Summary
הדו ח מתאר פרוטוקולים עבור אפיון אינטראקציות בין חלבונים חיידקי הממברנה החיצונית vitronectin מווסת את המשלים אנושי. הפרוטוקולים ניתן ללמוד את איגוד תגובות והתפקוד הביולוגי של vitronectin של כל מין חיידקית.
Abstract
חיידקים לנצל המשלים הרגולטורים, כאמצעי התחמקות את התגובה החיסונית של המארח. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים להערכת הרכישה vitronectin תפקיד-ההצגות משטח של תא החיידק בהתנגדות מערכת החיסון של הפונדקאי. ניסויים cytometry זרימה מזוהות vitronectin לפלסמה אנושית ליגנד עבור החלבון הממברנה החיצונית קולטן חיידקי H של Haemophilus influenzae סוג f. וזמינותו מקושרים-אנזים immunosorbent הועסק כדי לאפיין את אינטראקציות חלבון חלבון רקומביננטי מטוהרים H בין vitronectin, איגוד זיקה הוערכה באמצעות ביו-שכבה אינטרפרומטריה. החשיבות הביולוגית של הכריכה של vitronectin לחלבון H על פני תא החיידק תוך התחמקות של התגובה החיסונית מארח אושר שימוש assay ההתנגדות של סרום עם נורמלי, מדולדל vitronectin בנסיוב אדם. חשיבותה של vitronectin ב הדבקות חיידקים נותחו באמצעות שקופיות זכוכית עם או בלי ציפוי vitronectin, ואחריו צביעת גראם. לבסוף, חיידקי הדבקה על תאי אפיתל מכתשי אדם monolayers נחקר. הפרוטוקולים המתוארים כאן ניתן להתאים בקלות במחקר של כל המינים חיידקי של ריבית.
Introduction
Vitronectin (Vn) הוא גליקופרוטאין אנושי חשוב מעורב בשמירה על הומאוסטזיס באמצעות התקנה של מערכת fibrinolytic. Vn מתפקד גם כרגולטור המשלים על ידי עיכוב מסלול המשלים מסוף במהלך היווצרות מורכבות C5b6-7, C9 הפילמור. מספר פתוגנים חיידקיים הוכחו לגייס Vn אל פני השטח של התא, כאמצעי2,1,התצהיר המשלים התנגדות3. בנוסף, Vn מתפקד מולקולה "כריך" בין חיידקים, המארח תאים אפיתל רצפטורים, הדבקות ובכך קידום הפנמה של פתוגנים2,4,5. איגוד של Vn השטח תא החיידק מתווך על ידי לחלבונים אחרים לא מזוהה כיום. מלא שחקרתי את תפקיד פונקציונלי Vn-איגוד של התחמקות של התגובה החיסונית צינור של ולכן ידרוש זיהוי של חלבונים Vn-גיוס.
השלב הראשוני לזיהוי. Vn-מחייב חלבונים הוא כדי לבדוק אם. חיידק עניין באפשרותך לאגוד מטוהרים Vn-מיכשור היא שיטה נוחה וישירה כדי לקבוע אם Vn מאוגד לתאים הפתוגן. במחקר זה, אנחנו העריכו את הכריכה של Vn שונים Haemophilus influenzae סוג f (Hif) מבודד קליניים6. השיטה המתוארת כאן היא כמותית, והוא יכול לשמש כדי להבדיל את קיבולת איגוד של מגוון רחב של זני חיידקים. במחקר הקודם, אנחנו מאופיין חלבון H (PH) של Hif כמו חלבון מחייב Vn7. לפיכך, במחקר הנוכחי, הפוטנציאל Vn-איגוד של מוטציות (WT) Hif פראי-סוגlph Hif M10Δ הושוו באמצעות פרוטוקולים המתואר.
ברגע נקבע כי. חיידק נקשר Vn, השלב השני הוא לאפיין את פרוטאום השטח על מנת לזהות פוטנציאל Vn-מחייב חלבונים. מגוון רחב של גישות יכול לשמש למטרה זו,8,9, אך הללו לא שתוארו בדו ח זה. השיטה המתאימה ביותר לבחינת אינטראקציות חלבון-חלבון היא recombinantly אקספרס שנבחר פני שטח חלבונים חיידקי ב e. coli ולטהר מאת כרומטוגרפיית זיקה. כאן, אנו משתמשים PH ואינטראקציה המולקולרי שלה עם Vn כדי להמחיש את השיטה. אינטראקציות בין PH רקומביננטי Vn מאופיינים באמצעות מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה)7 וטכניקה ללא תווית שפותחו לאחרונה המכונה ביו-שכבה אינטרפרומטריה (בלי)10,11. בעוד ELISAs יכול לשמש כדי לאשר אינטראקציות חלבון-חלבון, רבנות בלי מספק נתונים מפורטים לגבי הפרמטרים קינטי של האינטראקציות.
