Summary
Três métodos de precipitação de calor são apresentados de forma eficaz que remova mais do que 90% de proteínas da célula hospedeira (HCPs) a partir de tabaco extrai antes de qualquer outro passo de purificação. A planta HCPs agregar irreversivelmente a temperaturas superiores a 60 ° C.
Abstract
As plantas que não só fornecem alimentos, rações e matérias-primas para os seres humanos, mas também foram desenvolvidos como um sistema económico para a produção de proteínas biofarmacêuticos, tais como anticorpos, vacinas candidatas e enzimas. Estes devem ser purificada a partir da biomassa da planta, mas etapas de cromatografia são prejudicados pelas concentrações elevadas de proteínas da célula hospedeira (HCPs) em extractos de plantas. No entanto, a maioria dos profissionais de saúde agregar irreversivelmente a temperaturas superiores a 60 ° C facilitam a purificação posterior da proteína alvo. Aqui, são apresentados três métodos para conseguir a precipitação de calor de profissionais de saúde do tabaco em folhas, quer intactos ou extractos. O branqueamento de folhas intactas podem ser facilmente incorporados nos processos existentes, mas pode ter um impacto negativo sobre as etapas de filtração subsequentes. O oposto é verdadeiro para a precipitação de calor de extratos de folhas em um vaso agitado, o que pode melhorar o desempenho das operações a jusante embora com grandes mudanças no design de equipamento de processo, tais comogeometria homogeneizador. Por fim, uma configuração de permutador de calor está bem caracterizada em termos de condições de transferência de calor e fácil à escala, mas a limpeza pode ser difícil e pode haver um impacto negativo sobre a capacidade do filtro. A abordagem de design-de-experiências pode ser utilizada para identificar os parâmetros de processo mais importantes que afectam a remoção de HCP e recuperação do produto. Isto facilita a aplicação de cada método em outras plataformas de expressão e na identificação de o método mais adequado para uma dada estratégia de purificação.
Introduction
Modernos sistemas de saúde dependem cada vez mais proteínas biofarmacêuticas 1. Produzindo estas proteínas em plantas é vantajoso devido à carga patógeno baixo e escalabilidade maior em comparação com os sistemas de expressão convencionais 2-4. No entanto, o processamento a jusante (DSP) de produtos farmacêuticos derivados de plantas pode ser um desafio, porque os procedimentos de extração disruptivas resultar em uma carga de partículas de alta, com turbidez superior a 5.000 unidades nefelométrico de turbidez (NTUs) e proteína da célula hospedeira (HCP) concentrações muitas vezes superior a 95 % [m / m] 5,6.
Processos de clarificação elaborados são necessários para remover as partículas dispersas 7-9, mas o equipamento de cromatografia é menos dispendioso para operar em modo de ligação e-eluem durante a recuperação inicial do produto, se houver um passo anterior para a remoção eficiente dos profissionais de saúde 10,11. Isto pode ser conseguido quer por precipitação da proteína alvo usando flocculformigas 12 ou baixo pH 13,14, bem como fazendo com que os profissionais de saúde para agregar. A agregação selectiva da ribulose-1,5-bifosfato-carboxilase / oxigenase (RuBisCO), a HCP mais abundante nas plantas verdes, tais como o tabaco (Nicotiana tabacum), pode ser promovida através da adição de polietilenoglicol 15, mas isso é caro e incompatível com grande fabricação -scale. O tratamento térmico tem sido demonstrado para desnaturar e precipitar mais de 95% dos profissionais de saúde do tabaco, enquanto vacinas candidatas contra a malária proteína, tais como Vax8 permanecer estável na solução 16-18.
Três diferentes abordagens foram usadas para conseguir a precipitação induzida pelo calor de profissionais de saúde do tabaco: (i) de branqueamento, isto é, a imersão das folhas intactas no estado líquido quente, (ii) uma temperatura controlada agitada recipiente, e (iii) um permutador de calor ( A Figura 1) 16. Para as folhas intactas, o branqueamento conseguida a precipitação rápida e eficiente dos profissionais de saúde e também foi fácilampliar e compatível com processos de fabricação em grande escala existentes que incluem um passo inicial para lavar a biomassa vegetal 19. Em contraste, vasos de temperatura controlada já estão disponíveis em alguns processos e pode ser utilizado para o tratamento térmico de extractos de plantas 20, mas a sua escalabilidade e taxa de transferência de energia são limitados porque a razão de superfície para volume dos tanques é progressivamente reduzida e torna-se inadequada em escala processo. Um permutador de calor é uma alternativa tecnicamente bem definido para aquecida vasos agitados mas requer um fornecimento abundante de meios de aquecimento e arrefecimento, por exemplo, de vapor e de água fria, assim como uma taxa de fluxo volumétrica rigidamente controlado, que é adaptada à geometria do permutador de calor e propriedades de mídia, por exemplo., a capacidade de calor específico. Este artigo mostra como todos os três métodos podem ser usados para a precipitação induzida pelo calor de tabaco, os profissionais de saúde e os profissionais de saúde da planta em geral. A criação e funcionamento de each método em um ambiente de laboratório pode ser usado para avaliar a sua aptidão para processos de grande escala. O grande desafio é identificar modelos de escala para baixo adequados e condições de funcionamento para cada operação que se parecem com os dispositivos e condições utilizadas durante a fabricação em escala processo. Os dados aqui apresentados referem-se a experiências conduzidas com plantas de tabaco transgénicas que expressam a vacina candidata malária Vax8 e proteína fluorescente DsRed 16, mas o método também tem sido aplicada com sucesso a N. benthamiana plantas que expressam transitoriamente outras proteínas biofarmacêuticas 21.
