Summary
Tre varme utfellingsmetoder er presentert som effektivt fjerner mer enn 90% av vertscelleproteiner (HCPs) fra tobakksekstrakter før en hvilken som helst annen rensetrinn. Anlegget HCPs irreversibelt å aggregere ved temperaturer over 60 ° C.
Abstract
Planter gir ikke bare mat, fôr og råvarer for mennesker, men har også blitt utviklet som et økonomisk produksjonssystem for biofarmasøytisk proteiner, slik som antistoffer, vaksinekandidater og enzymer. Disse må renses fra plantebiomasse men kromatografiske trinn blir hindret av de høye konsentrasjonene av vertscelleproteiner (HCPs) i planteekstrakter. Men de fleste HCPs irreversibelt å aggregere ved temperaturer over 60 ° C som letter etterfølgende rensing av målproteinet. Her er tre metoder presenteres for å oppnå varme utfelling av tobakk Helsepersonell i enten intakte blader eller ekstrakter. Blanche av intakte bladene kan enkelt bli innlemmet i eksisterende prosesser, men kan ha en negativ innvirkning på etterfølgende filtreringstrinn. Det motsatte er tilfelle for varme utfelling av blad ekstrakter i en rørt fartøy, som kan forbedre ytelsen til nedstrømsvirksomheten riktignok med store endringer i prosessutstyr design, for eksempelhomogenisator geometri. Til slutt blir en varmeveksler oppsett godt karakterisert med hensyn til varmeoverføringsbetingelser og lett å skala, men rengjøring kan være vanskelig og det kan være en negativ innvirkning på filterkapasitet. Utformingen-of-eksperimenter tilnærming kan brukes til å identifisere de mest relevante prosessparametre som påvirker HCP fjerning og produktgjenvinning. Dette letter anvendelsen av hver metode i andre uttrykk plattformer og identifisering av den mest egnede metode for et gitt rensestrategi.
Introduction
Moderne helsevesen stadig avhenge biofarmasøytisk proteiner 1. Fremstilling av disse proteiner i planter er fordelaktig på grunn av den lave patogen byrde og større skalerbarhet forhold til konvensjonelle ekspresjonssystemer 2-4. Imidlertid kan nedstrømsprosessering (DSP) av plante-avledet legemidler være utfordrende fordi forstyrrende ekstraksjonsmetoder resultere i en høy partikkel belastning, med turbidities stiger 5000 nefelometriske turbiditetsenheter (NTUs), og vertscelleprotein (HCP) konsentrasjoner ofte overstiger 95 % [m / m] 5,6.
Forseggjort avklarings prosedyrer er nødvendig for å fjerne dispergerte partikler 7-9, men kromatografi utstyr er mindre kostbart å operere i binde-og-elute modus under innledende produktgjenvinningen hvis det er et tidligere trinn for effektiv fjerning av HCPs 10,11. Dette kan oppnås enten ved utfelling av målproteinet ved hjelp flocculmaur 12 eller lav pH 13,14, samt ved forårsaker Helsepersonell å aggregere. Den selektive aggregering av ribulose-1,5-bisfosfat-karboksylase / oksygenase (RUBISCO), det mest tallrike HCP i grønne planter som tobakk (Nicotiana tabacum) kan fremmes ved tilsetning av polyetylenglykol 15, men dette er kostbart og uforenlig med stor -skala produksjon. Varmebehandling har vist seg å denaturere og presipitere mer enn 95% av tobakks HCPs, mens protein malaria vaksinekandidater som Vax8 forbli stabil i oppløsning 16-18.
Tre forskjellige metoder ble brukt for å oppnå den varmeinduserte utfelling av tobakks HCPs: (i) blanchering, dvs. nedsenking av intakte blader i varm væske, (ii) en temperaturkontrollert omrørt beholder, og (iii) en varmeveksler ( Figur 1) 16. For intakte blader, forvelling oppnås rask og effektiv utfelling av Helsepersonell og var også lettå skalere opp og kompatibel med eksisterende storskala produksjonsprosesser som inkluderer et første skritt for å vaske anlegget biomasse 19. I motsetning til dette temperaturstyrt fartøy er allerede tilgjengelig i noen prosesser og kan anvendes for varmebehandling av plante-ekstrakter 20, men deres skalerbarhet og energioverføring hastighet er begrenset, fordi den overflate-til-volum-forholdet av tankene er gradvis redusert og blir uegnet i prosessen skala. En varmeveksler er en teknisk veldefinert alternativ til å varmes opp omrørt fartøy, men krever en rikelig tilførsel av varme- og kjølemedier, for eksempel damp og kaldt vann, samt en kontrollert volumetrisk strømningshastighet som er tilpasset til varmeveksleren geometri og media egenskaper, f.eks., den spesifikke varmekapasitet. Denne artikkelen viser hvordan alle tre fremgangsmåter kan anvendes for varmeinduserte utfelling av tobakk HCPs, og plante HCPs generelt. Etablering og drift av EACh fremgangsmåte i et laboratorium kan brukes til å vurdere om de er egnet for større skala prosesser. Den store utfordringen er å identifisere tilstrekkelig skala-down modeller og driftsforhold for hver operasjon som ligner enhetene og betingelsene som brukes under prosessen-skala produksjon. Dataene presentert her viser til eksperimenter utført med transgene tobakksplanter som uttrykker det malaria vaksine kandidat Vax8 og fluorescerende protein DsRed 16, men fremgangsmåten er også blitt brukt til N. benthamiana planter forbigående uttrykker andre biofarmasøytisk proteiner 21.
