Summary
Dit verslag beschrijft protocollen voor het karakteriseren van interacties tussen bacteriële buitenmembraan proteïnen en de menselijke aanvulling regelgever vitronectin. De protocollen kunnen worden gebruikt om de bindende reacties en biologische functie van vitronectin in elke bacteriesoorten te studeren.
Abstract
Aanvulling regelgevers bacteriën gebruiken als een middel om de immuunrespons van de gastheer te ontduiken. We beschrijven hier protocollen voor de beoordeling van de overname van de vitronectin rol in de bacteriële cel oppervlakte speelt in verzet tegen het immuunsysteem van de gastheer. Stroom cytometry experimenten geïdentificeerd menselijk plasma vitronectin als ligand voor de bacteriële receptor buitenmembraan proteïne H van Haemophilus influenzae type f. Een enzym-verbonden immunosorbent analyse te karakteriseren van de eiwit-eiwit interacties tussen gezuiverde recombinante eiwitten H en vitronectin werkzaam was, en bindende affiniteit werd beoordeeld met behulp van bio-laag interferometrie. Het biologische belang van de binding van vitronectin aan proteïne H aan het oppervlak van de bacteriële cel in ontduiking van de immuunrespons van de gastheer werd bevestigd met behulp van een bepaling van de weerstand serum met normale en vitronectin-verarmd menselijk serum. Het belang van vitronectin in de naleving van de bacteriële werd geanalyseerd via glas dia's met en zonder vitronectin coating, gevolgd door de Gram-kleuring. Ten slotte, bacteriële hechting op menselijke alveolaire epitheliale cel monolayers werd onderzocht. De hier beschreven protocollen kunnen gemakkelijk aangepast worden aan de studie van eventuele bacteriële soorten van belang.
Introduction
Vitronectin (Vn) is een belangrijke menselijke glycoproteïne die betrokken zijn bij het handhaven van de homeostase via regulering van het fibrinolytic systeem. VN functioneert ook als een regulator aanvulling door remming van de terminal complement pathway tijdens de complexvorming C5b6-7 en C9 polymerisatie. Verschillende bacteriële pathogenen hebben aangetoond dat het werven van de Vn aan het celoppervlak als een middel voor verzet tegen aanvulling afzetting1,2,3. Bovendien functioneert Vn als een "sandwich"-molecuul tussen bacteriën en host epitheliale cel receptoren, aldus bevordering van naleving en internalisering van ziekteverwekkers2,4,5. Binding van de Vn aan de oppervlakte van de bacteriële cel wordt gemedieerd door andere momenteel onbekend eiwitten. Volledig het ophelderen van de functionele rol van Vn-binding in ontduiking van de immuunrespons van de slang zal daarom identificatiegegevens van Vn-werven eiwitten nodig.
De eerste stap bij het identificeren van de Vn-bindende proteïnen is om te testen of een ziekteverwekker van belang gezuiverde Vn. stroom cytometry binden kunt is een handige en eenvoudige methode om te bepalen of de Vn is gebonden aan pathogen cellen. In deze studie beoordelen we de binding van de Vn aan verschillende Haemophilus influenzae type f (Hif) klinische isolaten6. De hier beschreven methode is kwantitatieve en kan worden gebruikt om te onderscheiden van de bindingscapaciteit van een breed scala van bacteriestammen. In een eerdere studie, we eiwit H (PH) van Hif gekenmerkt als een Vn-bindende eiwit7. Daarom, in de huidige studie, het Vn-bindende potentieel van wild-type (WT) Hif en Hif M10Δlph mutanten werden vergeleken met behulp van de beschreven protocollen.
Zodra vaststaat dat een ziekteverwekker Vn bindt, is de tweede stap te karakteriseren de oppervlakte Proteoom teneinde potentiële Vn-bindende proteïnen. Een aantal verschillende benaderingen kan worden gebruikt voor dit doel8,9, maar deze methoden zijn niet in dit verslag beschreven. De methode die het meest geschikt voor de behandeling van eiwit-eiwitinteractie is te recombinantly express geselecteerde bacteriële oppervlakte-eiwitten in E. coli en te zuiveren door chromatografie van de affiniteit. We gebruiken hier, PH en de moleculaire interactie met de Vn ter illustratie van de methode. Interacties tussen recombinante PH en Vn werden gekenmerkt met behulp van een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)7 en een onlangs ontwikkelde, label-vrije techniek die bekend staat als bio-laag interferometrie (BLI)10,11. Overwegende dat de ELISAs kan worden gebruikt ter bevestiging van eiwit-eiwitinteractie, biedt BLI gedetailleerde gegevens met betrekking tot de kinetische parameters voor de afzonderlijke interacties.