ללמוד את תפקיד פונקציונלי Vn הדבקות חיידקים, שני מבחני שונים יכול להיות מנוצל. הבדיקה הראשונה המתוארת כאן היא מדידה ישירה של חיידקי ההקפדה משטחי זכוכית מצופים Vn, בעוד וזמינותו השני בוחן את הדבקות על פני השטח של תאים אפיתל. הבדיקה הראשונה, שקופיות זכוכית היו מצופים Vn, הכריכה של WT או מוטציה Hif זנים הוערכה על ידי גראם מיקרוסקופ. טכניקה זו מבדיל בקלות חיידקים מבוססת על היכולת לאגד Vn12. הידבקות חיידקים בתרבית של תאים ואז נותחו על ידי הוספת חיידקים בתרבית על גבי טפט של סוג II מכתשי תאים אפיתל; מצורף חיידקי הוערכה על ידי ספירת מספר המושבה יוצרי יחידות (CFUs). חיידקים מודבקת למביטה יכול להיות מכובד ב נוכחות או היעדרות של Vn4,13.
התפקיד של רכישת Vn בהתנגדות סרום חיידקי הוערך באמצעות הרג סרום assay (כלומר, פעילות אחרים סרום). כדי להעריך את המשמעות של רכישת Vn בהתנגדות סרום, פעילות אחרים של סרום מדולדל Vn (VDS) נמשל עם זה של נסיוב אדם נורמלי (NHS). השיטה המשמשת ברצון מבדיל Vn-איגוד נגד חיידקים מחייב מבוסס על התנגדות סרום. השתמשנו בשיטה זו כדי ללמוד את התפקיד של Vn במחתרת סרום של פתוגנים חיידקיים מספר4,12.
שיטות רבות דווחו ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי. כאן, אנו מתארים את ערכה של פרוטוקולים של ניתן להתאים בקלות במחקר של כל פתוגן כדי להעריך את התפקיד של Vn ב פתוגנזה. בדקנו פרוטוקולים אלה באמצעות פתוגנים שונים ולאחר Hif נבחר כדוגמה עבור דוח זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ניתוח של Vn כמו ליגנד חלבון משטח חיידקי
-
זיהוי Vn-איגוד על פני השטח חיידקים באמצעות cytometry זרימה
הערה: ב cytometry זרימה, היינו בצד פיזור ופיזור קדימה שער אירועים חיוביים. כדי לבחון את האינטראקציות עם Vn, מבודד Hif קליניים (n = 10)7 נבחרו יחד עם e. coli BL21 (DE3) כפקד שלילי (איור 1א').- תרבות Hif קליניים מבודד במדיום אינפוזיה (BHI) המוח ללב, בתוספת 10 µg/mL NAD ו המין ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-200 סל ד. להשתמש תרבות e. coli14לוריא-Bertani בינונית. הקציר Hif בשלב אמצע יומן (OD600 = 0.3)15, ו resuspend את החיידקים בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.2, המכיל 1% (w/v) אלבומין שור (BSA) (מאגר חסימה; PBS-BSA). להתאים את המתלים 109 CFU/mL.
- להעביר את aliquots המכיל 5 x 106 CFU צינורות סיבוב המדרגה פוליסטירן (12 x 75 מ מ2) 5 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מאגר חסימה. Centrifuge את המתלים ב 3,500 × g בטמפרטורת החדר (RT)16 במשך 5 דקות כדי הצניפה החיידקים ולאחר מכן תשאף היטב כדי להסיר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר.
- Resuspend כדורי חיידקי עם μL 50 החסימה מאגר המכיל 250 ננומטר Vn דגירה הדגימות עבור 1 h RT מבלי לרעוד. לאחר דגירה, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב x 3,500 g למשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף את כדורי שלושה זמני באמצעות PBS והשלבים צנטריפוגה דומה.
- כדי בגדר חיידקי, להוסיף 50 μL של ראשי כבשים נגד Vn polyclonal נוגדנים (pAbs)-מטריים דילול ב- PBS-BSA. דגירה ההשעיה עבור h 1-RT, ולאחר מכן לשטוף את החיידקים שלוש פעמים עם PBS להסיר נוגדנים לא מאוגדים (כפי שמתואר בשלב 1.1.3).
- לאחר מכן, הוסף μL 50 של PBS-BSA המכיל fluorescein isothiocyanate (FITC)-מצומדת pAbs כבשים נגד חמור (דילול מטריים) ואת תקופת דגירה-RT של h 1 בחושך.
- הכן פקד ריק על ידי המקננת חיידקים עם חסימת מאגר בלבד ולא pAbs ללא Vn.
- רוחצים חיידקים שלוש פעמים עם 1 מ"ל מאגר החוסמים את גלולה התליה על ידי צנטריפוגה, כמתואר בסעיף 1.1.2. לבסוף resuspend בגדר חיידקי עם 300 µL ל- PBS, לנתח ידי cytometry זרימה7.
-
אליסה ניתוח של אינטראקציה בין PH רקומביננטי Vn
הערה: בקרת צריך להיכלל כדי לא לכלול איגוד לא ספציפית. חלבון Factor H (FH) או מחייב C4b אנושי (C4BP) משמשים בפקדים חיוביים ושליליים, בהתאמה.- לדלל כל אחד החלבונים האנושית (Vn, FH ו C4BP) בנפרד ל- 50 nM, טריס-HCl, pH 9.0 (ציפוי מאגר). לוותר על 100 µL של חלבון פתרון כל טוב של צלחת microtiter Polysorp. הצלחות עם המכסה סגור ואחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (16 שעות) כדי להקל את הנייח של חלבון על גבי צלחת microtiter בארות.