En design-of-eksperimenter (DoE) nærmer 22 kan forenkle prosessutvikling, og flokulanter 23 kan også være nyttig i denne sammenheng som tidligere beskrevet åtte. Hovedforskjellen mellom blanche, oppvarmede beholdere og varmevekslere er at blanche påtrykkes intakte bladene tidlig i prosessen, mens othennes tilføres planteekstrakter (figur 1).
Figur 1:. Process Flow skjema som illustrerer gjennomføring av tre ulike metoder for Tobacco HCP Heat Nedbør Plantematerialet blir vasket og homogenisert før avklaring og rensing. Utstyr for forvellingstrinn (rød) lett kan legges til eksisterende maskineri. I motsetning til ved hjelp av en rørt fartøy (oransje) og spesielt en varmeveksler (blå) krever en eller flere andre enheter og rør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dyrke tobakksplanter
- Spyle hver mineralullblokk med 1 til 2 l avionisert vann og deretter med 1 liter 0,1% [w / v] gjødsel-løsning. Plasser en tobakk frø i hver mineralull blokk og forsiktig flush med 0,25 liter gjødsel løsning uten å vaske bort frø 16.
- Dyrke tobakksplanter i 7 uker i et veksthus med 70% relativ fuktighet, en 16 timers fotoperiode (180 umol sek - 1 m - 2; λ = 400-700 nm) og en 25/22 ° C lys / mørke temperaturregime.
- Høste alle blad unntatt de fire cotyledon bladene, som er plassert ved bunnen av anlegget stammen.
2. Valgfritt: Heat Nedbør av Blanche
MERK: Utfør trinnene som er beskrevet i trinn 02.01 til 02.12 for å felle tobakk Helsepersonell ved forvelling. Hopp hele § 2, dersom Helsepersonell vil bli utfelti et oppvarmet kar (seksjon 4) eller ved hjelp av en varmeveksler (§ 5).
- Sett av 50 g av plantemateriale og gjennomføre utvinning uten forvelling (§ 3). Ta en prøve av dette ekstraktet som under påfølgende analyse (kapittel 7) en intern kontroll.
- Sett opp en 8-L arbeidsvolum vannbad, for eksempel 50 x 40 x 40 cm, i en varmeisolerende polystyren skum bøtte eller lignende. Monter den justerbare termostaten på vannbad i påfølgende temperaturkontroll (trinn 2.7).
- Overføre hele sammenstillingen på en magnetisk røreplate og sette inn en magnetisk rørestav i vannbadet. Kontroller at magnetfelt er sterk nok til å rotere rørepinne.
- Omgir rørestav med minst fire støtte fliser hvorpå en polypropylen kurv (trinn 2.6) vil bli plassert senere under blancheringsprosedyren. Pass på at støtte fliser er laget av et ikke-magnetisk materiale (for eksempel rustfritt stål legering som inneholder nikkel), og at deer høyere enn den rørestav (figur 2).
- Tilsett 8 l avionisert vann til vannbadet.
MERK:. Ved hjelp av en buffer, f.eks 50 mM natriumfosfat (pH 7,5), kan forbedre målet proteinutbytter hvis lav pH nedbør er et problem. - Plasser en 23 x 23 x 23 cm polypropylen kurv på støtte fliser og sørg for at kurven ikke forstyrrer oppstuss bar rotasjon og at det er fullt nedsenket i væsken. Om nødvendig, legge til ekstra vann / buffer inntil kurven være helt under vann, og deretter fjerne kurven igjen.
FORSIKTIG: Alle etterfølgende trinn opp til 2,12 bære håndtering av varm væske. Bruk egnet personlig verneutstyr, inkludert isolerte hansker. - Bruk justerbar termostat for å bringe vannbad til 70 ° C (eller den temperatur som er nødvendig for eksperimentene). Vent minst 15 minutter etter at den ønskede temperatur er nådd for å sikre at hele forsamlingen har nådd en Thermal likevekt.
- Forbered 150 g prøver fra høstet tobakksblader. Plasser en aliquot i kurven samtidig unngå irreversible kompresjon og skader på bladene, for eksempel ved å rive. Unngå overfylling kurven med plantemateriale eller en tett pakning av sistnevnte.
- Nøye men raskt senk kurven i den varme væsken og legg den på støtte fliser. Plasser en rustfri stålblokk på toppen av kurven for å forhindre flotasjon.
- Inkuber bladene for 5 min i blansjere væske, eller velg et tidspunkt suiting eksperimentell design. Overvåke væsketemperaturen under hele inkubasjonsperioden.
- Fjern forsiktig kurven fra blanche væske og la resterende væsken renne fra bladene i 30 sek. Så anlegget blader ut av kurven, overføre dem til blender og umiddelbart starte utvinning (§ 3).
MERK: Planter kan holdes i lengre perioder etter forvelling og før starten av the ekstraksjon, for eksempel, mer enn 30 min på is eller frosset ved -20 ° C i flere uker, har blitt testet. Imidlertid kan produktet stabilitet avta med økende lagringstider og dermed umiddelbar behandling anbefales. - Gjenta trinn 02.08 til 02.11 med friskt bladmateriale til hele slaktet biomasse er behandlet.