De functionele rol van de Vn in de naleving van de bacteriële studeren, kunnen twee verschillende tests worden gebruikt. De eerste bepaling hier beschreven is rechtstreekse meting van bacteriële naleving van Vn-gecoate glazen oppervlakken, terwijl de tweede test aanhankelijkheid aan het oppervlak van epitheliale cellen onderzoekt. Voor de eerste assay, glas dia's waren bedekt met de Vn en de binding van WT of mutant Hif stammen werd beoordeeld door Gramkleuring en microscopie. Deze techniek onderscheidt gemakkelijk bacteriën op basis van het vermogen om te binden Vn12. Bacteriële hechting op zoogdiercellen werd vervolgens geanalyseerd door de toevoeging van de gekweekte bacteriën op een monolayer van type II alveolaire epitheliale cellen; bacteriële bijlage werd beoordeeld door het tellen van het aantal kolonie-vormende eenheden (CFUs). Zelfklevend en verinnerlijkte bacteriën kunnen worden onderscheiden in de aanwezigheid of afwezigheid van Vn4,13.
De rol van de acquisitie van de Vn in bacteriële serumresistentie werd geëvalueerd aan de hand van een serum doden assay (d.w.z., serum bactericide activiteit). Om de beoordeling van de omvang van de overname van de Vn in serumresistentie, werd de bactericide activiteit van Vn-verarmd serum (VDS) vergeleken met die van normale menselijk serum (NHS). De methode gebruikt gemakkelijk onderscheidt Vn-bindende versus niet-bindende bacteriën op basis van serumresistentie. Wij gebruikte deze methode om de rol van de Vn in de serumresistentie van verschillende bacteriële pathogenen4,12te bestuderen.
Tal van methoden zijn voor het bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties gemeld. Hier beschrijven we een aantal protocollen die kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van eventuele pathogenen teneinde de rol van de Vn in de pathogenese. Wij testten deze protocollen met verschillende ziekteverwekkers, en Hif werd gekozen als een voorbeeld voor dit verslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. analyse van de Vn als een bacteriële oppervlakte-proteïne-Ligand
-
Detectie van Vn-inbinden op de bacteriële oppervlakte met behulp van stroom cytometry
Opmerking: In stroom cytometry, we gewend kant scatter en voorwaartse scatter gate positieve gebeurtenissen. Onderzoek naar de interacties met de Vn, Hif klinische isolaten (n = 10)7 samen met E. coli BL21 werden geselecteerd (DE3) als een negatieve controle(Figuur 1).- Cultuur Hif klinische isolaten in hersenen-hart infusie (BHI) medium aangevuld met 10 µg/mL NAD en Hemine bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut. Gebruik Luria Bertani medium tot cultuur van E. coli14. Hif oogsten in Midden log fase (OD600 = 0.3)15, en resuspendeer de bacteriën in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,2, met 1% (m/v) bovien serumalbumine (BSA) (buffer met blokkerend; PBS-BSA). Aanpassen van de schorsing tot en met 109 CFU/mL.
- Breng de aliquots met 5 x 106 CFU 5 mL polystyreen ronde onderkant buizen (12 x 75 mm2) en voeg 1 mL blokkeerbuffer toe. Centrifugeer de schorsing bij 3.500 × g bij kamertemperatuur (RT)16 gedurende 5 minuten om de bacteriën pellet, en vervolgens zorgvuldig gecombineerd om de bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder de pellet te verstoren.
- Resuspendeer de bacteriële pellets met 50 μl van buffer met blokkerend met 250 nM Vn en Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij RT zonder schudden. Na incubatie, pellet de bacteriën door centrifugeren bij 3500 x g gedurende 5 minuten, dan wassen van de pellets drie keer met PBS en vergelijkbare centrifugeren stappen.
- Toevoegen aan de bacteriële pellet, 50 μl van primaire schapen anti-menselijke Vn polyclonal antilichamen (pAbs) bij 1:100 verdunning in PBS-BSA. Incubeer de schorsing gedurende 1 uur bij RT, dan wassen de bacteriën driemaal met PBS voor het verwijderen van niet-afhankelijke antistoffen (zoals beschreven in stap 1.1.3).
- Voeg vervolgens toe 50 μl van PBS-BSA met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd ezel anti-schapen pAbs (1:100 verdunning) en Incubeer bij RT gedurende 1 uur in het donker.
- Bereid een blanco-controle door bacteriën met het blokkeren van buffer alleen en pAbs zonder de Vn aan het broeden.
- Wassen van bacteriën driemaal met 1 mL blokkeerbuffer- and -pellet de opschorting door middel van centrifugeren, zoals beschreven in punt 1.1.2. Ten slotte, resuspendeer de bacteriële pellet met 300 µL van PBS en analyseren door stroom cytometry7.
-
ELISA analyse van de interactie tussen recombinante PH en Vn
Opmerking: Besturingselementen moeten worden opgenomen om uit te sluiten van niet-specifieke binding. Menselijke Factor H (FH) of C4b-bindend proteïne (C4BP) worden gebruikt als de positieve en negatieve controles, respectievelijk.- Verdun elk van de menselijke eiwitten (Vn, FH en C4BP) afzonderlijk tot 50 nM in Tris-HCl, pH 9.0 (coating buffer). Afzien 100 µL van eiwit oplossing in ieder putje van een plaat van de microtiterplaat Polysorp. Sluit de platen met het deksel en bewaren bij 4 ° C's nachts (16u) ter vergemakkelijking van de immobilisatie van eiwitten op de microtiterplaat plaat wells.