- למחוק את הפתרון מהצלחת microtiter על-ידי הטיית במהופך מעל הכיור ולשטוף הבארות שלוש פעמים עם 300 µL של PBS/טוב. לחסום את הבארות מצופה עבור h 1 RT עם PBS המכילה 2.5% (w/v) BSA (PBS-BSA).
- לאחר הסרת הפתרון חסימה, לשטוף הבארות שלוש פעמים עם 300 µL ל- PBS המכילה 0.05% (v/v) Tween 20 (PBST) לכל טוב. להוסיף 100 µL של 50 ננומטר רקומביננטי PH שלו מתויג לדגימת כל טוב ואני תקופת דגירה של h 1-RT. בבארות שליטה, להוסיף µL רק 100 של PBS-BSA.
הערה: הגן lph קידוד ה-PH מ Hif היה מוגבר על ידי ה-PCR, משובטים לתוך הווקטור ביטוי pET26b המוסיפה 6 × שלו תג-קצה קרבוקסילי של החלבון ביטוי. וקטור recombinant הפכה e. coli BL21(DE3) לביטוי. Ni-נ שרף שימש לטהר את חלבון רקומביננטי15. - לבטל את הפתרון חלבון ולהסיר את החלבונים לא מאוגד ע י שטיפת הבארות שלוש פעמים עם 300 µL של PBST לכל טוב. להוסיף 100 µL של PBS-BSA המכיל חזרת peroxidase (HRP)-מצומדת pAbs אנטי שלו (1:10, 000 דילול) ואת תקופת דגירה של h 1-RT.
- להכין 20 מ מ פתרון A על ידי המסת tetramethylbenzidine בריכוז של 5% מתנול אצטון ו- 45%. כדי להכין פתרון B, להמיס 19.2 גר' חומצת לימון ב 1,000 מ ל H2O, להתאים את רמת ה-pH ל 4.25 על-ידי הוספת קו ולאחר מכן להוסיף 230 µL של 30% H2O2. לאחסן שני פתרונות בחושך-RT. לפני השימוש, מערבבים µL 500 של פתרון B עם 9.5 מ של פתרון A להכין ריאגנט לזיהוי את אליסה.
- לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 300 µL של PBST לאדם טוב, לזהות קומפלקסים אנטיגן-נוגדן על-ידי הוספת µL 100 של ריאגנט לזיהוי אליסה מכל קידוח.
- להוסיף 50 µL של 1 מ' H2אז4/well כדי לעצור את התגובה. למדוד את הצפיפות האופטית של הבארות-450 nm באמצעות קורא microplate.
-
חקר האינטראקציה קינטיקה של recombinant PH, Vn באמצעות רבנות בלי
- לשתק Vn אנושי על חיישנים אמין-תגובתי באמצעות את אמין צימוד השיטה, על פי הנחיות היצרן11.
- באמצעות PBS, באופן סדרתי לדלל את ליגנד (רקומביננטי PH) מ- 0 4 מיקרומטר, להעביר את הפתרונות וכתוצאה מכך צלחת microtiter שחור 96-ובכן, שטוח התחתונה. הפעל את הניסוי ב 30 ° C באמצעות מכשיר מתה על17.
- לטעון את התיקיה data בתוכנה מתה על ניתוח נתונים. בחר באפשרות 'החיישן בבחירה' . לאחר מכן, בחר 'הפניה טוב' (חיישן מצופים Vn ב- PBS) עבור חיסור.
- בחר 'יישור ציר y בסיסית' ובחר 'interstep תיקון וליישר להתאחדות'. הקש 'תהליך נתונים' זה ייפתח אוטומטית בכרטיסיה ' ניתוח '.
- בכרטיסייה ' ניתוח ', בחר באפשרות 'האגודה ו דיסוציאציה' תחת פריסטלטיות. בחר את הדגם ' איגוד 1:1, התאמה גלובלית ". הקש 'להתאים עקומה' , ייצוא התאמת נתונים17.
2. אפיון התפקיד של Vn המותרים של חיידקי
-
מחקר של חיידקי ההקפדה משטחי זכוכית מצופים Vn
- להכין פתרון 2 µg/mL של Vn PBS ב ו- pipet 10 µL של פתרון זה על גבי מיקרוסקופ זכוכית מחליק כמו טיפה אחת. לאפשר הירידה להתייבש על השקופית למשך 30 דקות ב- RT. מעיל שקופית עם אלבומין אנושי (HSA) כפקד שלילי.
- לשטוף את השקופיות זכוכית מצופים חלבון שלוש פעמים בטבילת השקופיות לשתי שניות בתוך המכיל PBS להסיר את עודף חלבון ללא ציפוי. הוסף 20 מ של תרבות Hif טריים (שמתואר בשלב 1.1.1) לתוך צלחת פטרי פלסטיק סטרילית ויציפו את Vn- / זכוכית מצופים HSA שקופיות במדיום תרבות. דגירה כל המנות של 37 ° C עבור 1 h ברעידות-סל ד 20.