3. Protein Extraction fra tobakk blader
FORSIKTIG: Det neste trinnet innebærer en blender med roterende knivene. Ikke arbeid i blender bøtte mens den er montert på blender motor.
- Plasser 150 g (våt masse) på slaktet (trinn 1.3) eller forvellet (trinn 2.11) går i blenderen og tilsett 450 ml ekstraksjonsbuffer (50 mM natriumfosfat, 500 mM natriumklorid, 10 mM natriumdisulfitt, pH 8,0).
MERK: ekstraksjonsbuffer sammensetning er avhengig av proteinet som skal utvinnes, og kan således være nødvendig å justere, for eksempel, anvendelse av en annen pH eller bufferkomponent slik som Trer. - Homogen bladene i 3 x 30 sek pulser med 30 sek ispedd pauser. Pass på at bladene er homogenisert og ikke tette blender bøtte. Stopp blender og løft bladene for å forhindre tilstopping om nødvendig, og deretter fortsette homogenisering.
- Ta en 1 ml prøve av hver ekstrakt som er produsert for påfølgende analyse (kapittel 7). Dersom plantemateriale er forvellet, fortsetter § 6. Ellers fortsetter med varme nedbør i et kar (seksjon 4) eller varmeveksler (§ 5), avhengig av valgt eksperimentell tilnærming.
4. Valgfritt: Varme Nedbør i en Stirred Vessel
MERK: Gjennomføre trinnene som er beskrevet i punkt 4.2 til 4.11 for å felle tobakks Helsepersonell i en rørt kar. Hopp hele § 4, hvis Helsepersonell har blitt fremskyndet av forvelling (§ 2) eller vil bli utfelt ved hjelp av en varmeveksler (§ 5).
- Sett opp to 8-L arbeidsvolum vannbad, for eksempel 50 x 40 x 40 cm, i termisk isolert polystyrenskum eller lignende. I første bad, montere justerbar termostat for påfølgende temperaturkontroll (trinn 4.6). I den andre, tilsett 5 l deionisert vann og 2 kg is for påfølgende avkjøling (trinn 4.9).
- Overfør den første vannbadet på en magnetisk røreplate, og plasser 2-L-kar av rustfritt stål inn i vannbadet, slik at midten av skipet er innrettet til midten av røreplate.
- Plasser en magnetisk rørestav i den rustfrie stålbeholder. Kontroller at magnetfelt er sterk nok til å rotere rørepinne.
- Fyll vannbad med avionisert vann til 5 cm under den øvre kant av det rustfrie stålbeholder. Deretter fylle karet med utvinning buffer. Plassere et polystyrenskum lokk på fartøyet.
FORSIKTIG: Alle etterfølgende trinn opp til 4,9 bære håndtering av varm væske. Bruk egnet personlig verneutstyr, inkludert termisk insulated hansker. - Sett et termometer i rustfritt stål skipet gjennom en suiting hull i polystyren skum lokket. Still vannbad temperaturen til 78 ° C og inkuber hele sammenstillingen i 15 minutter for å oppnå termisk likevekt. Sikre at temperaturen i karet er 70 ° C, ca. 8 ° C under settpunktet for den vannbadet.
- Hvis temperaturen i den rustfrie stålbeholder avviker fra 70 ° C, justere temperaturen på vannbadet i henhold til og la systemet stabilisere seg i 15 min. Gjenta dette trinnet inntil temperaturen i beholderen er 70 ° C eller etter behov for eksperimentet, og tømme rustfri stålbeholder.
- Hell 300 ml ekstrakt (trinn 3.2) i den rustfrie stålbeholderen mens den fremdeles er i vannbadet og starte en timer. Omrør ekstraktet ved 150 rpm og inkuberes i 5 min. Sikre at ekstrakt når en temperatur på 70 ° C i minst 2 minutter i løpet av denne inkubasjonsperioden.
- Fjern varmt vannbad fra magnetrører, ta ut rustfri stålbeholder og legg den i iskaldt bøtte. Plasser den sistnevnte på magnetrøreren og ta av polystyrenskum lokket.
- Sikre at anlegget homogenatet er godt agitert ved 150 rpm, plasserer termometeret i ekstraktet og inkuberes inntil den når en temperatur på 20 ° C eller den temperatur som er angitt ved den eksperimentelle design.
- Gjenta trinn 04.07 til 04.09 for alle tilsetningene. Ta en 1 ml prøve av hvert heat utfelt trekke når den har nådd finalen temperatur, så fortsett med kapittel 6.
5. Valgfritt: Heat Nedbør i en varmeveksler
MERK: Gjennomføre trinnene som er beskrevet i avsnitt 5.2 til 5.12 for å felle tobakks Helsepersonell ved hjelp av en varmeveksler. Hopp hele § 5, dersom Helsepersonell har blitt fremskyndet av forvelling (§ 2) eller i et oppvarmet kar (§ 4).
- Sett opp to 8-L arbeidsvolumvannbad, for eksempel 50 x 40 x 40 cm, i termisk isolerte polystyren skum skuffer eller lignende. I første bad, montere justerbar termostat for påfølgende temperaturkontroll (trinn 5.3). I den andre, tilsett 5 l deionisert vann og 2 kg is for påfølgende avkjøling (trinn 5.10).