Um projeto-de-experimentos (DOE) aproximar 22 pode facilitar o desenvolvimento de processos, e floculantes 23 também pode ser benéfico, neste contexto, como descrito anteriormente 8. A principal diferença entre o branqueamento, reservatórios aquecidos e permutadores de calor é que o branqueamento é aplicado a folhas intactas no início do processo ao passo que o OTdela são aplicados aos extractos de plantas (Figura 1).
Figura 1:. Esquema de Fluxo do Processo Ilustrando a implementação de três métodos diferentes para Tobacco HCP Calor Precipitation O material vegetal é lavado e homogeneizadas antes de clarificação e purificação. O equipamento para a etapa de branqueamento (vermelho) podem ser facilmente adicionados à maquinaria existente. Em contraste, usando um recipiente com agitação (laranja) e, especialmente, um permutador de calor (azul) requer um ou vários dispositivos e tubos adicionais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultive as plantas de tabaco
- Lavar cada bloco de lã mineral com 1 a 2 L de água desionizada e, subsequentemente, com 1 L de 0,1% [W / v] solução de fertilizante. Coloque uma semente de tabaco em cada bloco de lã mineral e suavemente nivelado com 0,25 L de solução de fertilizante sem lavar a descendência 16.
- Cultivar as plantas de tabaco para 7 semanas em casa de vegetação com 70% de umidade relativa, fotoperíodo de 16 horas (180 pmol sec - 1 m - 2; λ = 400 - 700 nm) e um regime de temperatura 25/22 ° C claro / escuro.
- Colher todas as folhas excepto das quatro folhas cotiledonares, que estão localizados na base do caule da planta.
2. Opcional: Calor Precipitation pelo descascamento
NOTA: Executar as etapas descritas nos passos 2,1-2,12 para precipitar os profissionais de saúde do tabaco por branqueamento. Ir toda a seção 2, se os profissionais de saúde será precipitadoem um recipiente aquecido (seção 4) ou utilizando um permutador de calor (seção 5).
- Separe 50 g de material vegetal e realizar a extração sem branqueamento (seção 3). Tomar uma amostra deste extrato como um controlo interno durante a análise subsequente (secção 7).
- Configurar um banho de 8-L volume de trabalho de água, por exemplo, 50 x 40 x 40 cm, em um balde de espuma de poliestireno termicamente isolados ou similar. Montar o termostato ajustável no banho de água para controle de temperatura subsequente (passo 2.7).
- Transferir toda a montagem sobre uma placa de agitação magnética e colocar uma barra de agitação magnética no banho de água. Certifique-se de que o campo magnético é suficientemente forte para girar a barra de agitação.
- Cercar a barra de agitação com pelo menos quatro peças de suporte sobre o qual uma cesta de polipropileno (passo 2.6) serão colocados mais tarde, durante o processo de branqueamento. Certifique-se de que as peças de suporte são feitos de um material não magnético (por exemplo, liga de aço inoxidável contendo níquel) e que elessão mais elevada do que a barra de agitação (Figura 2).
- Adiciona-se 8 L de água desionizada ao banho de água.
NOTA:. Usando um tampão, por exemplo, fosfato de sódio 50 mM (pH 7,5), pode aumentar consideravelmente a quantidade de proteína alvo se baixa o pH de precipitação é um problema. - Coloque um centímetro cesto de polipropileno de 23 x 23 x 23 sobre as telhas de suporte e certificar-se de que o cesto não interfira com a rotação da barra de agitação, e que é totalmente submersa no líquido. Se necessário, adicione água / tampão adicional até que a cesta está totalmente submersa, em seguida, retire o cesto novamente.
CUIDADO: Todos os passos subsequentes até 2,12 envolvem a manipulação de líquido quente. Usar equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas de isolamento térmico. - Utilizar o termostato ajustável para trazer o banho de água a 70 ° C (ou a temperatura necessária para as experiências). Aguardar pelo menos 15 minutos após a temperatura desejada seja atingida para garantir todo o conjunto tenha atingido uma thermal equilíbrio.
- Preparar alíquotas de 150 g de folhas de tabaco colhidas. Colocar uma alíquota para o cesto de compressão, evitando danos irreversíveis e para as folhas, por exemplo, por rasgamento. Evitar o enchimento excessivo do carrinho com material vegetal ou uma embalagem densa do último.
- Cuidadosamente mas rapidamente submergir a cesta no líquido quente e colocá-lo sobre as telhas de apoio. Coloque um bloco de aço inoxidável na parte superior da cesta para impedir a flutuação.
- Incubar as folhas para 5 min no fluido branqueamento, ou selecione um tempo adequando o projeto experimental. Monitorar a temperatura do líquido durante todo o período de incubação.