הערה: Hif M10, Hif M10Δlph גדלו במדיום BHI נוזלי או על פלטות אגר שוקולד. המדיום של המוטציה lph היה בתוספת µg/mL 10 kanamycin15. - לאחר דגירה, להסיר כל חיידק לא מאוגד על-ידי השוקע השקופיות שלוש פעמים ב גביע מלא עם PBS. דמיינו חיידקים על ידי צביעת גראם, כמתואר.
- הסר PBS עודף מכל שקופית על-ידי הטיית זה נוגע בקצה על גבי נייר טישו. מילה נהדרת השקופיות למשך 3-5 דקות-RT, ותקן חיידקים מודבקת על-ידי העברת כל שקופית 3 פעמים מעל להבה.
- להחזיק את השקופית בקצוות עם שתי אצבעות על מגש מוכתמים, ולאחר מכן להוסיף 3-4 טיפות (200 – 300 µL) של 2.3% קריסטל ויולט פתרון. חכה 60 s ולאחר מכן לשטוף השקופיות תחת זרם עדין של ברז מים עבור 3-4 s.
- להוסיף 3-4 טיפות של 0.33% פתרון יוד על השקופיות. חכה 1 דקות ולאחר מכן לשטוף את השקופית תחת זרם עדין של מי ברז. יבש בזהירות את השקופיות באמצעות נייר סופג.
- להוסיף 3-4 טיפות של פתרון decolorizing המכיל אלכוהול איזופרופיל 75% ו-25% אצטון אותן לשקופית. לאחר 5-10 s, יש לשטוף את השקופית תחת זרם עדין של מי ברז.
- להוסיף 3-4 טיפות (200 – 300 µL) של הפתרון carbolfuchsin בסיסי. חכה 1 דקות ולאחר מכן לשטוף את השקופיות תחת זרם עדין של מי ברז. יבש את השקופיות בעזרת נייר סופג.
- דמיינו את החיידקים תחת מיקרוסקופ אור, בחירה של העדשה המטרה שמן-טבילה ב- 100 X הגדלה18. להשוות את דבקותה של Hif WT וחיידקים המוטציות על משטחים Vn, HSA-מצופה זכוכית.
-
מחקר של הדבקות תלויי-Vn של חיידקים בתאי אפיתל
הערה: assay הדבקות יעיל זה היה בשימוש שלנו4,הקודם מחקרים7.- תרבות A549 תאים (סוג II מכתשי אפיתל תאים) בבקבוקון תרביות רקמה 75 ס מ2 בינונית F12 בתוספת 10% עגל עוברית (vol/כרך) סרום (FCS) (בינוני מלא) ו- 5 גנטמיצין µg/mL. דגירה את הבקבוק בתוך אינקובטור עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים עד 80% confluent (confluency יכול להיות מוערך דמיין כיסוי משטחים על ידי תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה). ארבעת השלבים הבאים מתארים כיצד להתכונן בתאי אפיתל19,assay20.
- לשטוף את טפט תא בתוך הבקבוק פעמיים עם 20 מ של PBS מאת מתערבל עדין. כדי לנתק את התאים מפני השטח את הבקבוק, להוסיף 2 מ"ל של התא ניתוק אנזים פתרון, דגירה. הבקבוק למשך 5 דקות ב 37 º C. הקש את הבקבוק עם כף היד שלך כדי לנתק את כל התאים מפני השטח פלסטיק. פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לפזר תא גושים.
- להוסיף מ 18 ל F12 שלם בינוני הבקבוק ולהעביר את המתלים התא כולו צינור בז 50-mL סטרילי. Centrifuge התליה תא עבור 5 דקות ב x 200 גר' ב- RT וזורקים את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של מדיום מלאה F12.
- להסיר µL 10 של התליה תא למקם אותו בצינור גלאים, ולאחר מכן להוסיף 90 µL של פתרון Trypan blue. טען את הדגימה hemocytometer (עומק 0.1 מ מ) לאחר הנחת את coverslip.
- לספור את כל התאים קיימא באזורים A, B, C ו- D (כל שדה מכיל 16 ריבועים, כל ריבוע יש אזור של 0.0025 מ מ2), ואז לחשב את המספר הממוצע של תאים ([A + B + C + D] / 4). לחשב את מספר תאים למיליליטר באמצעות המשוואה הבאה:
תאים למ"ל קיימא = ממוצע תא ספירת × 104 × דילול גורם20.
הערה: כאן, הגורם דילול הוא 10. - לדלל התליה תא ל 5.0 x 103 תאים למ"ל באמצעות מלאה גנטמיצין בינוני המכיל 5 µg/mL. לוותר על μL 500 של השעיה תא לתוך כל טוב של צלחת התרבות התא 24-. טוב. דגירה את הצלחת ב 37 ° C 5% CO2 עד התאים הם 90% confluent.
- לפני זיהום חיידקי, להסיר את המדיום מן הבארות, להוסיף F12 בינונית (ללא FCS) ולאחר מכן דגירה בין לילה ב 37 º C.
