Summary

Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Published: October 16, 2018
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Summary

Este informe describe los protocolos para la caracterización de las interacciones entre proteínas de membrana externa bacteriana y la vitronectina de regulador del complemento humano. Los protocolos pueden utilizarse para estudiar las reacciones de enlace y función biológica de vitronectina en cualquier especie bacteriana.

Abstract

Las bacterias utilizan reguladores del complemento como un medio de evadir la respuesta inmune del huésped. Aquí, describimos protocolos para la evaluación de la adquisición de vitronectina de papel en los juegos de célula bacteriana superficial en la resistencia al sistema inmune anfitrión. Experimentos de citometría de flujo identifican vitronectina de plasma humano como un ligando de la proteína de membrana externa bacteriana del receptor H de Haemophilus influenzae tipo f. Un análisis enzima-ligado del inmunosorbente era empleado para caracterizar las interacciones proteína-proteína entre proteínas recombinantes purificadas H y vitronectina y atar afinidad se evaluó mediante interferometría de la bio-capa. La importancia biológica de la Unión de la vitronectina a H la proteína en la superficie de la célula bacteriana en evasión de la respuesta inmune del huésped fue confirmada usando una prueba de resistencia de suero con suero humano normal y vitronectina-agotado. La importancia de la vitronectina en la adhesión bacteriana se analizó utilizando portaobjetos de vidrio con y sin recubrimiento de vitronectina, seguido de la tinción de Gram. Por último, se investigó la adherencia bacteriana a las monocapas de células epiteliales alveolares humanas. Los protocolos descritos aquí pueden adaptarse fácilmente al estudio de cualquier especies bacterianas de interés.

Introduction

Vitronectina (Vn) es una importante glucoproteína humana implicados en el mantenimiento de la homeostasis a través de la regulación del sistema fibrinolítico. VN también funciona como un regulador del complemento mediante la inhibición de la vía del complemento terminal durante la formación de complejos de C5b6-7 y la polimerización de C9. Varios patógenos bacterianos se han demostrado para reclutar Vn a la superficie celular como medio de resistencia complemento deposición1,2,3. Además, Vn funciona como una molécula “sandwich” entre bacterias y receptores de las células epiteliales host, tal modo de promover la adhesión y la internalización de patógenos2,4,5. Unión de Vn a la superficie de la célula bacteriana está mediada por otras proteínas actualmente no identificados. Elucidar completamente el papel funcional de Vn-enlace de evasión de la respuesta inmune de la manguera por lo tanto requerirá identificación de proteínas Vn-reclutamiento.

El paso inicial en la identificación de proteínas de unión a Vn es probar si un patógeno de interés puede enlazar purificada Vn. flujo cytometry es un método conveniente y sencillo para determinar si Vn está limitado a las células del patógeno. En este estudio, se evaluó el atascamiento de Vn a varios Haemophilus influenzae tipo f (Hif) aislamientos clínicos6. El método descrito en este documento es cuantitativo y puede utilizarse para distinguir la capacidad de unión de una gran variedad de cepas bacterianas. En un estudio anterior hemos caracterizado proteína H (PH) de Hif como Vn vinculante proteínas7. Por lo tanto, en el presente estudio, el potencial de unión a Vn de los mutantes de tipo salvaje (WT) Hif y Hif M10Δlph se compararon utilizando los protocolos descritos.

Una vez que determine que un patógeno une Vn, el segundo paso es caracterizar el proteoma superficial con el fin de identificar potenciales proteínas Vn. Una variedad de enfoques se puede utilizar para este propósito8,9, pero estas metodologías no se describen en este informe. El método más adecuado para examinar las interacciones proteína-proteína es expresar las proteínas de la superficie bacterianas de e. coli por vía recombinante y purificar por cromatografía de afinidad. Aquí, utilizamos el PH y su interacción molecular con Vn para ilustrar el método. Interacciones entre recombinante PH y Vn se caracterizaron usando una enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo7 y una técnica recientemente desarrollada etiqueta-libre conocido como bio-capa interferometría (BLI)10,11. Mientras que Elisa puede utilizarse para confirmar las interacciones proteína-proteína, BLI proporciona datos detallados sobre los parámetros cinéticos de la interacción.

Para estudiar el papel funcional de Vn en la adhesión bacteriana, se pueden utilizar dos diferentes ensayos. El primer ensayo que se describe aquí es la medición directa de la adherencia bacteriana a las superficies de vidrio recubierto de Vn, mientras que el segundo ensayo examina adhesión a la superficie de las células epiteliales. Para el primer ensayo, portaobjetos fueron recubiertos con Vn y el atascamiento de WT o estirpes mutantes de Hif se evaluó por tinción de Gram y microscopía. Esta técnica distingue fácilmente las bacterias basadas en la capacidad de atar Vn12. Luego se analizó la adherencia bacteriana a las células de mamífero mediante la adición de bacterias cultivadas sobre una monocapa de células epiteliales alveolares de tipo II; fijación bacteriana se evaluó contando el número de la Colonia formando unidades (UFC). Bacterias adheridas e interiorizadas se pueden diferenciar en la presencia o ausencia de Vn4,13.

El papel de la adquisición de Vn en la resistencia bacteriana del suero fue evaluado usando un análisis de muerte de suero (es decir, la actividad bactericida del suero). Para evaluar la importancia de la adquisición de Vn en resistencia de suero, la actividad bactericida del suero Vn-agotado (VDS) se comparó con la del suero humano normal (NHS). El método utilizado fácilmente distingue Vn vinculante frente a bacterias no vinculante basadas en resistencia de suero. Utilizamos este método para estudiar el papel de Vn en la resistencia de suero de varios patógenos bacterianos4,12.