- De oplossing van de microtiterplaat plaat negeren door het kantelen van ondersteboven boven de gootsteen en was de putjes drie keer met 300 µL van PBS per putje. Het blokkeren van de gecoate putten voor 1 h bij RT met PBS met 2,5% (m/v) BSA (PBS-BSA).
- Na het verwijderen van de blokkerende oplossing, was de putjes drie keer met 300 µL van PBS met 0,05% (v/v) Tween-20 (PBST) per putje. Voeg 100 µL van 50 nM recombinant zijn-gelabeld PH ten slotte op elk monster goed en incubeer gedurende 1 h op RT. Voeg slechts 100 µL van PBS-BSA in de controleputjes.
Opmerking: Het gen van de lph codering PH van Hif was versterkt door PCR en gekloond in de pET26b expressie vector die een 6 × zijn-tag in het C-terminus van de uitgesproken proteïne voegt. De recombinante vector omgetoverd tot E. coli BL21(DE3) voor expressie. Ni-NTA hars werd gebruikt voor het zuiveren van de recombinante eiwitten15. - Negeren van de eiwit-oplossing en de niet-afhankelijke eiwitten verwijderen door te wassen de putjes drie keer met PBST 300 µL per putje. Voeg 100 µL van met mierikswortelperoxidase PBS-BSA (HRP)-geconjugeerd anti-zijn pAbs (1:10, 000 verdunning) en incubeer gedurende 1 h op RT.
- Bereid 20 mM oplossing A door ontbinding tetramethylbenzidine in een oplossing van 5% aceton en 45% methanol. Ter voorbereiding van oplossing B, los 19,2 g citroenzuur in 1000 mL van H2O, breng de pH op 4,25 door toevoeging van KOH, dan Voeg 230 µL van 30% H2O2. Opslaan van beide oplossingen in het donker op RT. Meng 500 µL van oplossing B met 9.5 mL van oplossing A te bereiden de ELISA detectie reagens vlak voor gebruik.
- Was de putjes drie keer met PBST 300 µL per putje en antigeen-antilichaamcomplexen detecteren door 100 µL van ELISA detectie reagens toe te voegen aan elk putje.
- Voeg 50 µL van 1 M H2dus4berichten om te stoppen met de reactie. Meet de extinctie van de putten bij 450 nm met behulp van een microplate-lezer.
-
Studie van de interactie-kinetiek van recombinante PH en Vn met behulp van BLI
- Immobiliseren menselijke Vn op amine-reactieve sensoren met behulp van de amine koppeling methode, volgens de fabrikant richtsnoeren11.
- Met behulp van PBS, serieel Verdun de ligand (recombinant PH) van 0 tot 4 µM en breng de resulterende oplossingen aan een 96-Wells zwart, flat-onderkant microtiterplaat plaat. Voer het experiment bij 30 ° C met behulp van een BLI instrument17.
- De datamap in de BLI software voor de analyse van de gegevens te laden. Selecteer de optie 'sensor selectie' . Dan, selecteer 'reference goed' (Vn-gecoate sensor in PBS) voor aftrekken.
- Selecteer 'uitlijnen y-as op basislijn' en selecteer 'interstep correctie en uitlijnen aan vereniging'. Druk op 'procesgegevens"die automatisch het tabblad analyse opent.
- Selecteer in het tabblad analyse de 'associatie en dissociatie' optie onder curve-fitting. Selecteer het model ' 1:1 bindende en globale montage '. Druk op 'kromme die past' en export fitting gegevens17.
2. de karakterisering van de rol van de Vn in de naleving van de bacteriële
-
Onderzoek naar bacteriële naleving van Vn-gecoate glazen oppervlakken
- Bereid een 2 µg/mL oplossing voor Vn in PBS en Pipetteer 10 µL van deze oplossing op een glas Microscoop dia als een enkele druppel. Staat de daling te drogen de dia 30 min op RT. vacht op een dia met menselijk serum albumine (HSA) als een negatieve controle.
- Spoel de eiwit-gecoat glas dia's driemaal door de dia's gedurende twee seconden te dompelen in een bekerglas van PBS Schakel overtollige ongecoate eiwit. Voeg 20 mL van de verse Hif cultuur (beschreven in stap 1.1.1) in een steriele kunststof petrischaal en dompelen de Vn- / HSA-gecoat glas dia's in het kweekmedium. Incubeer de gerechten bij 37 ° C gedurende 1 uur met schudden bij 20 omwentelingen per minuut.
Opmerking: Hif M10 en Hif M10Δlph waren gegroeid in BHI opgietvloeistof of op chocolade agar platen. Het medium voor de lph mutant werd aangevuld met 10 µg/mL kanamycine15. - Na incubatie, verwijdert u niet-afhankelijke bacteriën door dompelen de dia's drie keer in een bekerglas gevuld met PBS. Visualiseer bacteriën door Gram-kleuring, zoals beschreven.