FORSIKTIG: Alle etterfølgende trinn opp til 5,9 bære håndtering av varm væske. Bruk egnet personlig verneutstyr, inkludert isolerte hansker. - Fyll første vannbad med 8 L-ionisert vann. Sett temperaturen på 74,5 ° C ved hjelp av termostat. Inkuber sammenstillingen i 15 minutter for å oppnå termisk likevekt.
- Forbered en isolert lagertank ved å plassere en 0,5-L plast beger til en 1-L plast beger og fylle hullene med vatt. Alternativt kan du bruke en dedikert termisk isolert beholder med en 0,5-L arbeidsvolum.
- Koble varmeveksleren til den peristaltiske pumpe i den ene ende og til en utløpsslange på other ende ved hjelp av L / S 24 rør. Plasser begge slangeendene sammen med et termometer i den isolerte lagerskip og fyll den med 300 ml utvinning buffer (figur 2).
- Plassere varmeveksleren i det varme vannbad og starte den peristaltiske pumpe ved en hastighet på 300 ml min-1. Sikre at den resulterende temperatur i karet er 70 ° C, ca. 4,5 ° C under settpunktet i vannbadet, etter 3 min.
- Hvis temperaturen i den isolerte-fartøyet avviker fra 70 ° C, justere temperaturen på vannbadet i henhold til og la systemet stabilisere seg i 15 min. Gjenta dette trinnet til temperaturen i utvinning buffer øker fra omgivelsestemperatur til 70 ° C på mindre enn 3 min, eller er lik det som kreves for forsøket, og tømme rustfritt stål fartøy.
- Kast ekstraksjonsbuffer fra den isolerte kar og fremstille 300-ml porsjoner av planteekstrakten. Fyll isolert kar med en alikvot.
- Pump planteekstrakten (avsnitt 3.3) gjennom varmeveksleren på 300 ml min-1 i 5 minutter. Påse at avtrekkstemperaturen er 70 ° C etter 3 min, eller lik temperatur definert i eksperimentell design.
- Etter 5 min plassere varmeveksleren inn i is-kaldt vannbad mens ekstrakten fortsatt blir pumpet. Inkuber i denne innstillingen inntil temperaturen når nøyaktig 20 ° C, eller temperaturen definert i eksperimentell design.
- Fjern inntaksslangen er koblet til den peristaltiske pumpe fra den isolerte beholderen og fortsette å pumpe å samle restvarme-utfelt planteekstrakt fra inne i varmeveksleren. Deretter stoppe pumpen.
- Gjenta trinn 05.07 til 05.10 for alle tilsetningene. Ta en 1 ml prøve av hver varme utfelt ekstrakt når den har nådd finalen temperatur, så pass på ekstrakter til bag filtrering (§ 6).
MERK: Etter en første syklus gjennom trinn 05.07 til 05.10 blir det ingen utvinning buffer tilkast i trinn 5.7.
6. Bag Filtrering av Plant Extract
- Montere et posefilter til den tilsvarende støttekurv som er montert inn i filterhuset og gir mekanisk støtte for det fleksible filtermaterialet. Plasser en 1-liters beholder under kurven og anvende de ekstrakt alikvoter (avsnitt 3.3, 4.10 eller 5.11, avhengig av det valgte varmebehandling) til posen med en hastighet på 150 ml min-1.
- Etter filtrering måle turbiditeten av en 1:10 fortynning av filtratet i utvinning buffer ved hjelp av turbidimeter.
- Ta en 1 ml prøve og behandle posen filtratet som definert i eksperimentell design, for eksempel dybdefiltrering og kromatografi 7,10.
7. Sample Analysis
- Måle mengden av total løselig protein (TSP) ved anvendelse av Bradford-metoden 24,25.
- I triplikat, pipette 2,5 ul av hver prøve inn i de enkelte brønnene til en96-brønns plate. Inkluder åtte bovin serum albumin (BSA) standarder i tre eksemplarer som dekker området 0 - 2000 mikrogram ml -1.
- Tilsett 200 mL Bradford reagens til hver brønn og bland godt ved å pipettere opp og ned, men forsiktig nok til å unngå å danne bobler.
- Inkuber i 10 minutter ved 22 ° C og måle absorbansen ved 595 nm i et spektrofotometer. Beregn TSP-konsentrasjonen i prøvene basert på en standardkurve gjennom BSA referansepunkter.
- Kvantifisere Vax8 av overflaten plasmon resonans spektroskopi 26.
- Oppsett av overflate-plasmonresonans instrument med 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES) buffer (10 mM HEPES, 3 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 1 500 mM natriumklorid, 0,05% volum / volum polysorbat 20, pH 7,4) og montere en karboksymetylert dekstran overflate chip inn i enheten. Bruk prime-funksjonen for å skylle systemet og starte en manuell kjøre med en strømningshastighet på 30ul min -1 over flyt-celler 1 og 2. Injiser 30 mM hydrogenklorid to ganger i 60 sekunder med en 60 sek ispedd injeksjon med 25 mM natriumhydroksyd.
- Fremstille 200 ul av en 500 ug ml -1 mAb 5,2, oppløsning i 10 mM natriumacetat (pH 4,0). Tine 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid-hydroklorid (EDC) og N-hydroksysuccinimid (NHS) ampuller og sentrifuge dem ved 16.000 x g i 1 min. Bland 70 mL av EDC med 70 mL av NHS og overføre til en 7-mm plast hetteglass.