- לשטוף את טפט תא שלוש פעמים עם µL 500 ל- PBS במקום RT. הצלחת על קרח ולהוסיף µL 100 של טרום מקורר בינוני F12 המכיל 10 µg/mL צלחת Vn-Incubate ב 4 ° C עבור 1 h. שליטה וולס, הוסיפו רק F12 בינוני.
- לאחר דגירה, לבטל את הפתרון על-ידי pipetting, לשטוף שכבת תאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS ב RT. Resuspend תרבות של Hif M10 בוגר טרי (שלב 1.1.1) F12 בינוני (2 × 108 CFU/mL). להוסיף 100 µL של ההשעייה חיידקי מכל קידוח, דגירה את הצלחת. בשביל 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: כל טוב מכיל כ5 A549 2 x 10 תאים. זיהום, 2 x 107 CFU חיידקי נוספו, המתאימים ריבוי של זיהום של 100. - הסר את המדיום על-ידי pipetting ולשטוף בתאי אפיתל A549 שלוש פעמים עם PBS. להוסיף µL 50/טוב של פתרון ניתוק התא, דגירה את הצלחת. בשביל 5 דקות ב 37 º C.
- לאחר מכן, להוסיף 50 µL F12 בינוני מלא בכל טוב כדי לעצור את התגובה אנזימטיות. העברה בתאי אפיתל (≈100 μL [קרי, האחסון כולו]) מבאר כל שפופרת זכוכית 6-mL המכיל 4 חרוזי זכוכית. Lyse התאים ב RT מאת vortexing למשך 2 דקות.
- לדלל 10 µL של התא lysate 100-fold על-ידי הוספת 10 µL של lysate µL 990 F12 בינוני. צלחת µL 10 המדגם מדולל על צלחת אגר שוקולד.
- דגירה של צלחת אגר שוקולד ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ואז לספור את המושבות. כל מושבה מייצגת CFU אחד.
- תרבות A549 תאים (סוג II מכתשי אפיתל תאים) בבקבוקון תרביות רקמה 75 ס מ2 בינונית F12 בתוספת 10% עגל עוברית (vol/כרך) סרום (FCS) (בינוני מלא) ו- 5 גנטמיצין µg/mL. דגירה את הבקבוק בתוך אינקובטור עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים עד 80% confluent (confluency יכול להיות מוערך דמיין כיסוי משטחים על ידי תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה). ארבעת השלבים הבאים מתארים כיצד להתכונן בתאי אפיתל19,assay20.
3. ניתוח ההתנגדות תלויי-Vn לפעילות אחרים בנסיוב אדם
- NHS רכישה ממקור מסחרי. להכין VDS כמו שתואר לעיל12. לחדש את VDS עם 180 ננומטר Vn אשר שווה ל Vn נוכח NHS.
- הכן סרום חום-לא פעיל (שלו) על ידי חימום NHS ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשבית חלבוני המשלים.
הערה: ריכוז אופטימלי סרום (5%) ואת זמן הדגירה (15 דקות) עבור וזמינותו שתואר בשלבים 3.3 – 3.7 היו נחושים מדעית Hif15; פרמטרים אלה יכול להשתנות עבור אחרים פתוגנים חיידקיים. - התרבות חיידקים (בתיק הזה, Hif M10 ו את המוטציה Hif M10Δlph) לשלב יומן אמצע (OD600 = 0.3). גלולה חיידקים על ידי צנטריפוגה ב x 3,500 g למשך 10 דקות.
- Resuspend בגדר חיידקי עם נפח 1 דקסטרוז ג'לטין Veronal מאגר (DGVB++; pH 7.3) המכילה 2.5% (w/v) גלוקוז, 2 מ מ MgCl2, CaCl 0.15 מ מ2ו- 0.1% (wt/כרך) ג'לטין.
- להוסיף 1.5 x 103 CFU של חיידקים כדי 100 µL של DGVB++ המכילה 5% סרום (NHS, שלו, ב- VDS, או VDS + 180 ננומטר Vn). דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ברעידות-300 סל ד.
- הסר את µL 10 aliquot תערובת התגובה ב 0 min (דוגמה0 T) ו- 15 דקות (מדגםt T) וצלחת על שוקולד אגר. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לאחר דגירה, לספור את המושבות המופיעים על הצלחת. לחשב האחוזים של חיידקים הרג12 באמצעות המשוואה הבאה: (CFU-Tt) / (CFU ב T0) × 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vn-איגוד אל פני השטח של חיידקים נקבע על ידי cytometry זרימה. כל Hif מבודד קליני נבדק במחקר זה גייס Vn אל פני השטח של התא. אין אינטראקציה של Vn עם משטח תאים נצפתה לזן בקרה שלילית של e. coli (איור 1א'). כפי שמוצג באיור 1B, PH הוא חלבון Vn-איגוד מרכזי על פני השטח של תאים Hif. עקדת Vn מאת המתח WT Hif M10 גרם משמרת האוכלוסייה, ואילו Hif M10Δlph לא היה מאוגד Vn והופיע דומה אל הפקד.