- Verwijder overtollige PBS uit elke dia door het kantelen en aanraken van de rand op papieren zakdoekje. Drogen van de dia's voor 3-5 min op RT, en monteren van zelfklevend bacteriën door het passeren van elke dia drie keer boven een vuur.
- Houd de dia door de randen met twee vingers op een kleuring dienblad, dan Voeg 3-4 druppels (200 – 300 µL) van 2,3% kristalvioletoplossing. Wacht 60 s, dan wassen de dia's onder een zachte stroom van de kraan water voor 3-4-s.
- Voeg 3-4 druppels jodiumoplossing 0,33% in de dia's. 1 min wachten, vervolgens de dia te spoelen onder een zachte stroom van leidingwater. Zorgvuldig droog de dia's door vloeipapier.
- Voeg 3-4 druppels decolorizing oplossing met 75% isopropylalcohol en 25% aceton in de dia verschijnt. Na 5-10 s, door de dia te wassen onder een zachte stroom van leidingwater.
- Voeg 3-4 druppels (200 – 300 µL) van fundamentele carbolfuchsin oplossing. 1 min wachten, vervolgens de dia's te spoelen onder een zachte stroom van leidingwater. Droog de dia's met behulp van vloeipapier.
- Visualiseer de bacteriën onder een lichte Microscoop, een olie-immersie objectief bij 100 X vergroting18selecteren. Vergelijk de hechting van de Hif WT en gemuteerde bacteriën op de Vn - en HSA-gecoate glazen oppervlakken.
-
Studie van de Vn-afhankelijke aanhechting van bacteriën aan epitheliale cellen
Opmerking: Deze efficiënte naleving assay werd gebruikt in onze eerdere studies4,7.- Cultuur A549 cellen (type II alveolaire epitheliale cellen) in een maatkolf van 75 cm2 weefselkweek met F12 medium aangevuld met 10% (vol/vol) foetaal kalfsserum (FCS) (volledige medium) en 5 µg Mn/mL gentamicine. Incubeer de kolf in een broedmachine met 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 3 dagen tot 80% heuvels (confluentie kan worden geschat door het visualiseren van oppervlakte dekking door de cellen met behulp van omgekeerde Microscoop). De volgende vier stappen wordt beschreven hoe voor te bereiden op de epitheliale cellen de assay19,20.
- De cel enkelgelaagde in de kolf tweemaal met 20 mL PBS wassen door zachte zwenken. Als u wilt loskoppelen van de cellen van het oppervlak van de kolf, voeg toe 2 mL cell detachement enzym oplossing en Incubeer de kolf gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Tik op de kolf met uw palm loskoppelen van alle cellen van het plastic oppervlak. Pipetteer omhoog en omlaag een paar keer om te dispergeren cel klontjes.
- 18 mL F12 volledige voedingsbodem Voeg aan de maatkolf en de gehele celsuspensie overbrengen in een tube van 50-mL steriele Falcon. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 x g bij RT en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 10 mL F12 volledige voedingsbodem.
- Verwijderen van 10 µL van de celsuspensie en plaatst u deze in een buis Eppendorf, voeg dan 90 µL van Trypan blauwe oplossing. Laden van het monster in een hemocytometer (diepte 0.1 mm) na het plaatsen van het dekglaasje aan.
- Tellen alle levensvatbare cellen in gebieden A, B, C en D (elk veld bestaat uit 16 pleinen en elk vierkant heeft een oppervlakte van 0.0025 mm2), dan het berekenen van het gemiddelde aantal cellen ([A + B + C + D] / 4). Het aantal cellen per milliliter met behulp van de volgende vergelijking berekenen:
Levensvatbare cellen/mL = gemiddelde cel graaf 10 ×4 × verdunning factor20.
Opmerking: Hier, is de verdunningsfactor 10. - Verdun de celsuspensie naar 5.0 x 103 cellen/mL met behulp van de volledige middellange met 5 µg/mL gentamicine. Afzien 500 μL van celsuspensie in elk putje van de plaat van een 24-well cel cultuur. Incubeer de plaat bij 37 ° C in 5% CO2 totdat de cellen 90% heuvels zijn.
- Voorafgaand aan de bacteriële infectie, verwijder het medium van de putten en voeg F12 medium (zonder FCS), dan na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
- Wassen van de cel enkelgelaagde driemaal met 500 µL van PBS op RT. plaats de plaat op ijs en voeg 100 µL van vooraf gekoeld F12 medium met 10 µg/mL van Vn. Incubate plaat bij 4 ° C gedurende 1 uur. Voor controleputjes, voegt u alleen F12 medium.
- Na incubatie, negeren de oplossing door pipetteren en spoelen de cellaag tweemaal met 1 mL PBS op RT. resuspendeer een cultuur van vers geteelde Hif M10 (stap 1.1.1) op F12 medium (2 × 108 CFU/mL). Voeg 100 µL van deze bacteriële suspensie aan elk putje en Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 ° C.