- Aktiver karboksymetylert dekstran overflate chip overflaten ved å injisere EDC / NHS blandingen i løpet av strømningsceller 1 og 2 i 10 minutter med en strømningshastighet på 10 mL min -1.
- Sett strømningsbanen til å flyte celle to bare. Par mAb 5,2 ved å injisere det i 15 minutter ved en hastighet på 10 ul min -1.
- Bytte strømningsbanen til å strømme cellene 1 og 2 og injisere etanolamin i 7 minutter ved en hastighet på 5 pl min -1 for å deaktivere overflaten. Thøne injisere 30 mM hydrogenklorid to ganger i 60 sekunder med en 60 sek ispedd injeksjon av 25 mM natriumhydroksyd.
- Sprøyt prøvene og MSP1 - 19 standarder med en hastighet på 30 mL min -1 for 180 sek. Kontroller at Vax8 konsentrasjonen er 50 - 1000 ng ml -1. Fremstille pre-fortynninger i HEPES-bufret saltvann inneholdende EDTA og polysorbat 20 (HBSEP) om nødvendig.
- Trekk fra toppsignalet fra strømningscellen en fra den i strømningscelle 2 og bruke differansen til å beregne Vax8-konsentrasjonen i prøver basert på signalet fra MSP 1 - 19 injeksjon med en kjent proteinkonsentrasjon på 500 ng ml -1.
- Regenerere chipen overflaten etter hver prøve, eller MSP 1 - 19 injeksjon ved eksponering for 30 mM hydrogenklorid i 60 sekunder ved en strømningshastighet på 30 mL min -1.
- Kvantifisere DsRed ved fluorescens spektrometri
- I triplikat, pipettes 50 ul av hver prøve inn i de enkelte brønnene til en svart halv-area 96-brønns plate. Inkluder seks DsRed standarder som dekker området 0 - 225 ug ml -1.
- Måle fluorescens i duplikat ved anvendelse av en 530 ± 30 nm eksitasjon filter og et 590 ± 35 nm emisjon filter i et spektrofotometer. Beregn DsRed-konsentrasjonen i prøvene basert på en standardkurve gjennom DsRed referansepunkter.
- Bestemmelse av partikkelstørrelsesfordelingen
- Vask en kyvette med 1 ml isopropanol og deretter med 2 ml avionisert vann for å fjerne støvpartikler. Pipettere 850 ul av prøven i kyvetten.
- Plasser kuvetten til zeta-potensialet og partikkelstørrelse analysator. Åpne "programvare" og starte en manuell måling med "Protein" som materiale og "PBS" som dispergeringsmiddel. Velge en temperatur på 25 ° C og en ekvilibreringstid på 180 sek.
- Velg "DTS0012" cellen og tiltak ved 173 ° backscatter. Sjekk "auto" funksjoion for måling varighet og velge tre målinger uten ispedd forsinkelse.
- Undersøke partikkelstørrelsesfordelingen topp-profil når målingen er fullført, ved å velge de tre målinger av prøven i eksperimentet visningen. Velg "Volume PSD" -kategorien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Heat utfelling av tobakk vertscelleproteiner forvelling
Blancheringsfremgangsmåten beskrevet i avsnitt 2 ble med hell anvendt for å utfelle HCPs fra tobakksblader med 70 ° C, noe som reduserer TSP ved 96 ± 1% (n = 3), mens utvinning av opptil 51% av den Vax8 målproteinet, og dermed øke dens renhet fra 0,1% til 1,2% før kromatografisk separasjon 16. Det var også mulig å utvinne 83 ± 1% (n = 3) av det fluorescerende protein DsRed, øker dens renhet fra 3,3% til 64,1%. Blanche Prosedyren ble lett integreres i en standard ekstraksjon og klargjøring ordningen som består av vasking biomasse, homogenisering, filtrering og bag dybdefiltrering (figur 1) 7. Klarblanche utstyr (figur 2) tilsatt ca 5 min til set-up tid for avklaring enheter, som rutinemessig tar 20 min. En annen 7 minutter var nødvendig for å utføreblanche av intakte bladene i tillegg til vanlig ekstraksjon og klargjøring tid av 45 min. Men bare to minutter av den ekstra 7 min var selve "hands-on" tid. I tillegg korte inkubasjonstider på mindre enn 1 min er mulige, som reduserer blanche tid fra 7 minutter til ca. 3 min. Derfor blanche øker ikke bare den opprinnelige renhet av et produkt i råolje planteekstrakter, men også raskt gjennomført uten noe ekstra utstyr, og dermed gir mulighet for å erstatte i det minste et første kromatografitrinn. Blanche badtemperaturen holdt seg konstant, dvs. <0,2 ° C svingning, under alle forsøk, selv straks etter tilsetningen av høstede blader som var ved romtemperatur. Dette sikret at prosessen var repeterbare, dvs. en gjennomsnittlig variasjonskoeffisient på 17% (n = 24), i form av TSP reduksjon, produktutbytter og filterkapasiteten i de etterfølgende klaringstrinn (figur 3 8 og filtreringshjelpemidler etter bag filtrering 9, som kan gjenopprette eller øke filterkapasitet. En temperatur på 60 ° C var tilstrekkelig til å fjerne 80 ± 3% (n = 3) av HCPs og øke renheten Vax8 2,6 ± 0,1 ganger (n = 3) uten å påvirke filterkapasitet. Derfor er HCP fjerning ved forvelling kompatibel med target-proteiner som har moderat varmestabilitet, dvs. en smeltetemperatur under 70 ° C 27,28. En økning av temperaturen til 70 ° C eller mer kan resultere i en HCP fjerning av over 95% (figur 3). Det var nyttig for å utføre den tilsvarende sett av eksperimenter i et godt utformet måte ved hjelp av en statistisk metode 22 fordi dette tillater rask identifisering av de mest rELEVANT prosessparametre, dvs. oppvarming tid og temperatur. På samme tid, DoE fremgangsmåte som genereres en prediktiv modell for å lette prosessoptimalisering 16.