אינטראקציות חלבון בין PH Vn הוערך על ידי אליסה ואני מתה. PH רקומביננטי הותר לאגד עם הגורם האנושי H, Vn C4BP (בקרה שלילית) מצופה על הבארות של microtiter חומרי ניקוי. מאוגדים PH המשוער באמצעות pAbs אנטי-שלו. התוצאות הראו בבירור משמעותי האינטראקציה בין PH ו- Vn factor H, בהשוואה C4BP (איור 2א). האינטראקציה בין PH Vn הוערך בזמן אמת באמצעות רבנות בלי. איור 2 B מראה PH מחייב תגובה עקומות עבור השטח מצופים Vn חיישן. איגוד זיקה (במקרה זה, Kd = 2.2 מיקרומטר) הוערך על ידי התאמת הנתונים קינטיקה מחייב מצב יציב.
חיידקים חסר הבעה של PH על פני התא (Hif M10Δlph) הציג מופחת ההקפדה משטחי זכוכית מצופים Vn לעומת תאים WT (איור 3א). בנוסף, הנוכחות של Vn על פני השטח של תאי אפיתל משופרת באופן משמעותי את דבקותה של Hif (איור 3ב). תוצאות אלו ציינו כי האינטראקציה PH-Vn תרמו באופן משמעותי להתמדה חיידקי.
Vn הוא מעכב משלים ידועים. כדי להעריך את הפעילות עיכוב המשלים, בתיווך סרום הרג נבחנה ב הנוכחות, היעדר תאים Vn-WT Hif הציג ההתנגדות סרום גבוה יותר מאשר M10Δlph מוטציה בתאים. אין בקטריות נהרגו בנוכחות שלו (איור 4א). מעניין, WT Hif הציג הישרדות מופחתת ב- VDS, חידוש המלאי של Vn גדל הישרדות חיידקי. עם זאת, המתחlph Hif M10Δ לא הגיב ל דלדול Vn כי זה לא מגייסים Vn השטח תא (איור 4B). תוצאות אלו מדגימים בבירור כי Vn הוא גורם חשוב מארח המגינה על חיידקים מרצח בתיווך המשלים (איור 4A-B).
איור 1 : Haemophilus influenzae serotype f נקשר Vn ויה הביע משטח בביולוגיה (א) לזרום cytometry תוצאות מציג עקידת Vn לתאים של מבודד קליניים Hif. כל בידוד קליניים (5 x 106 CFU), נדגרה עם 250 ננומטר האדם Vn-מאוגד ליגנד זוהה באמצעות pAbs אנטי-Vn כבשים FITC מצומדת חמור כבשים נגד נוגדנים משניים. Escherichia coli BL21 (DE3) נכלל כפקד שלילי. הנתונים מוצגים כמו עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע מניתוחי triplicate 3 ניסויים נפרדים, קווי שגיאה מייצגים היסטוגרמות cytometry זרימה SD. (B) הממחיש את הכריכה של Vn השטח של WT Hif M10 ו PH-מחיקה Hif M10Δ מוטציה lph . נציג נתונים מאחד 3 ניסויים נפרדים מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : PH רקומביננטי נקשר Vn- (א) אליסה תוצאות הממחיש את הכריכה של PH רקומביננטי Vn, FH של C4BP. FH שימש פקד חיובי, ואילו C4BP שימש פקד שלילי. כדי לנתח אינטראקציות חלבון-חלבון, Vn FH, C4BP היו מצופה ב- equimolar (50 ננומטר) ריכוזי אל הבארות צלחות microtiter. . הבא בתור, 50 ננומטר רקומביננטי PH-His6x נוסף מאוגדים PH זוהה באמצעות HRP-מצומדת pAbs אנטי-שלו. הנתונים המוצגים הם אמצעי מנתח triplicate 3 ניסויים עצמאית, וציין קווי שגיאה SD. * * *, P≤0.001. BLIanalysis (B) של ה-PH מחייב Vn: Vn רקומביננטי היה מרותק למיטה על חיישנים AR2G, וקינטיקה איגוד של PH (0.25-4 מיקרומטר) כדי Vn נרשמו באמצעות מכשיר רבנות בלי. קבוע שיווי משקל זיקה מחושב באמצעות אותות השיג עבור כל הריכוז-שיווי משקל, הנתונים היו מצוידים לפי מצב יציב קינטיקה. הניסוי היה חוזר על עצמו שלוש פעמים, נציג אחד של הנתונים (dataset) מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : האינטראקציה בין PH Vn מגבירה ההקפדה חיידקי משטחי זכוכית ותאי אפיתל. (א) תמונות מיקרוסקופי אור מציג ההקפדה של Hif שקופיות זכוכית מצופים Vn. חיידקים היו דמיינו על ידי צביעת גראם. הייצוגי תמונות מאחד 3 ניסויים עצמאית מוצגים. לוח זה התפרסם בעבר היומן לאימונולוגיה7 , המופקת כאן באישור האגודה האמריקאית של Immunologists. (B) דבקותה של WT Hif M10 תאי לתאי אפיתל A549 הנוכחות ואת היעדר Vn אמצעים מנתח triplicate 3 ניסויים עצמאית מותוות, קווי שגיאה מייצגים SD. *, p ≤0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : Vn גייס השטח תא Hif מגן על חיידקים הרג בתיווך סרום. (א) WT Hif M10, מוטציה Hif M10Δlph היו הדגירה למשך 15 דקות NHS 5% או שלו. (B) התנגדות של Hif M10 Hif M10Δlph כדי אחרים אפקטים ב- 5% ב- VDS, VDS בתוספת 250 ננומטר מטוהרים Vn. הנתונים אמצעי לייצג מנתח triplicate 3 ניסויים עצמאית, וציין קווי שגיאה SD. * * *, p ≤0.001; . אן. אס, לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פתוגנים חיידקיים לגייס Vn השטח תא ולנצל את הרגולטור המשלים כדי למנוע התצהיר המשלים גורמים והשלמה של קרום התקפה מורכבים2. Vn משמשת גם כחברת מולקולה גשר בין חלבונים חיידקי משטח קולטני פני השטח של התא המארח, ובכך מאפשר פתוגנים לדבוק פני השטח של תאי אפיתל, לאחר מכן לתווך הפנמה. במחקר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים יכול לשמש כדי להעריך i) איגוד של Vn פני השטח של תאים חיידקיים, אינטראקציות חלבון-חלבון ii), זיקה קבועים ולאחר iii) תפקיד פונקציונלי Vn במתן התנגדות סרום ושיפור של הדבקות על פני השטח של התאים המארחים.