Opmerking: Elk goed bevat ongeveer 2 x 105 A549 cellen. Voor infectie, 2 x 107 bacteriële kve werden toegevoegd, overeenkomt met een veelheid aan infectie van 100. - Verwijder het medium door pipetteren en wassen van de epitheliale cellen van de A549 driemaal met PBS. Voeg 50 µL per putje van cel detachement oplossing en Incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Voeg vervolgens toe 50 µL van de volledige medium F12 per putje te stoppen met de enzymatische reactie. De epitheliale cellen (≈100 μL [dat wil zeggen, het gehele volume]) van elk putje overbrengen naar een 6-mL glazen buis met vier glazen kralen. Lyse de cellen op RT door vortexing gedurende 2 minuten.
- Verdun 10 µL van de cel lysate 100-fold door toevoeging van 10 µL van lysate aan 990 µL van F12 medium. Plaat 10 µL van het verdunde monster op een chocolade agarplaat.
- Na een nacht bebroeden de chocolade agarplaat bij 37 ° C, dan tellen de kolonies. Elke kolonie vertegenwoordigt één CFU.
- Cultuur A549 cellen (type II alveolaire epitheliale cellen) in een maatkolf van 75 cm2 weefselkweek met F12 medium aangevuld met 10% (vol/vol) foetaal kalfsserum (FCS) (volledige medium) en 5 µg Mn/mL gentamicine. Incubeer de kolf in een broedmachine met 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 3 dagen tot 80% heuvels (confluentie kan worden geschat door het visualiseren van oppervlakte dekking door de cellen met behulp van omgekeerde Microscoop). De volgende vier stappen wordt beschreven hoe voor te bereiden op de epitheliale cellen de assay19,20.
3. analyse van Vn-afhankelijke weerstand tegen de bactericide activiteit van menselijk Serum
- De NHS van de aankoop van een commerciële bron. VDS bereiden als eerder beschreven12. Vullen van de VDS met 180 nM Vn die gelijk is aan Vn in NHS aanwezig.
- Warmte-geïnactiveerd serum (HIS) voor te bereiden door verwarming van NHS bij 56 ° C gedurende 30 minuten om de inactivering van aanvulling eiwitten.
Opmerking: De optimale serumconcentratie (5%) en de incubatietijd (15 min) voor de assay beschreven in stap 3.3 – 3.7 werden empirisch bepaald voor Hif15; deze parameters kunnen verschillen voor andere bacteriële pathogenen. - Cultuur van bacteriën (in dit geval, Hif M10 en de mutant Hif M10Δlph) tot halverwege log fase (OD600 = 0,3). Pellet bacteriën door centrifugeren bij 3500 x g gedurende 10 minuten.
- Resuspendeer de bacteriële pellet met 1 volume van 0,1% (wt/vol) gelatine, dextrose gelatine Veronal buffer (aangesloten++; pH 7.3) met 2,5% (m/v) glucose, 2 mM MgCl2en 0,15 mM CaCl2.
- Toevoegen van 1.5 x 103 CFU van bacteriën tot 100 µL van de aangesloten++ met 5% serum (NHS, zijn, VDS, of VDS + 180 nM Vn). Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 15 minuten met schudden bij 300 omwentelingen per minuut.
- Verwijder een aliquoot 10 µL van het reactiemengsel op 0 min (T0 monster) en 15 min (Tt monster) en plaat op chocolade agar. Incubeer de plaat bij 37 ° C's nachts.
- Na incubatie, tellen de kolonies op de plaat. Bereken het percentage van de bacteriën gedood12 met behulp van de volgende vergelijking: (CFU op T-t) / (CFU bij T0) × 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VN-binding aan het oppervlak van bacteriën werd bepaald door stroom cytometry. Alle Hif klinische isolaten getest in deze studie aangeworven Vn aan het celoppervlak. Geen interactie van de Vn met het celoppervlak werd waargenomen voor de negatieve controlestam van E. coli (Figuur 1). Zoals blijkt uit Figuur 1B, is PH een belangrijke Vn-bindend-proteïne op het oppervlak van cellen van de Hif. Binding van de Vn door de WT Hif stam veroorzaakt M10 een verschuiving in de bevolking, overwegende dat Hif M10Δlph deed niet bindend Vn en lijkt op het besturingselement verscheen.
Eiwit-eiwit interacties tussen PH en Vn werden geraamd door ELISA en BLI. Recombinante PH werd toegestaan om te binden met de menselijke factor H, Vn en C4BP (negatieve controle) coating op de putjes van de microtiterplaat ELISA-plaatjes. Gebonden PH werd geschat met behulp van een anti-zijn pAbs. De resultaten duidelijk aangegeven een belangrijke interactie tussen PH en de Vn en de factor H, in vergelijking met C4BP(Figuur 2). Interactie tussen PH en Vn waren in real time via BLI geschat. Figuur 2 B toont PH bindend antwoord curven voor de Vn-gecoate sensoroppervlak. Bindende affiniteit (in dit geval, Kd = 2.2 µM) werd geschat door het aanbrengen van de gegevens aan bindende steady-state kinetiek.