- Remova cuidadosamente o cesto do fluido de branqueamento e deixe escorrer líquido residual a partir das folhas por 30 s. Em seguida, tomar as folhas da planta do cesto, transferi-los para o liquidificador e iniciar imediatamente a extração (seção 3).
NOTA: As plantas podem ser mantidos por períodos de tempo prolongados após branqueamento e antes do início do the extracção, por exemplo, mais de 30 min em gelo ou congelado a -20 ° C durante várias semanas foi testado com sucesso. No entanto, a estabilidade do produto pode diminuir com o aumento do tempo de armazenamento e assim processamento imediato é recomendado. - Repita os passos 2,8-2,11 com material de folha fresca até que toda a biomassa colhida é processada.
3. Extração de proteínas de folhas de tabaco
ATENÇÃO: Os próximos passos envolvem um liquidificador com lâminas rotativas. Não trabalhar no balde misturador, enquanto que está montado no motor misturador.
- Colocar 150 g (massa húmida) de colheita (passo 1.3) ou branqueados (passo 2.11) folhas no misturador e adicione 450 ml de tampão de extracção (fosfato de sódio 50 mM, cloreto de sódio 500 mM, bisulfito de sódio a 10 mM, pH 8,0).
NOTA: A composição do tampão de extracção depende da proteína a ser extraída e pode, assim, requerer um ajuste, por exemplo, o uso de um outro tampão de pH ou componente tal como Tré. - Homogeneizar as folhas para 3 x 30 pulsos segundos com 30 segundos intercalados breaks. Certifique-se que as folhas são homogeneizada e não entopem o balde liquidificador. Parar o liquidificador e retire as folhas para evitar o entupimento, se necessário, e depois continuar a homogeneização.
- Tomar uma amostra de 1 ml de cada extracto que é produzido para posterior análise (secção 7). Se o material vegetal é empalideceu, continuam a secção 6. Caso contrário, continue com a precipitação de calor num recipiente (seção 4) ou trocador de calor (seção 5), dependendo da abordagem experimental selecionado.
4. Opcional: Calor Precipitation em um recipiente agitado
NOTA: Realizar os passos descritos nas secções 4.2 a 4.11, a fim de precipitar os profissionais de saúde do tabaco num vaso agitado. Ir toda a secção 4, se os profissionais de saúde têm sido precipitada por branqueamento (seção 2), ou vai ser precipitado utilizando um permutador de calor (seção 5).
- Configurar dois 8-L de água volume de trabalhobanhos, por exemplo, 50 x 40 x 40 cm, em espuma de poliestireno isolada termicamente ou semelhante. No primeiro banho, montar o termostato regulável para controle de temperatura subsequente (passo 4.6). Na segunda, adicionam-se 5 L de água desionizada e 2 kg de gelo para arrefecimento subsequente (passo 4.9).
- Transferir o primeiro banho de água sobre uma placa de agitação magnética, e colocar o recipiente de aço inoxidável de 2 L para o banho de água de tal modo que o centro do recipiente está alinhado com o centro da placa de agitação.
- Colocar uma barra de agitação magnética no recipiente de aço inoxidável. Certifique-se de que o campo magnético é suficientemente forte para girar a barra de agitação.
- Encher o banho de água com água de s ionizada a 5 cm abaixo do bordo superior do recipiente de aço inoxidável. Em seguida, encher o navio com tampão de extração. Colocar uma tampa de espuma de poliestireno na embarcação.
CUIDADO: Todos os passos subsequentes até 4,9 envolvem a manipulação de líquido quente. Usar equipamento de protecção individual adequado, incluindo ins termicamenteluvas povoadas. - Insira um termómetro no recipiente de aço inoxidável através de um buraco adequando na tampa de espuma de poliestireno. Regule a temperatura do banho de água a 78 ° C e incubar todo o conjunto por 15 min para atingir o equilíbrio térmico. Certifique-se de que a temperatura no recipiente é de 70 ° C, a cerca de 8 ° C abaixo do ponto de o banho de água regulado.
- Se a temperatura no recipiente de aço inoxidável varia entre 70 ° C, ajustar a temperatura do banho de água em conformidade e deixar o sistema equilibrar durante mais 15 min. Repetir este passo até que a temperatura no recipiente é de 70 ° C ou como necessário para a experiência, e esvaziar o recipiente de aço inoxidável.
- Pour 300 ml de extracto (passo 3.2), para dentro do vaso de aço inoxidável, enquanto ele ainda está no banho de água e iniciar um temporizador. Agita-se o extracto a 150 rpm e incubar durante 5 min. Assegure-se que o extracto a uma temperatura de 70 ° C durante pelo menos 2 minutos, durante este período de incubação.
- Remova o banho de água quente a partir do agitador magnético, tirar o recipiente de aço inoxidável e colocá-lo no balde gelado. Coloque esta última sobre o agitador magnético e remover a tampa de espuma de poliestireno.
- Certifique-se de que o homogenato planta é bem agitado a 150 rpm, colocar o termómetro no extracto e incubar até que ele atinja uma temperatura de 20 ° C ou à temperatura especificada pelo desenho experimental.