Cytometry זרימה היא שיטה כמותית נפוץ כדי לוודא כי חיידקים לאגד Vn. עם זאת, הריכוז Vn חייב להיות מוטבת, כפי הקיבולת Vn-איגוד (ואת רצפטורים שונים) עשויות להשתנות בהתאם המינים חיידקי. ב וזמינותו המתוארים כאן, 1 – 100 µg/mL של Vn שימשו להערכת איגוד ליניארי ופרמטרים רוויה. השוואה של איגוד דפוסי WT Hif, מוטציהlph Hif M10Δ, שליטה שלילי e. coli בתאי הראו הבדל ברור-ריכוז Vn של 20 µg/mL (250 ננומטר). לכן, ריכוז זה היה בשימוש כל הניסויים cytometry זרימה. השימוש Vn בריכוזים מעל לנקודת רוויה יכול לייצר אותות חיובי-false. דילול של הנוגדנים והמשניים חייב גם להיות בנפרד אופטימיזציה עבור כל פתוגן. דילול מרבי של נוגדנים מציג אות טוב צריך להיבחר. במחקר זה, השתמשנו 2.5% BSA כסוכן חסימה. עם זאת, BSA אינה ריאגנט חסימה אוניברסלי מתאים כל הפתוגנים. במקרים שבהם BSA אינו חוסם אינטראקציות נוגדן ספציפי, ריאגנטים חסימה אחרים יכול לשמש, כגון ג'לטין דגים. איגוד של Vn אל פני השטח של תאים פתוגן חיידקי לעיתים קרובות מתווך על ידי קולטנים מרובים21,22. קולטנים מסוימים יש זיקה גבוהה Vn-מחייבת, ואילו אחרים ייתכן שיישומים זיקה מחייבת נמוכה. לפיכך, מחיקה של גן אחד בלבד קידוד חלבון משטח לא עשוי להתבטא בירידה אינטראקציות Vn לאומדן cytometry זרימה. כחלופה cytometry זרימה, חלבון מחייב על פני תא החיידק יכול להיבדק באמצעות immunofluorescence assay (IFA) או במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). למרות photobleaching של נוגדנים fluororeagent מצומדת יכול להיות בעייתי cytometry זרימה והן IFAs, TEM כוללת הכנת הדוגמא מסורבל, עם סיכון משמעותי של היכרות עם חפצי אמנות23,24. ניתוח cytometry זרימה עדיפה ואכן IFA, TEM עקב פשוטים יותר מדגם הכנת פרוטוקולים ועל האפשרות של בדיקות דגימות רבות בתוך פרק זמן קצר.
אינטראקציות חלבון במערכת חינם תא נותחו על ידי אליסה (איור 2א) ואני מתה על (איור 2B). הן של טכניקות אלה, אחד מבני הזוג איגוד היה קיבוע, או של ביוסנסור (עבור רבנות בלי) או צלחת microtiter (אליסה). היתרון של רבנות בלי ואליסה הוא בכך שהם מאפשרים ניתוח של אינטראקציות חלבון-חלבון במצב מקורי, מניעת אינטראקציות לא ספציפית באתר האיגוד פעיל. השירות של רבנות בלי, לעומת זאת, יכול להיות מוגבל בהתאם הטכניקה הנייח בשימוש. אמין צימוד שמשמש כאן באופן אקראי טפסים של בונד אמיד בין כל קבוצה amine השטח החשופים של החלבון על פני החיישן. התוצאה הנייח של מולקולות חלבון על פני השטח של החיישן הכיוונים השונים. התוצאה יכולה להיות הטרוגניות איגוד זה לא מתאים מודל קינטיקה איגוד 1:1. ניתן לפתור בעיה פוטנציאלית זו על-ידי בחירת ביוטין חיישנים והוספת תג streptavidin חלבון רקומביננטי כדי להיות מרותק למיטה. האמינות של רבנות בלי דומה לזה של פני השטח פלזמון תהודה (SPR). ניתן למדוד את העמותה ואת דיסוציאציה של מולקולות בזמן אמת או בטכניקה. עם זאת, המכשיר רבנות בלי אינו משתמש מיקרופלואידיקה, ולכן הוא קל לשמור. בנוסף, אינטראקציות 96 יכול להיבדק בו זמנית ב מתה על, בעוד רק 4 דגימות בכל פעם יכול להיבדק באמצעות SPR. יש עוד צעד קריטי רבנות בלי חייב להיות ממוטבת. אם חיישני ממחזרת, התחדשות תנאים צריך גם להיות אופטימיזציה, כמו זה עשוי להשתנות עבור כל מתחם חלבון. במחקר זה, 10 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה נמצאה מתאימה חיישן התחדשות.