Bacteriën ontbreekt uitdrukking van de PH op het celoppervlak (Hif M10Δlph) tentoongesteld verminderd naleving van Vn-gecoate glazen oppervlakken in vergelijking met WT cellen (Figuur 3A). Daarnaast is de aanwezigheid van de Vn op het oppervlak van epitheliale cellen aanzienlijk verbeterd de hechting van de Hif (Figuur 3B). Deze resultaten aangegeven dat de PH-Vn-interactie aanzienlijk tot de naleving van de bacteriële bijgedragen.
VN is een bekende aanvulling-remmer. Als u wilt schatten de aanvulling-remmende activiteit, serum-gemedieerde doden werd onderzocht in de aanwezigheid en afwezigheid van Vn. WT Hif cellen tentoongesteld hogere serumresistentie dan M10Δlph mutantcellen. Geen bacteriën gedood in het bijzijn van zijn (Figuur 4A). Interessant, WT Hif tentoongesteld verminderde overleving in VDS, en aanvulling van Vn verhoogd bacteriële overleven. Echter reageren de Hif M10Δlph stam niet op Vn uitputting omdat het niet Vn aan het celoppervlak (Figuur 4B werven kon). Deze resultaten tonen duidelijk aan dat Vn is een belangrijke gastheer factor die bacteriën aanvulling-bemiddelde doden (Figuur 4A-B beschermt).
Figuur 1 : Haemophilus influenzae serotype f bindt Vn via oppervlak-uitgedrukt PH. (A) stroom cytometry resultaten tonen van de binding van de Vn naar cellen van Hif klinische isolaten. Elke klinische isolaat (5 x 106 van CFU) was geïncubeerd met 250 nM mens Vn. Bound ligand werd ontdekt met behulp van een anti-Vn-pAbs van schapen en de ezel FITC-geconjugeerd anti-schapen secundaire antilichamen. Escherichia coli BL21 (DE3) werd opgenomen als een negatieve controle. Gegevens worden gepresenteerd zoals de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde uit drievoudige analyses in drie aparte experimenten, en foutbalken vertegenwoordigen SD. (B) stroom cytometry histogrammen tonen van de binding van de Vn op het oppervlak van WT Hif M10 en PH-schrapping Hif M10Δ lph mutant. Representatieve gegevens uit een van de drie aparte experimenten worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Recombinante PH bindt aan Vn. (A) ELISA resultaten aantonen van de binding van recombinante PH Vn, FH en C4BP. FH werd gebruikt als positieve controle, terwijl C4BP werd gebruikt als een negatieve controle. Voor het analyseren van eiwit-eiwitinteractie, Vn, FH en C4BP waren bekleed met mengsel (50 nM) concentraties op de putjes van de microtiterplaat platen. Volgende, 50 nM recombinant PH-His6x is toegevoegd. Gebonden PH werd ontdekt met behulp van een HRP-geconjugeerde anti-zijn pAbs. Gegevens worden weergegeven zijn de middelen van drievoudige analyses uit drie onafhankelijke experimenten en foutbalken geven SD. ***, P-≤0.001. (B) BLIanalysis van PH binding aan Vn: Recombinant Vn werd geïmmobiliseerd op AR2G-sensoren, en de bindende kinetiek van PH (0.25-4 µM) aan de Vn werden opgenomen met behulp van het instrument BLI. De affiniteit van de evenwichtsconstante was berekend op basis van signalen verkregen voor elke concentratie bij evenwicht en de gegevens werden uitgerust volgens de steady-state kinetiek. Het experiment werd herhaald drie keer, en één vertegenwoordiger dataset wordt weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Interactie tussen PH en Vn verbetert bacteriële aanhankelijkheid aan glazen oppervlakken en epitheliale cellen. (A) licht microscopische afbeeldingen tonen hechting van Hif op Vn-gecoat glas dia's. Bacteriën zijn gevisualiseerd door Gram-kleuring. Representatieve beelden uit een van de drie onafhankelijke experimenten worden getoond. Dit paneel werd eerder gepubliceerd in de Journal of Immunology7 en hier is gereproduceerd met toestemming van de Amerikaanse vereniging van immunologen. (B) hechting van WT Hif M10 cellen aan de epitheliale cellen van de A549 in de aanwezigheid en de afwezigheid van de Vn, vervoermiddel drievoudige analyses van drie onafhankelijke experimenten worden uitgezet en foutbalken vertegenwoordigen SD. *, p ≤0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Vn gerekruteerd om het celoppervlak Hif beschermt serum-gemedieerde doden bacteriën. (A) WT Hif M10 en mutant Hif M10Δlph werden geïncubeerd gedurende 15 min. in 5% NHS of zijn. (B) weerstand van Hif M10 en Hif M10Δlph aan bactericide effecten in 5% VDS en VDS aangevuld met 250 nM gezuiverd Vn. gegevens vertegenwoordigen vervoermiddel drievoudige analyses van drie onafhankelijke experimenten en foutbalken geven SD. ***, p ≤0.001; NS, niet significant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bacteriële pathogenen Vn werven aan het celoppervlak en gebruik maken van deze aanvulling regulator om te voorkomen dat de afzetting van aanvulling factoren en de voltooiing van de membraan aanval complexe2. VN functioneert ook als een molecule van de brug tussen bacteriële oppervlakte-eiwitten en host cel oppervlakte receptoren, waardoor ziekteverwekkers te houden aan het oppervlak van epitheliale cellen en vervolgens bemiddelen internalisering. In deze studie beschrijven we protocollen die kunnen worden gebruikt om te schatten i) binding van de Vn aan het oppervlak van bacteriële cellen, ii) eiwit-eiwitinteractie en affiniteit constanten, en iii) de functionele rol van Vn bij het verstrekken van serumresistentie en verhoging van de naleving van het oppervlak van cellen van de gastheer.