- Repita os passos de 4,7-4,9 para todas as alíquotas. Tomar uma amostra de 1 ml de cada calor precipitado extrair uma vez que atingiu a temperatura final, em seguida, continue com a secção 6.
5. Opcional: Precipitação de calor num permutador de calor
NOTA: Realizar os passos descritos nas secções 5.2 a 5.12, a fim de precipitar os profissionais de saúde do tabaco usando um permutador de calor. Ir toda a seção 5, se os profissionais de saúde têm sido precipitada por branqueamento (seção 2), ou em um recipiente aquecido (secção 4).
- Configurar dois volumes de trabalho de 8 Lbanhos de água, por exemplo, 50 x 40 x 40 cm, em baldes de espuma de poliestireno termicamente isolados ou similar. No primeiro banho, montar o termostato regulável para controle de temperatura subsequente (passo 5.3). Na segunda, adicionam-se 5 L de água desionizada e 2 kg de gelo para arrefecimento subsequente (passo 5.10).
CUIDADO: Todos os passos subsequentes até 5,9 envolvem a manipulação de líquido quente. Usar equipamento de protecção individual adequado, incluindo luvas de isolamento térmico. - Encha o primeiro banho de água com 8 L de água deionizada. Regule a temperatura para 74,5 ° C usando o termostato. Incubar a montagem por 15 min para atingir o equilíbrio térmico.
- Preparar um recipiente de armazenamento isolado por colocação de um 0,5-G em copo de plástico de 1 L de copo de plástico e preencher as lacunas com lã de algodão. Em alternativa, utilizar um recipiente termicamente isolado dedicado com um volume de trabalho de 0,5-G.
- Ligue o permutador de calor para a bomba peristáltica, a uma das extremidades e a uma mangueira de saída no outrr acabam utilizando L / S 24 tubos. Coloque as duas extremidades da tubagem juntamente com um termómetro no recipiente de armazenamento isolado e encha-o com 300 ml de tampão de extracção (Figura 2).
- Colocar o permutador de calor para o banho de água quente e ligar a bomba peristáltica a um caudal de 300 ml min -1. Certifique-se de que a temperatura resultante no vaso a 70 ° C, cerca de 4,5 ° C abaixo do ponto de o banho de água regulado, após 3 min.
- Se a temperatura no vaso isolado difere de 70 ° C, ajustar a temperatura do banho de água em conformidade e deixar o sistema equilibrar durante mais 15 min. Repetir este passo até que a temperatura do tampão de extracção aumenta desde a ambiente até 70 ° C em menos de 3 minutos, ou igual que o requerido para a experiência, e esvaziar o recipiente de aço inoxidável.
- Descartar o tampão de extracção a partir do vaso isolado e preparar aliquotas de 300 ml de extracto de planta. Encher o reservatório isolado com uma alíquota.
- Bombear o extrato da planta (secção 3.3) através do trocador de calor em 300 ml min -1 por 5 min. Certifique-se de que a temperatura do extracto é de 70 ° C, após 3 minutos, ou é igual à temperatura definida no desenho experimental.
- Após 5 min, colocar o permutador de calor para o banho de água gelada enquanto que o extracto ainda está a ser bombeado. Incubar em esta configuração até que a temperatura atinja exactamente 20 ° C, ou a temperatura definida no desenho experimental.
- Remover o tubo de entrada ligado à bomba peristáltica a partir do vaso isolado e continuar a bombear para recolher extracto vegetal precipitado com calor residual a partir de dentro do permutador de calor. Em seguida, parar a bomba.
- Repita os passos 5,7-5,10 para todas as alíquotas. Tomar uma amostra de 1 ml de cada extracto precipitou-calor, uma vez que atingiu a temperatura final, em seguida, passar os extratos para filtração saco (secção 6).
NOTA: Depois de um primeiro ciclo de passos através de 5,7-5,10 não haverá tampão de extracção dedescartar no passo 5.7.
6. Bag filtração do Extrato vegetal
- Montar um filtro de saco para o cesto de suporte correspondente, o qual é montado no alojamento do filtro e proporciona suporte mecânico para o material de filtro flexível. Colocar num recipiente de 1 L por baixo do cesto e aplicam-se as alíquotas de extracção (a secção 3.3, 4.10 ou 5.11, dependendo do tratamento térmico) seleccionado para o saco a uma taxa de 150 ml min -1.
- Após filtração, medir a turbidez de uma diluição 1:10 de filtrado em tampão de extracção usando o turbidímetro.
- Retirar uma amostra de 1 ml e processar o filtrado saco como definido na concepção experimental, por exemplo, filtrao em profundidade e 7,10 cromatografia.
Análise 7. Amostra
- Medir a quantidade de proteína total solúvel (TSP), utilizando o método de Bradford 24,25.
- Em triplicado, pipetar 2,5 mL de cada amostra para os poços de uma únicaplaca de 96 poços. Incluir oito albumina de soro bovino (BSA) padrões, em triplicado, cobrindo a faixa de 0 - 2000 ng ml-1.
- Adicionar 200 mL de reagente Bradford a cada poço e misture bem por pipetagem cima e para baixo, mas com cuidado suficiente para evitar a formação de bolhas.