Se han reportado numerosos métodos para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. Aquí, describimos un conjunto de protocolos que se pueden adaptar fácilmente al estudio de cualquier agente patógeno con el fin de evaluar el papel de Vn en patogenesia. Hemos probado estos protocolos utilizando diversos agentes patógenos, y Hif fue elegido como un ejemplo para este informe.

Protocol

1. Análisis de Vn como un ligando de la proteína bacteriana de la superficie Detección de Vn-atascamiento en la superficie bacteriana mediante citometría de flujoNota: En citometría de flujo, utilizamos lado dispersión y dispersión hacia delante para puerta de sucesos positivos. Para examinar las interacciones con Vn, Hif clínico aislados (n = 10) fueron seleccionados7 junto con e. coli BL21 (DE3) como control negativo (figura 1…

Representative Results

VN-Unión a la superficie de las bacterias fue determinada por citometría de flujo. Hif todos los aislados clínicos probados en este estudio reclutó a Vn a la superficie de la célula. Se observó ninguna interacción de Vn con la superficie de la célula para la cepa de control negativo e. coli (figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, el PH es una importante proteína Vn en la s…

Discussion

Patógenos bacterianos reclutan Vn a la superficie de la célula y utilizan este regulador complemento para evitar la deposición de los factores de complemento y completar el complejo de ataque de membrana2. VN también funciona como una molécula puente entre proteínas de la superficie bacterianas y receptores de superficie celular host, permitiendo así que los patógenos se adhieren a la superficie de las células epiteliales y posteriormente median internacionalización. En este estudio, se …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Anna y Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. y Edla Johansson Foundation, el Consejo de investigación médica sueco (concesión número K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fundación de cáncer en la Universidad Hospital de Malmö, la sociedad fisiográfica (Fundación de Forssman) y del Consejo de Condado de Skåne investigación y Fundación para el desarrollo.

Materials

1.5 mL thermomixter Eppendorf 5355 dry block heating and cooling shaker
5 mL polystyrene round-bottom tube  BD Falcon 60819-138 12 × 75 mm style
5% CO2 supplied incubator  Thermo Scientific  BBD6220
6 mL polystyrene round-bottom tube  VWR 89000-478 12 × 75 mm style with cap
24-well plates BD Falcon 08-772-1H Cell culture grade
30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution Sigma-Aldrich H1009-100ML Laboratory analysis grade
75 cm2 tissue culture flask BD Falcon BD353136 Vented
96 well black flat bottom plate Greiner Bio-One 655090 Tissue culture treated µClear black plates
A549 Cell Line human Sigma-Aldrich 86012804-1VL
Cell detachment enzyme (Accutase)  Sigma-Aldrich A6964-500ML Cell Culture Grade
AR2G sensors Pall Life Science 18-5095 Sensor to immobilized protein by amino coupling 
Acetone VWR 97064-786 Analysis grade
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A2058 Suitable for cell culture
Bibulous paper  VWR 28511-007
Bio-layer interferometer Pall Life Science FB-50258 Bilayer interferometry measuring equipment
Crystal violet solution Sigma-Aldrich HT90132-1L
C4BP (C4b binding protein) Complement Technology, Inc. A109 Bought as Frozen liquid form
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
Carbol-fuchsin solution Sigma-Aldrich HT8018-250ML
Citric acid Sigma-Aldrich 251275-500G American Chemical Society (ACS) grade
Decolorizing solution Sigma-Aldrich 75482-250ML-F
E. coli host (E. Coli BL21) Novagen 69450-3 Protein expression host
F12 medium Sigma-Aldrich D6421 Cell Culture Grade
Flow cytometer  BD Biosciences 651154 Cell analysis grade for research applications 
Fetal Calf Serum (FCS) Sigma-Aldrich 12003C Suitable for cell culture
Normal human serum (NHS) Complement Technology, Inc. NHS Pooled human serum
FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies  AbD Serotec STAR88F Polyclonal
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Cell culture grade
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Suitable for cell culture
Hemocytometer Marienfeld 640210
HRP-conjugated anti-His tag antibodies Abcam ab1269 Polyclonal
Human factor H Complement Technology, Inc. A137 Bought as Frozen liquid form
C4BP Complement Technology, Inc. A109 Frozen solution
Human serum albumin Sigma-Aldrich A1653-10G lyophilized powder
Histidine affinity resin column (HisTrap HP) GE Health Care Life Science 17-5247-01 Columns prepacked with Ni Sepharose
His-tagged PH Recombinantly expressed and purified in our lab
Iodine solution Sigma-Aldrich HT902-8FOZ
Methanol VWR BDH1135-1LP Analysis grade
 Microscope Olympus IX73 Inverted microscope
Microscope slides Sigma-Aldrich S8902 plain, size 25 mm × 75 mm 
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266-1KG
Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) Novagen 69862-3 DNA vector
Polysorb microtitre plates  Sigma-Aldrich M9410 For ELISA
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 6009 American Chemical Society (ACS) grade
Sheep anti-human Vn antibodies AbD Serotec AHP396 Polyclonal
Shaker  Stuart Scientific STR6 Platform shaker
Tissue culture flask BD Falcon 3175167 75 cm2
 Thermomixer  Sigma-Aldrich T3317 Dry block heating and cooling shaker
Tetramethylbenzidine Sigma-Aldrich 860336-100MG ELISA grade
Vitronectin (Vn) from human plasma Sigma-Aldrich V8379-50UG cell culture grade

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Cite This Article
Singh, B., Mostajeran, M., Su, Y., Al-Jubair, T., Riesbeck, K. Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance. J. Vis. Exp. (140), e54653, doi:10.3791/54653 (2018).

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