Figur 2: Skjematisk oppsett av tre metoder for å felle Tobacco Helsepersonell i Intakte Løv eller utdrag A. Blanchering ble utført i et vannbad med en termostat (T) inn som en kurv med intakte blader var senkes.. Vannbadet ble agitert for å sikre et ensartet og konstant temperatur. B. En beholder inneholdende en magnetisk rørestav og blad ekstrakt ble neddykket i et vannbad. Temperaturen i ekstrakten ble overvåket for å sikre at den ønskede temperatur var oppnådd. C. En varmeveksleren (H) er forbundet med en pumpe (P) og et termisk isolert storage kar inneholdende planteekstrakt. Varmeveksleren ble senket ned i et vannbad og temperaturen i det oppvarmede ekstrakt ble overvåket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Sammenligning av tre Varme Nedbør Metoder Viser deres effekt på prosessytelse og rensing av to target proteiner A.. Forhold som støtter fjerning av mer enn 90% av HCPs ble identifisert for forvelling, et omrørt kar og en varmeveksler oppsett, som alle økte renhet av målproteinene Vax8 og DsRed med minimum 2,5 ganger og maksimalt 19 fold, med forvelling utføre beste. I motsetning til dette, bare den omrørte kar oppsettet øket kapasitet subsequent dybde filtrering trinnet brukt for avklaring av varmebehandlede planter eller ekstrakter. Feilfelt angir standardavvik (n = 3). B. Den HCP-innhold av prøver etter forskjellige varmebehandlingsbetingelsene kan analyseres og sammenlignes ved hjelp av Coomassie-fargede polyakrylamidgeler. RUBISCO (grønne piler) blir fjernet sammen med andre HCPs som temperaturen under varmebehandling øker, mens DsRed (rød pil) forblir i oppløsning. * Angir et prøver som ble utsatt for varme for 0,5 min, ble alle andre prøver ble behandlet i 3,0 minutter eller mer. Re-print med tillatelse fra 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Varme utfelling av HCPs i et omrørt kar
En omrørt kar for varme utfelling fjernet maksimalt 84 ± 1% (n = 3) HCPs, å oppnå en renhet of 0,33 ± 0,02% (n = 3) for Vax8 og 20,2 ± 1,4% (n = 3) for DsRed (figur 3). Varmebehandlingen ble utført i et kar separat fra homogenisatoren for å forhindre forsinkelser reflekterende belegg enheten ved behandling av flere prøver i serien. Den håndtering av innsatsen som kreves for laboratorie-skala prosessen var den samme som for forvelling, men en ekstra beholder av rustfritt stål og en egen kjøletrinn var nødvendig. Videre er varmeoverføringen til ekstraktet var lavere enn i løpet av blanchering, med inkubasjonstider på minst 5 min, dvs. 10 ganger lengre enn for blanchering. Den forsinkede oppvarming ble forårsaket av fartøyet, noe som utgjorde en ytterligere barriere mot varmeoverføring, og det ~ 300% større masse som ble oppvarmet i beholderen på grunn av tilstedeværelsen av utvinning buffer i tillegg til plantebiomasse. Utfelling av proteiner også klebet til veggene i beholderen, gradvis å bygge opp en ytterligere varmeoverføringsbarriere og øke innsatsenkreves for påfølgende rengjøring. Innstilling av vann badtemperatur 8 ° C over den temperatur som brukes for varme utfelling kompensert for energitap i den delvis åpne system og oppnådde den ønskede ekstrakt temperatur. I motsetning til blanche (seksjon 2) og varmeveksleren setup (seksjon 5), HCP utfelling i et kar øket kapasiteten til nedstrømsdybdefiltrering av 2,5-fold, som gjenspeiler de lavere skjærkrefter i fartøyet i forhold til pumping ekstrakt gjennom varme veksleren eller homogenisering etter forvelling, sannsynligvis fører til større aggregater som var lettere å fjerne i posen filtreringstrinn.