- Incubar durante 10 min a 22 ° C e mede-se a absorvância a 595 nm num espectrofotómetro. Calcular a concentração de TSP nas amostras com base na curva padrão através de um dos pontos de referência de BSA.
- Quantificar Vax8 por ressonância de plasma de superfície espectroscopia 26.
- Configuração do instrumento de ressonância plasmónica de superfície com 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) correndo tampão (HEPES 10 mM, ácido etilenodiaminotetraacético 3 mM (EDTA), cloreto de sódio 1,500 mM, 0,05% v / v de polissorbato 20, pH 7,4) e montagem de superfície de um chip de dextrano carboximetilado para dentro do dispositivo. Use a função primordial para limpar o sistema e iniciar uma execução manual com um caudal de 30ul min -1 em relação às células de fluxo 1 e 2. Injectar 30 mM de cloreto de hidrogénio duas vezes durante 60 segundos com uma injecção intercaladas 60 seg de hidróxido de sódio a 25 mM.
- Preparar 200 ul de uma 500 ng ml-1 de solução de mAb 5,2 em acetato de sódio 10 mM (pH 4,0). Descongelar 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida frascos (NHS) e centrifugar para a 16.000 xg durante 1 min. Misturar 70 uL de EDC com 70 ul de NHS e transferir para um frasco de plástico de 7 mm.
- Activa a superfície do chip de dextrano carboximetilado por superfície injectar a mistura de EDC / NHS em relação às células de fluxo 1 e 2 durante 10 min com um caudal de 10 ul min -1.
- Defina o caminho de fluxo para fluir somente célula 2. Pares de mAb 5,2, injectando-o durante 15 minutos a uma taxa de 10 ul min -1.
- Mudar o trajecto do fluxo flua células 1 e 2 e injectar de etanolamina durante 7 min a uma velocidade de 5 mL min -1 para desactivar a superfície. Tgalinha injectar cloreto de hidrogénio a 30 mM duas vezes durante 60 segundos com uma injecção intercaladas 60 seg de hidróxido de sódio a 25 mM.
- Injectar as amostras e MSP1 - 19 normas a uma taxa de 30 min mL -1 para 180 seg. Certifique-se de que a concentração Vax8 é de 50 - 1000 ng ml -1. Prepare pré-diluições em solução salina tamponada com HEPES contendo EDTA e polissorbato 20 (HBSEP) se necessário.
- Subtrair o sinal de pico de fluxo de uma célula a partir da célula de fluxo que 2 e utilizar a diferença para calcular a concentração Vax8 em amostras com base no sinal de MSP 1 - 19 de injecção com uma concentração conhecida de proteína de 500 ng mL -1.
- Regenerar a superfície do chip, após cada amostra ou MSP 1-19 injecção por exposição a cloreto de hidrogénio a 30 mM durante 60 segundos a uma taxa de fluxo de 30 ul min -1.
- Quantificar dsRed por espectrometria de fluorescência
- Em triplicado, de pipeta 50 ul de cada amostra para os poços individuais de uma meia-AR pretoEA placa de 96 poços. Incluem seis padrões DsRed que cobrem a faixa de 0 - 225 ug ml -1.
- Medir a fluorescência em duplicado utilizando um filtro de excitação de 530 nm ± 30 nm e um filtro de emissão de 590 ± 35 num espectrofotómetro. Calcular a concentração DsRed nas amostras com base na curva padrão através de um dos pontos de referência DsRed.
- Determinação de distribuições de tamanho de partícula
- Lavar uma cuvete com 1 ml de isopropanol e, em seguida, com 2 ml de água desionizada para remover partículas de poeira. Pipetar 850 mL da amostra na cuvete.
- Coloque a cuvete no potencial e partículas analisador de tamanho de zeta. Abra o "Software" e iniciar uma medição manual com "Proteína" como o material e "PBS", como o dispersante. Seleccionar uma temperatura de 25 ° C e um tempo de equilíbrio de 180 seg.
- Escolha a célula "DTS0012" e medida a 173 ° backscatter. Verifique a funct "auto"ion para a duração da medição e selecionar três medições com nenhum atraso intercaladas.
