua volta può essere dannoso per il prodotto se proteasi ospitanti rimangono attivi 21,34. Molti altri parametri possono anche influenzare la precipitazione HCP, ad esempio, il tempo di temperatura di riscaldamento e di incubazione, e un approccio DoE possono quindi essere utili per caratterizzare la fa più rilevantectors e fornire modelli predittivi per quantificare i loro effetti sulle risposte, come la purezza del prodotto, il recupero e la performance della successiva DSP passi 22.
Nella messa a punto dell'imbarcazione, tempi di incubazione più lunghi sono stati necessari per ottenere la completa precipitazione HCP e questo può aumentare la probabilità di denaturazione delle proteine bersaglio indesiderabile che riflette l'esposizione prolungata a temperature elevate. Più accurata miscelazione nel recipiente potrebbe migliorare il trasferimento di calore e ridurre la durata del riscaldamento. La rampa di temperatura a lungo in questa configurazione può anche essere difficile se proteasi nell'estratto 21,34 diventano più attivi prima di inattivazione termico finale, causando perdite di prodotto.
L'aumento della capacità di filtro di profondità osservato per la messa a punto nave può aiutare a ridurre i costi di consumo, consentendo un maggior numero di campioni da trattare in un progetto con un budget fisso o ridurre i requisiti complessivi di finanziamento per un dato insieme di sperimEnt. Tuttavia tale prestazione può essere controbilanciato dal costo del vaso addizionale, necessaria in aggiunta al omogeneizzatore per impedire l'introduzione di passi di processo hold se sono necessarie diverse piste di estrazione in una serie di esperimenti, per esempio, come parte di un DoE approccio. L'effetto positivo sulla capacità del filtro può anche diminuire se un regime di miscelazione più intensivo viene utilizzato per ridurre i tempi di riscaldamento come suggerito sopra.
Una fase di raffreddamento dedicato è necessario per entrambi i metodi di precipitazione calore estratto a base, richiede non solo risorse supplementari ma anche prolungando il tempo di lavorazione generale per campione, che può anche contrastare con le procedure DoE fluenti o sequenze sperimentali in generale. La configurazione scambiatore di calore è ben caratterizzato dal punto di vista tecnico 35 e può essere facilmente progettato in scala e per differenze di temperatura specifici, in contrasto alla nave, la cui superficie-volume rapporto cambia durante scala up. Comemai, una volta che la dimensione dello scambiatore di calore è definito, può essere difficile per adattarsi alle differenze di temperatura alternative perché la sua lunghezza e quindi l'area di trasferimento di calore sono fissi.
Modifica altri parametri, quali il tempo di permanenza (o la portata) e la temperatura del fluido scambiatore di calore, può ripristinare la flessibilità ad un certo grado, ma solo in esperimenti su piccola scala perché questi fattori sono tipicamente azionati in finestre strette in operazioni su scala processo dovuti alle restrizioni imposte dal attrezzature e mezzi di comunicazione. La richiesta di una combinazione di brevi tempi di incubazione di 3 - 5 min e una differenza di temperatura di 40 - 60 ° C diventa sempre più difficile da risolvere a livello di dispositivo all'aumentare della scala processo perché le dimensioni dello scambiatore di calore diventano più grandi. Ciò è particolarmente vero per la fase di raffreddamento perché la differenza di temperatura tra il mezzo e la temperatura estratto desiderata è spesso più piccoli (DT = 10-15 ° C)rispetto alla fase di riscaldamento (DT = 20-40 ° C) con conseguente grandi dimensioni dell'apparecchiatura o più volte defaticamento.
In futuro, il protocollo può essere adattato alle proteine biofarmaceutiche diversi vaccini candidati che in questo studio sono stati specificamente progettati per stabilità termica. Molti anticorpi possono sopportare temperature> 70 ° C 36,37 che è già compatibile con il protocollo di trattamento termico corrente. Questa stabilità termica naturale può essere aumentata ulteriormente progettando i diversi domini anticorpali 38, aumentando così il numero di proteine che possono essere sottoposti al metodo (e sue varianti) qui presentata. Il metodo di sbiancamento è già stato applicato a piante di tabacco transgeniche che esprimono un anticorpo monoclonale (2G12) 17, che non è stato oggetto di selezione per la stabilità termica o ingegneria proteica. Il trattamento termico a 65 ° C ha aumentato la purezza dell'anticorpo di un fattoredue prima di purificazione cromatografica, mentre la ripresa è stata simile a quella osservata, senza scottatura.
Inoltre, caratterizzano le singole temperature HCP fusione di un sistema di espressione potrebbe all'identificazione degli temperatura con cui il processo potrebbe essere condotta simile alla pastorizzazione del latte: temperatura elevata, poco tempo 39. Il trattamento termico (eccetto scottatura) può essere applicato anche ad altre materie prime biologiche per rimuovere operatori sanitari se il prodotto può sopportare le temperature necessarie. Quest'ultimo può differire da quelli discussi qui se altre piattaforme di espressione, come mammiferi supernatanti di coltura cellulare sono in fase di elaborazione. In ogni caso, il costo-benefici rapporto dovrebbe essere presa in considerazione, cioè, fa il beneficio di livelli HCP ridotte superano il costo per l'attuazione di una fase di trattamento termico che causa costi di investimento aggiuntivi, aumenta il tempo di processo e può ridurre il Yie prodottold 16. Un parametro critico in questo contesto è l'attività del prodotto. Se dipende dalla presenza di epitopi lineari come ad alcuni vaccini a base di proteine, quindi il trattamento termico non dovrebbe avere un effetto 40. Al contrario, se la struttura della proteina è importante, per esempio, per epitopi conformazionali, l'orientamento preciso di catene laterali di aminoacidi in sito attivo di un enzima o il corretto ripiegamento di anticorpi complementarità determinazione regioni, un trattamento termico possono interferire con l'attività della proteina 41,42. Pertanto, saggi di analisi adatti dovrebbero essere stabiliti per monitorare le prestazioni del prodotto prima e dopo il trattamento termico.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
| Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
| Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
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