התפקיד של Vn המותרים של חיידקי נבחנה ישירות באמצעות משטחי זכוכית מצופה Vn. גישה זו יכול להיות מועסק כדי לנתח מחייב עבור כל פתוגן חיידקי, כולל חיידקים גראם שליליים וגם - חיובי. זוהי טכניקה semiquantitative המספק הערכה מהירה של הפתוגן הקיבולת עבור איגוד Vn. כדי לקבל תוצאות הגיוניות, ציפוי Vn חייב להיות מוטבת. ב וזמינותו המתוארים כאן, ציפוי עם Vn-1, 2 ו- 5 µg/mL נבחנה, 2 µg/mL נמצא הריכוז המתאים ביותר עבור הניסויים שנערכו במחקר זה (איור 3א). עודף Vn מצופה על פני השטח יכול ליצור שכבה עבה, זה יכול להיות בקלות הפשיטו במהלך מדגם תיקון והוא מכתים. יתר על כן, לא צריך התרבות חיידקי גושים גדולים של תאים; זה ניתן להימנע על ידי vortexing התרבות לפני הוספת aliquot של השקופיות.
הדבקות חיידקים על פני השטח של תאי אפיתל כנגד נבדקה באמצעות טכניקה צלחת-count (איור 3א). Assay זה גם חייב להיות בקפידה ממוטב כדי לאפשר תצפית של התפקיד של Vn המותרים של חיידקי. Vn יש אתרי קישור שונים על חיידקים (ב קרבוקסילי) לתאים קולטנים אינטגרין משטח (באתר האיגוד RGD N-מסוף). קשירה של Vn אינטגרינים גורם איתות, ספיגת של אינטגרין-Vn מורכבים1. אם קומפלקסים כאלה הם הפנימו ללא חיידקים, התוצאות יהיה קשה לתרגם. לכן, יש להוסיף Vn טפט תאים אפיתל ב 4 º C. ברגע Vn יש רוויה אינטגרין רצפטורים על פני תאים אפיתל, יש לרחוץ Vn עודף, כפי Vn חינם יכול לחסום חיידקי תלויי-Vn אינטגרין מחייב. ב הזה assay, אנחנו מוערך סך חיידקי נחשב קשורה לתאי האפיתל (קרי, read-out מורכבת צמוד-השטח והן הפנימו חיידקים). ניתן להאריך assay זה להבחין בין אוכלוסיות חיידקים חיצוני, תאיים על ידי טיפול עם גנטמיצין4.
סרום וזמינותו אחרים המשמשים את הפרוטוקול המתואר כאן שונו חלקית מן ההליך שפורסמו בעבר12,22. ב וזמינותו המתוארים כאן, 1.5 x 10ש-3 CFUs של Hif היו מודגרות עם 5% NHS למשך 15 דקות, 5 דקות יותר מאשר בזמן וזמינותו שתואר לעיל (איור 4א). ההבדל בין WT Hif המוטציה isogenic ללא PH היה יותר ב 15 דקות מ- 10 דקות. לכן, בחרנו תקופת הדגירה 15 דקות של הניסוי המסוים הזה. השפעת סרום אחרים תלויים ריכוז סרום, תקופת דגירה, ומספר של חיידקים. כל הפתוגנים התערוכה קיבולת הבולטים של הימנעות פעילות אחרים של סרום; כמה פתוגנים יכול להיות עמיד לחלוטין בפני סרום, בעוד אחרים יכולים להיות עמידים למדי או רגיש. לכן חייב להיות ממוטב הריכוז סרום כל פתוגן מסוים בחן. למרות זאת, הסרום הורג assay המתוארים כאן מוגבל בחקר חיידקים גראם שליליים, מאז סרום יש השפעה אחרים משמעותיים על תאים גראם חיוביים1,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים כספיים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים קרן של אנה אדווין ברגר, לארס Hierta, רוצה שתיכנס לשם ואת Edla יוהנסון קרן, המועצה למחקר רפואי שוודי (להעניק מספר K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), קרן סרטן באוניברסיטה חולים במאלמו, החברה Physiographical (קרן של Forssman), ולא של מועצת המחוז סקונה ומחקר ופיתוח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