Stroom cytometry is een kwantitatieve techniek vaak gebruikt om te verifiëren dat bacteriën Vn binden. Echter, de concentratie van de Vn moet worden geoptimaliseerd, zoals de Vn-bindingscapaciteit (en verschillende receptoren) afhankelijk van de bacteriële soorten verschillen kunnen. In de bepaling die hier worden beschreven, werden 1 – 100 µg/mL Vn gebruikt om de schatten van lineaire bindende en verzadiging parameters. Vergelijking van de bindende patronen van WT Hif Hif M10Δlph mutant en negatieve controle E. coli cellen toonde een duidelijk verschil bij een concentratie van de Vn van 20 µg/mL (250 nM). Deze concentratie werd daarom gebruikt in alle stroom cytometry experimenten. Het gebruik van de Vn bij concentraties boven de verzadiging punt kon vals-positieve signalen produceren. Verdunning van de primaire en secundaire antilichamen moet ook afzonderlijk worden geoptimaliseerd voor elke ziekteverwekker. De maximale verdunning van de antilichamen tonen van een goed signaal moet worden gekozen. In deze studie gebruikten we 2,5% BSA als een blokkerende agent. BSA is echter niet een universele blokkerende reagens geschikt voor alle ziekteverwekkers. In gevallen waarin BSA niet niet-specifieke antilichaam interactie blokkeert, kunnen andere blokkerende reagentia worden gebruikt, zoals vis gelatine. Binding van de Vn aan het oppervlak van cellen van de bacteriële ziekteverwekker is vaak gemedieerd door meerdere receptoren21,22. Sommige receptoren hebben hoge Vn-bindende affiniteit, terwijl anderen de lage bindende affiniteit kunnen vertonen. Dus, kan verwijdering van slechts één gen codering van een oppervlakte-proteïne niet leiden tot een afname van de Vn interacties door stroom cytometry beoordeeld. Als alternatief voor stroom cytometry, kan binding aan eiwitten op het oppervlak van de bacteriële cel worden onderzocht met behulp van een bepaling van de immunofluorescentie (IFA) of transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Hoewel photobleaching van fluororeagent-geconjugeerde antilichamen kan problematisch zijn in zowel stroom cytometry en IFAs, gaat TEM omslachtig monstervoorbereiding, met aanzienlijke risico's van de invoering van artefacten23,24. Stroom cytometry analyse is inderdaad beter om de IFA en TEM als gevolg van eenvoudiger monster voorbereiding protocollen en de mogelijkheid van het testen van vele monsters binnen een kort tijdsbestek.
Eiwit-eiwitinteractie in een cel vrij systeem werden geanalyseerd door ELISA(Figuur 2)en BLI (Figuur 2B). In beide technieken was één van de partners bindende geïmmobiliseerdet, hetzij op een biosensor (voor BLI) of een plaat van de microtiterplaat (ELISA). Het voordeel van BLI en ELISA is dat zij in staat analyse van eiwit-eiwitinteractie in hun oorspronkelijke staat stellen, niet-specifieke interacties buiten de actieve bindende site voorkomen. Het nut van BLI, kan echter beperkt afhankelijk van de toegepaste techniek van immobilisatie. De koppeling van procedure gebruikt hier willekeurig amine vormt een amide-binding tussen elk oppervlak-blootgesteld amine-groep van het eiwit en de oppervlakte van de biosensor. Dit leidt tot immobilisatie van eiwitmolecules op het oppervlak van de sensor in verschillende richtingen. Dit kan resulteren in heterogene binding die niet in een 1:1 bindende kinetiek model past. Dit potentiële probleem kan worden opgelost door te selecteren van biotine sensoren en een daar-label toe te voegen in de recombinant eiwit te worden geïmmobiliseerd. De betrouwbaarheid van BLI is vergelijkbaar met die van oppervlakte plasmon resonantie (SPR). De associatie en dissociatie van moleculen kunnen worden gemeten in real time via beide techniek. Echter het BLI-apparaat maakt geen gebruik van microfluidics, en is dus gemakkelijk te onderhouden. Bovendien kunnen 96 interacties worden gelijktijdig beproefd in BLI, overwegende dat slechts vier monsters tegelijk kunnen worden getest met behulp van SPR. Er is een kritieke stap in BLI dat moet worden geoptimaliseerd. Als sensoren worden hergebruikt, moeten regeneratie voorwaarden ook worden geoptimaliseerd, zoals die voor elk eiwit-eiwit complex kan variëren. In dit onderzoek bleek 10 mM ethyleendiamminetetra zuur geschikt voor regeneratie van de sensor.