- Investigar o tamanho de partícula perfil do pico de distribuição uma vez que a medição estiver concluída, selecionando as três medições da amostra na vista experimento. Escolha a aba "PSD Volume".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Precipitação de calor de proteínas da célula hospedeira de tabaco por branqueamento
O processo de branqueamento descrito no ponto 2. foi utilizado com sucesso para precipitar os profissionais de saúde de folhas de tabaco com 70 ° C, reduzindo o TSP por 96 ± 1% (n = 3), enquanto que a recuperação até 51% da proteína alvo Vax8, aumentando assim a sua pureza a partir de 0,1% a 1,2% antes da separação cromatográf ica 16. Também era possível recuperar 83 ± 1% (n = 3) da proteína fluorescente DsRed, aumentando a sua pureza, a partir de 3,3% para 64,1%. O procedimento de branqueamento foi facilmente integrado em um esquema de extração e esclarecimentos padrão que consiste em lavar a biomassa, homogeneização, filtração saco e filtração de profundidade (Figura 1) 7. Preparar o equipamento de branqueamento (Figura 2) adicionado cerca de 5 minutos para o tempo de set-up para os dispositivos de clarificação, que rotineiramente leva 20 min. Outra 7 min foi necessário para executaro branqueamento das folhas intactas para além da extracção e clarificação tempo típico de 45 min. No entanto, apenas 2 min do adicional 7 min foi reais "hands-on" do tempo. Além disso, são possíveis tempos de incubação curtos de menos de 1 min, reduzindo o tempo de branqueamento de 7 minutos a cerca de 3 min. Portanto, o branqueamento não só aumenta a pureza de um produto inicial em extractos brutos de plantas, mas também é rapidamente concluída sem equipamento de processo adicional, oferecendo assim o potencial para substituir, pelo menos, um passo de cromatografia inicial. A temperatura do banho de branqueamento permaneceu constante, isto é, <0,2 ° C flutuação, durante todas as experiências, mesmo imediatamente após a adição de folhas colhidas que estavam à temperatura ambiente. Isto assegurou o processo foi repetido, isto é, um coeficiente médio de variação de 17% (n = 24), em termos de redução da TSP, os rendimentos do produto e da capacidade do filtro de clarificação nos passos seguintes (Figura 3 8 e filtro de ajudas após filtração saco de 9, que pode restaurar ou até mesmo aumentar as capacidades de filtragem. Uma temperatura de 60 ° C foi suficiente para remover 80 ± 3% (n = 3) dos profissionais de saúde e aumentar a pureza Vax8 2,6 ± 0,1 vezes (n = 3) sem afectar a capacidade do filtro. Portanto, a remoção de HCP pela branqueamento é compatível com proteínas alvo que têm estabilidade térmica moderada, isto é, uma temperatura de fusão abaixo de 70 ° C 27,28. No entanto, o aumento da temperatura para 70 ° C ou mais pode resultar numa remoção HCP de mais de 95% (Figura 3). Foi útil para conduzir o conjunto de experiências correspondente de forma bem concebido usando uma abordagem estatística 22 porque esta permitiu a rápida identificação dos mais rparâmetros de processo Elevant, ou seja, tempo de aquecimento e temperatura. Ao mesmo tempo, o método DOE gerado um modelo preditivo para facilitar o processo de optimização 16.
Figura 2: Configuração do Esquema de três métodos para precipitar Tobacco profissionais de saúde nas folhas intactas ou extractos dos mesmos A. O branqueamento foi realizado em um banho de água aquecida com um termostato (T) na qual uma cesta contendo folhas intactas foi submerso.. O banho de água foi agitada para garantir uma temperatura constante e homogénea. B. Um recipiente contendo uma barra de agitação magnética e folha extracto foi submersa num banho de água. A temperatura do extracto foi monitorada para assegurar que a temperatura desejada foi conseguido. C. Um permutador de calor (H) foi ligado a uma bomba (P) e uma caixa de a isolamento térmicoe recipiente contendo o extracto de planta. O trocador de calor foi submersa num banho de água ea temperatura do extracto aquecida foi monitorada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação de três calor precipitação Métodos mostrando seu efeito sobre o desempenho do processo e da Purificação de duas proteínas-alvo A.. Foram identificadas condições que suportam a remoção de mais de 90% dos profissionais de saúde para o branqueamento, um recipiente com agitação e uma configuração de permutador de calor, todos os quais aumentou a pureza das proteínas alvo Vax8 e DsRed por um mínimo de 2,5 vezes e, no máximo, 19 fold, com branqueamento melhor desempenho. Em contraste, apenas a configuração do recipiente com agitação aumentou a capacidade do subseqetapa de filtração de profundidade efluente utilizado para a clarificação das plantas tratadas termicamente ou extractos. As barras de erro indicam o desvio padrão (n = 3). B. O teor de HCP amostras após diferentes condições de tratamento térmico podem ser analisadas e comparadas utilizando géis de poliacrilamida corados com Coomassie. RuBisCO (setas verdes) é removida juntamente com outros profissionais de saúde como a temperatura durante o tratamento calor aumenta, enquanto DsRed (seta vermelha) permanece em solução. * Indica uma amostra que foi exposto ao calor por 0,5 min, todas as outras amostras foram tratadas durante 3,0 min ou mais. Re-impressão com a permissão de 16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Precipitação de calor de profissionais de saúde em um recipiente agitado
Um recipiente com agitação, para a precipitação de calor removido um máximo de 84 ± 1% (n = 3) Os profissionais de saúde, o atingir uma purezaf 0,33 ± 0,02% (n = 3) para Vax8 e 20,2 ± 1,4% (n = 3) para DsRed (Figura 3). O tratamento térmico foi realizado num recipiente separado a partir do homogeneizador para evitar atrasos reflectindo ocupação do dispositivo durante o processamento de amostras múltiplas em série. O esforço de manuseamento necessária para o processo à escala laboratorial foi semelhante ao que para o branqueamento, mas foram necessários um recipiente de aço inoxidável adicional e um passo de arrefecimento dedicado. Além disso, a transferência de calor para o extracto foi mais lento do que durante o branqueamento, com tempos de incubação de, pelo menos, 5 minutos, isto é, 10 vezes mais do que para o branqueamento. O aquecimento foi retardada causada pelo recipiente, o que representava uma barreira adicional à transferência de calor, e o ~ 300% maior que a massa foi aquecida no recipiente, devido à presença de tampão de extracção para além da biomassa vegetal. Precipitar proteínas também aderiram às paredes do vaso, construindo gradualmente até uma barreira de transferência de calor adicional e aumentar o esforçonecessária para a limpeza subsequente. Definir o banho de água de temperatura de 8 ° C acima da temperatura utilizada para a precipitação de calor compensadas por perdas de energia no sistema parcialmente aberta e atingiu a temperatura extrato desejado. Em contraste com o branqueamento (seção 2) ea instalação de permutador de calor (seção 5), a precipitação HCP num vaso aumentou a capacidade de filtração de profundidade a jusante por 2,5 vezes, refletindo as forças de corte mais baixas do navio em relação ao bombeamento extracto através do calor permutante ou homogeneização após branqueamento, provavelmente resultando em agregados maiores que eram mais fáceis de remover na etapa de filtração saco.