Varme utfelling av HCPs i en varmeveksler
Omtrent 88,3 ± 0,7% (n = 12) av HCP innholdet var konsekvent fjernet fra ekstrakten ved hjelp av en varmeveksler innen temperaturområdet 60 - 70 ° C, å oppnå en renhet på 0,31 ± 0,01% (n = 12) for Vax8 og 27.6 ± 2,0% (n = 12) for DsRed (figur 3). Gjennomsnittlig variasjonskoeffisient var 13% (n = 24) som indikerer at den repeterbarheten av denne prosedyren var enda bedre enn blanchering. Den ønskede ekstrakt temperatur ble nådd etter ~ 3 min hvis vannbad temperaturen var satt 4,5 ° C høyere. Som for den oppvarmede kar, ble en egen kjøletrinn nødvendig etter varmebehandling. Varmeveksleren som er involvert mer håndtering krefter enn de andre metodene, fordi pumpeapparatet og varmeveksleren er nødvendig intensiv rengjøring på grunn av utfellingen fester seg til veggene i den trange boring rustfritt stålrør. Varmeveksleren også oppnådd den laveste nedstrøms dybdefilter kapasitet, oppklarende bare 13,5 ± 6,0 (n = 3) L m -2 før tilstopping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tre metoder for varme nedbør beskrevet ovenfor effektivt kan fjerne tobakk Helsepersonell før noen kromatografisk rensetrinn 16,17. De utfyller andre strategier som tar sikte på å øke første produktet renhet, f.eks guttation 29, rhizosecretion 30 eller sentrifugal utvinning 31,32, som alle er begrenset til utskilte proteiner. Imidlertid kan de varmebaserte metoder bare brukes på en meningsfull måte dersom målet proteinet som skal renses kan tåle den minste utfelling temperatur på ~ 60 ° C i mer enn 1 min. Derfor er det første trinnet i en hvilken som helst av de tre metodene er å utforme et målmolekyl med en tilstrekkelig høy smeltetemperatur, som er blitt beskrevet i flere malaria vaksine kandidat-proteiner som består av forskjellige domener fra flere Plasmodium falciparum antigener 16,18,21. Når den termiske stabilitet av målproteinet er blitt demonstrert, ettav de tre metodene kan velges på grunnlag av tilgjengelig utstyr og media, forventet endelige prosessen skala og påfølgende DSP operasjoner 16.
Blanchering var den raskeste av de metoder og ekstra utstyr krav var minimal, så det kan lett implementeres i eksisterende laboratorieskala rensing protokoller for plante-avledet rekombinante proteiner. Grundig omrøring av blanche væske er en viktig prosessparameter som påvirker effektiviteten av HCP nedbør basert på både erfaringsdata og teoretiske beregninger 21,33. Ikke å oppnå god blanding kan svekke varmeoverføringen og resulterer i at bare delvis HCP fjerning, som i sin tur kan være skadelig for produktet hvis vertsproteaser forblir aktive 21,34. Flere andre parametere kan også påvirke HCP nedbør, f.eks, oppvarmingstemperaturen og inkubasjonstid, og en doe fremgangsmåten kan derfor være nyttig for å karakterisere den mest relevante factors og gir prediktive modeller for å kvantifisere deres effekt på svarene som produkt renhet, utvinning og utførelsen av etterfølgende DSP trinn 22.
I fartøyet oppsettet, ble lengre inkubasjonstid er nødvendig for å oppnå fullstendig HCP nedbør og dette kan øke sannsynligheten for uønskede mål protein denaturering reflekterer den utvidede eksponering for høye temperaturer. Mer grundig blanding i fartøyet kunne forbedre varmeoverføring og redusere varigheten av oppvarming. Den lange temperatur rampe i dette oppsettet kan også være utfordrende hvis proteaser i uttrekket 21,34 bli mer aktive før endelig varmeaktivering, forårsaker produkt tap.
Den økte dybdefilter kapasitet observert for fartøyet oppsettet kan bidra til å redusere forbrukskostnadene, slik at et større antall prøver som skal håndteres i et prosjekt med et fast budsjett eller redusere finansieringsbehovet for et gitt sett av experimentene. Imidlertid kan denne fordelen oppveies av kostnadene for den ytterligere fartøyet, noe som er nødvendig i tillegg til homogenisatoren for å hindre innføring av prosessen hold trinnene hvis flere uttrekkings forsøkene er nødvendig i en serie forsøk, for eksempel som en del av en DoE nærme seg. Den positive effekt på filterkapasiteten kan også reduseres hvis en mer intensiv blande regime blir brukt til å redusere oppvarmingstider som foreslått ovenfor.
En egen kjøletrinn er nødvendig for begge ekstraktbasert varme utfellingsmetoder, krever ikke bare ekstra ressurser, men også forlenge den totale behandlingstid per prøve, som også kan komme i konflikt med flytende DoE prosedyrer eller eksperimentelle sekvenser generelt. Varmeveksleren er helt i tegnes fra et teknisk perspektiv 35 og kan lett utformes og skalert opp for bestemte temperaturforskjeller, i motsetning til fartøyet, hvis overflate-til-volum-forhold endringer under skala opp. Hvordanalltid, når varmeveksleren størrelsen er definert, kan det være vanskelig å justere for å alternative temperaturforskjeller fordi dens lengde og dermed varmeoverføringsareal er løst.
Endring av andre parametre, slik som oppholdstiden (eller strømningshastigheten) og temperaturen i varmeveksleren mediet, kan gjenopprette fleksibilitet til en viss grad, men bare i liten skala eksperimenter fordi disse faktorene blir typisk operert i smale vinduer i prosessen målestokk på grunn restriksjoner pålagt av tilgjengelig utstyr og media. Kravet om en kombinasjon av korte inkubasjonstider på 3 - 5 min og en temperaturforskjell på 40 - 60 ° C blir det stadig vanskeligere å løse på maskinen nivå som prosess skala øker fordi dimensjonene på varmeveksleren blir større. Dette gjelder særlig for kjøletrinnet fordi temperaturforskjellen mellom mediet og den ønskede ekstrakt temperatur er ofte mindre (aT = 10-15 ° C)enn oppvarmingstrinnet (aT = 20-40 ° C) noe som resulterer i store utstyrsdimensjoner eller lengre nedkjøling ganger.