De rol van de Vn in de naleving van de bacteriële werd getest direct met behulp van glazen oppervlakken bedekt met de Vn. Deze aanpak kan worden gebruikt om te analyseren bindend voor elke bacteriële ziekteverwekker, met inbegrip van zowel gramnegatieve als -positieve bacteriën. Dit is een semikwantitatieve techniek waarmee snelle beoordeling van een ziekteverwekker van vermogen voor de binding aan de Vn. Redelijke om resultaten te verkrijgen, moet de Vn coating worden geoptimaliseerd. In de hier beschreven assay, coating met Vn op 1, 2 en 5 µg Mn/mL werd onderzocht en 2 µg/mL bleek te zijn de meest geschikte concentratie voor de experimenten in deze studie (Figuur 3A). Overtollige Vn bekleed op het oppervlak kan het maken van een dikke laag die kan gemakkelijk worden ontdaan gedurende monster vaststelling en kleuring. Bovendien, de bacteriecultuur moeten niet grote bosjes van cellen; Dit kan worden vermeden door vortexing de cultuur voordat u een aliquoot gedeelte aan de dia toevoegt.
Bacteriële aanhankelijkheid aan het oppervlak van epitheliale cellen werd onderzocht met behulp van een kiemgetal techniek (Figuur 3A). Deze bepaling moet ook zorgvuldig worden geoptimaliseerd zodat de waarneming van de rol van de Vn in de naleving van de bacteriële. VN heeft verschillende bandplaatsen voor bacteriën (in het C-terminus) en cel oppervlakte integrine receptoren (op de N-terminale RGD bindende site). Binding van de Vn naar integrins induceert signalering en opname van de complexe van integrine-Vn1. Als dergelijke complexen zijn geïnternaliseerd zonder bacteriën, zullen de resultaten moeilijk te interpreteren. Dus, de Vn moet worden toegevoegd aan de epitheliale cellen enkelgelaagde bij 4 ° C. Zodra de Vn heeft integrine receptoren op de epitheliale celoppervlak verzadigd, moet overtollige Vn worden afgewassen, omdat vrije Vn bacteriële Vn-afhankelijke integrine bindende kan blokkeren. In deze test, wij geschat totaal bacteriële telt epitheliale cellen gekoppeld (dat wil zeggen, de uitlezing bestond uit zowel oppervlakte-ingeschrevenen en geïnternaliseerd bacteriën). Deze bepaling kan worden uitgebreid om te onderscheiden tussen externe en intracellulaire bacteriële populaties door behandeling met gentamicine4.
De serum bactericide bepaling in het protocol beschreven hier gebruikt werd vanaf de eerder gepubliceerde procedure12,22gedeeltelijk gewijzigd. In de analyse die hier worden beschreven, 1.5 x 10die 3 CFUs van Hif werden geïncubeerd met 5% NHS gedurende 15 minuten, 5 min langer dan in de eerder beschreven assay (Figuur 4A). Het verschil tussen WT Hif en de isogene mutant verstoken van PH was duidelijker op 15 min dan op 10 min. Daarom we geselecteerd de incubatietijd van 15 min voor dit bijzonder experiment. Het bactericide effect van serum is afhankelijk van het serumconcentratie, de tijd van incubatie, en aantal van de bacteriën. Alle ziekteverwekkers vertonen een opmerkelijke capaciteit voor het vermijden van de bactericide activiteit van serum; Sommige ziekteverwekkers kunnen volledig resistent tegen serum, terwijl anderen kunnen matig resistent of gevoelige. De serumconcentratie moet daarom worden geoptimaliseerd voor elke specifieke pathogen onderzocht. Het serum doden assay hier beschreven is echter beperkt tot de studie van gram-negatieve bacteriën, omdat serum geen significante bactericide effect op gram-positieve cellen1,5 heeft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële conflicten van belang.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Foundation van Anna en Edwin Berger, Lars Hierta, de O.E. en Edla Johansson Foundation, de Zweedse Medical Research Council (verlenen van nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), de Stichting tegen kanker aan de Universiteit Ziekenhuis in Malmö, de Physiographical maatschappij (Forssman van Stichting), en de Skåne County Council van onderzoek en ontwikkeling Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