Precipitação de calor de profissionais de saúde em um permutador de calor
Cerca de 88,3 ± 0,7% (n = 12) do teor de HCP foi consistentemente removido a partir do extracto utilizando um permutador de calor dentro do intervalo de temperatura de 60 - 70 ° C, atingir um grau de pureza de 0,31 ± 0,01% (n = 12) para Vax8 e 27.6 ± 2.0% (n = 12) para DsRed (Figura 3). O coeficiente médio de variação foi de 13% (n = 24), indicando que a reprodutibilidade deste procedimento foi ainda melhor do que o branqueamento. A temperatura extracto desejado foi alcançado após 3 min ~ se a temperatura do banho de água foi fixada 4,5 ° C mais elevada. Como para o recipiente aquecido, um passo de arrefecimento dedicado foi necessária depois do tratamento térmico. O permutador de calor envolvido esforço mais manipulação do que os outros métodos, pois o aparelho de bombagem e o permutador de calor necessária a limpeza intensiva, devido ao precipitado que adere às paredes do tubo de aço inoxidável de diâmetro estreito. O permutador de calor também alcançado o menor capacidade do filtro de profundidade a jusante, clarificar apenas 13,5 ± 6,0 (n = 3) L m-2 antes de entupimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os três métodos de precipitação acima descritos calor pode remover eficazmente os profissionais de saúde do tabaco antes de qualquer passo de purificação cromatográfica 16,17. Eles complementam outras estratégias que visam aumentar a pureza inicial do produto, por exemplo, gutação 29, 30 ou rhizosecretion centrífuga extracção 31,32, todos os quais são limitados para as proteínas secretadas. No entanto, os métodos baseados em calor só pode ser utilizado de uma forma significativa, se a proteína alvo a ser purificado pode suportar a temperatura mínima precipitação de ~ 60 ° C durante mais de 1 minuto. Por conseguinte, o primeiro passo em qualquer um dos três métodos é a concepção de uma molécula alvo com uma temperatura de fusão suficientemente elevado, o que tem sido descrita para diversas proteínas de candidatos a vacinas contra a malária que consistem em domínios diferentes de vários antigénios de Plasmodium falciparum 16,18,21. Uma vez que a estabilidade térmica da proteína alvo tem sido demonstrada, umados três métodos podem ser selecionados com base nos equipamentos disponíveis e meios de comunicação, a escala processo final antecipado e operações DSP subsequentes 16.
Branqueamento foi o mais rápido dos métodos e requisitos de equipamentos adicionais foram mínimas, para que possa ser facilmente implementado em protocolos de purificação em escala laboratorial existentes para proteínas recombinantes derivados de plantas. Agitação completa do líquido de branqueamento é um parâmetro importante que afecta o processo de eficiência de precipitação HCP baseado em dados empíricos e cálculos teóricos 21,33. Não conseguirem alcançar uma boa mistura pode prejudicar a transferência de calor e resultado em apenas remoção de HCP parcial, que por sua vez pode ser prejudicial para o produto se proteases hospedeiras permanecer ativo 21,34. Vários outros parâmetros também podem afectar a precipitação HCP, por exemplo, o tempo de incubação e temperatura de aquecimento, e uma abordagem EOD poderá, portanto, ser útil para caracterizar a fa mais relevantectors e fornecem modelos preditivos para quantificar os seus efeitos sobre as respostas, tais como a pureza do produto, recuperação e o desempenho do subsequente DSP as etapas 22.
Na configuração do vaso, os tempos de incubação mais longos foram necessários para obter a precipitação completa HCP e isto pode aumentar a probabilidade de desnaturação da proteína alvo indesejável reflectindo a exposição prolongada a altas temperaturas. Mais uma mistura completa no reservatório podia melhorar a transferência de calor e reduzir a duração do aquecimento. A rampa de temperatura muito tempo nesta configuração também pode ser um desafio se proteases no extrato 21,34 tornar mais ativo antes da inactivação de calor final, causando perdas de produto.