I fremtiden kan protokollen tilpasses andre enn vaksinekandidater som i denne studien ble spesielt utviklet for termisk stabilitet biofarmasøytisk proteiner. Mange antistoffer tåler temperaturer på> 70 ° C 36,37 som allerede er kompatibel med dagens varmebehandling protokollen. Denne naturlige termiske stabilitet kan økes ytterligere ved å konstruere de forskjellige antistoffdomener 38, for derved å øke antallet av proteiner som kan utsettes for fremgangsmåten (og dens varianter) er presentert her. Blanche Metoden har allerede blitt brukt for å transgene tobakksplanter som uttrykker et monoklonalt antistoff (2G12) 17 som ikke har vært utsatt for seleksjon for termisk stabilitet eller protein engineering. Varmebehandling ved 65 ° C økte renhet av antistoffet med en faktorto før kromatografiske rensing, mens oppgangen var lik den som ble observert uten forvelling.
I tillegg, som karakteriserer de enkelte HCP smeltetemperaturer av et ekspresjonssystem som kan lette identifiseringen av en temperatur med hvilken fremgangsmåten kan utføres i likhet med pasteurisering av melk: høy temperatur, kort tid 39. Varmebehandlingen (unntatt for forvelling) kan også anvendes på andre biologiske startmaterialer for å fjerne HCPs om produktet kan motstå de nødvendige temperaturer. Sistnevnte kan avvike fra de som er omtalt her hvis andre uttrykks plattformer som pattedyr cellekultursupernatanter blir behandlet. I alle fall bør den kost-nytte-forholdet tas hensyn til, det vil si, ikke fordelen av redusert HCP nivåer oppveie kostnadene for implementering av et varmebehandlingstrinn som forårsaker ytterligere investeringskostnader, øker prosesstiden og redusere produktet yieLD 16. En kritisk parameter i denne sammenheng er det produkt aktivitet. Hvis det avhenger av tilstedeværelsen av lineære epitoper som for noen protein-baserte vaksiner, deretter varmebehandling er ikke sannsynlig å ha en effekt 40. Hvis derimot proteinstruktur som er viktig, for eksempel for konformasjonelle epitoper, den nøyaktige orientering av aminosyre-sidekjeder i en enzymets aktive sete, eller den korrekte folding av antistoff komplementaritetsbestemmende regioner, en varmebehandling kan interferere med proteinaktivitet 41,42. Derfor bør egnede analyse analyser bli etablert for å overvåke ytelsen til produktet før og etter varmebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | SPR chip coupling kit |
| Autoclaving basket | Nalgene | 6917-0230 | Basket for leaf blanching |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM | Sequip | n.a. | Particle size analyzer |
| Blender | Waring | 800EG | Blender |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| CM5 chip | GE Healthcare | BR100012 | Chip for SPR measurements |
| Cuvette 10 x 10 x 45 | Sarsted | 67.754 | Cuvette for Zetasizer Nano ZS |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length) | n.a. (custom design) | n.a. | Heat exchanger |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K200P 60D | Pall | 5302303 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Lauda E300 | Lauda Dr Wobser GmbH | Z90010 | Water bath thermostat |
| L/S 24 | Masterflex | SN-06508-24 | Tubing |
| mAb 5.2 | American Type Culture Collection | HB-9148 | Vax8 specific antibody |
| Masterflex L/S | Masterflex | HV-77921-75 | Peristaltic pump |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Sodium disulfite | Carl Roth GmbH | 8554.1 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Stainless-steel vessel; 0.7 kg 2.0 L; height 180 mm; diameter 120 mm | n.a. (custom design) | n.a. | Container for heat precipitation |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence and spectrometric plate reader |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
| Zetasizer Software v7.11 | Malvern | n.a. | Software to operate the Zetasizer Nano ZS device |
References
- PhRMA. 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).
- Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).
- Melnik, S., Stoger, E. Green factories for biopharmaceuticals. Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production. J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal. Biotechnol. J. , (2015).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
- Ma, J. K., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).
- Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. Postharvest treatments of fresh produce. Philos T R Soc A. 372, (2014).
- Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Buyel, J. F. Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts. J. Vis. Exp. , e53940 (2016).
- Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. Surface plasmon resonance biosensing. Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).
- Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes. Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).
- Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli. Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).
- Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid. Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).
- Drake, P. M. W., et al. Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco. FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).
- Turpen, T. H. Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology. Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).
- Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method. Biomed. Res. Int. , (2014).
- Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
- Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells. Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).
- Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , Wiley. (1976).
- Lowe, D., et al. Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics. Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).
- Gong, R., et al. Engineered human antibody constant domains with increased stability. J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).
- Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. Stability engineering of the human antibody repertoire. FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).
- Stabel, J. R., Lambertz, A. Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk. J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).
- Wichers, H. Ch. 12. Managing Allergens in Food. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336 (2006).
- Davis, P. J., Williams, S. C. Protein modification by thermal processing. Allergy. 53, 102-105 (1998).
- Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase. J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).