O aumento da capacidade de filtro de profundidade observada para a configuração do navio pode ajudar a reduzir os custos de consumíveis, permitindo que um maior número de amostras a serem tratadas em um projeto com um orçamento fixo ou reduzir os requisitos gerais de financiamento para um determinado conjunto de experimentos. No entanto, esta vantagem pode ser compensada por o custo do recipiente adicional, o que é necessário, para além do homogeneizador para evitar a introdução de passos de processo de preensão se várias corridas de extracção são necessários em uma série de experiências, por exemplo, como parte de uma EOD abordagem. O efeito positivo sobre a capacidade do filtro pode também diminuir se um regime de mistura mais intensiva é usada para reduzir o tempo de aquecimento, tal como sugerido acima.
Um passo de arrefecimento dedicado é necessária para ambos os métodos de precipitação à base de extractos de calor, que não só requer recursos adicionais, mas também prolonga o tempo de processamento total por amostra, que também pode entrar em conflito com os procedimentos DoE fluentes ou sequências experimentais em geral. A configuração do permutador de calor está bem caracterizado do ponto de vista de engenharia e 35 pode ser facilmente concebido e dimensionado para as diferenças de temperatura específicos, em contraste com o recipiente, cujas mudanças de relação de superfície-para-volume durante a escala acima. Comocada vez, uma vez que o tamanho do permutador de calor é definida, ela pode ser difícil de ajustar para as diferenças de temperatura alternativas porque o seu comprimento e, assim, a área de transferência de calor são fixados.
Alteração de outros parâmetros, tais como o tempo de residência (ou caudal) e temperatura do meio permutador de calor, pode restaurar flexibilidade em algum grau, mas apenas em experiências de pequena escala, porque estes factores são geralmente operados em janelas estreitas em operações à escala de processo devido às restrições impostas pelos equipamentos disponíveis e meios de comunicação. A procura de uma combinação de tempos de incubação curtos de 3-5 minutos e uma diferença de temperatura de 40 - 60 ° C torna-se cada vez mais difícil de resolver no nível do dispositivo como a escala do processo aumenta, porque as dimensões do permutador de calor tornam-se maiores. Isto é especialmente verdadeiro para o passo de arrefecimento, porque a diferença de temperatura entre o meio e a temperatura extracto desejado é muitas vezes menor (AT = 10-15 ° C)do que a fase de aquecimento (AT = 20-40 ° C), resultando em grandes dimensões do equipamento ou mais vezes desaquecimento.
No futuro, o protocolo pode ser adaptado a outros candidatos a vacina de que, neste estudo, foram especificamente concebidos para a estabilidade térmica proteínas biofarmacêuticas. Muitos anticorpos pode resistir a temperaturas de> 70 ° C 36,37, que já é compatível com o protocolo de tratamento térmico de corrente. Esta estabilidade térmica natural pode ser aumentada ainda mais, projetando os diferentes domínios de anticorpo 38, aumentando assim o número de proteínas que podem ser sujeitas ao método (e suas variações) aqui apresentado. O método de branqueamento já foi aplicada a plantas de tabaco transgénicas que expressam um anticorpo monoclonal (2G12) 17, a qual não foi sujeita a selecção para a estabilidade térmica ou engenharia de proteínas. Tratamento térmico a 65 ° C aumentou a pureza do anticorpo por um factor dedois antes da purificação cromatográfica enquanto que a recuperação foi semelhante ao observado sem branqueamento.
Além disso, caracterizar as temperaturas de fusão HCP individuais de um sistema de expressão poderia facilitar a identificação de uma temperatura com a qual o processo pode ser conduzido semelhante à pasteurização de leite: alta temperatura, tempo curto 39. O tratamento térmico (excepto para o branqueamento) pode também ser aplicado a outros materiais de partida biológicos para remover os profissionais de saúde se o produto pode suportar as temperaturas necessárias. Este último pode desviar-se os que foram discutidos aqui se outras plataformas de expressão, tais como sobrenadantes de cultura de células de mamíferos estão a ser processadas. Em qualquer caso, o custo beneficio-razão deve ser tomado em consideração, isto é, faz o benefício dos níveis de HCP reduzidas compensam o custo de implementação de uma fase de tratamento térmico que faz com que os custos de investimento adicionais, aumenta o tempo de processo e pode reduzir a Yie produtold 16. Um parâmetro crítico neste contexto é a actividade do produto. Se depender da presença de epítopos lineares como para algumas vacinas baseadas em proteínas, em seguida, o tratamento térmico é pouco provável que tenha um efeito 40. Em contraste, se a estrutura de proteínas é importante, por exemplo, para os epítopos conformacionais, a orientação exacta das cadeias laterais de aminoácidos no local activo de uma enzima ou o dobramento correcto de complementaridade de anticorpos regiões de determinação, um tratamento térmico pode interferir com a actividade da proteína 41,42. Assim, ensaios de análise adequadas devem ser estabelecidos para monitorar o desempenho do produto antes e depois do tratamento térmico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
| Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
| Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
- PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
- Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
- Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
- Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
- Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
- Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940 (2016).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
- Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
- Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
- Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
- Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
- Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
- Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
- Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
- Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
- Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
- Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
- Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
- Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
- Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
- Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336 (2006).
- Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
- Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).
