Summary
Este relatório descreve protocolos para caracterizar as interações entre proteínas de membrana externa bacteriana e a vitronectina regulador do complemento humano. Os protocolos podem ser usados para estudar as reacções de vinculação e função biológica da vitronectina em qualquer espécie bacteriana.
Abstract
As bactérias utilizam reguladores de complemento como um meio de evasão da resposta imune do hospedeiro. Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar a aquisição de vitronectina papel em peças de superfície da célula bacteriana em resistência para o sistema imunológico do hospedeiro. Experimentos de citometria de fluxo identificaram vitronectina plasma humano como um ligante para a proteína de membrana externa bacteriana do receptor H de Haemophilus influenzae tipo f. Um ensaio enzima-lig da imunoabsorção foi empregado para caracterizar as interações da proteína-proteína entre proteína recombinante purificada H e vitronectina, e vinculação afinidade foi avaliada usando interferometria de bio-camada. A importância biológica da vinculação da vitronectina a proteína H na superfície da célula bacteriana em evasão da resposta imune do hospedeiro foi confirmada usando um ensaio de resistência de soro com soro humano normal e vitronectina empobrecido. A importância da vitronectina na adesão bacteriana foi analisada usando lâminas de vidro com e sem revestimento vitronectina, seguido de coloração de Gram. Finalmente, a adesão bacteriana em monocamadas de células epiteliais alveolares humana foi investigada. Os protocolos descritos aqui podem ser facilmente adaptados para o estudo de todas as espécies bacterianas de interesse.
Introduction
Vitronectina (Vn) é uma importante glicoproteína humana envolvido na manutenção da homeostase através de regulamentação do sistema fibrinolítico. Vn também funciona como um regulador de complemento inibindo o caminho de complemento terminal durante a formação do complexo C5b6-7 e polimerização C9. Vários patógenos bacterianos foram mostrados para recrutar Vn à superfície da célula, como um meio de resistir ao complemento deposição1,2,3. Além disso, Vn funciona como uma molécula de "sanduíche" entre bactérias e receptores de células epiteliais anfitrião, assim, promover a adesão e interiorização de patógenos2,4,5. Vinculação de Vn à superfície da célula bacteriana é mediada por outras proteínas atualmente não identificadas. Totalmente elucidar o papel funcional de Vn-ligação na evasão da resposta imune mangueira, portanto, exigirá a identificação das proteínas Vn-recrutamento.
O passo inicial na identificação de proteínas Vn é testar se um patógeno de interesse pode vincular purificada Vn. fluxo cytometry é um método conveniente e simples para determinar se o Vn é vinculado às células do patógeno. Neste estudo, avaliamos a ligação do Vn a vários Haemophilus influenzae tipo f (Hif) isolados clínicos6. O método descrito neste documento é quantitativo e pode ser usado para distinguir a capacidade de ligação de uma grande variedade de estirpes de bactérias. Em um estudo anterior, caracteriza-se proteína H (PH) de Hif como um Vn-ligação proteína7. Portanto, no presente estudo, o potencial de Vn-vinculação de mutantes de tipo selvagem (WT) Hif e Hif M10Δlph foram comparados usando os protocolos descritos.
Assim que for determinado que um patógeno vincula Vn, o segundo passo é caracterizar o proteome superfície a fim de identificar potenciais Vn-proteínas. Uma variedade de abordagens pode ser usada para este propósito8,9, mas essas metodologias não são descritas neste relatório. O método mais apropriado para examinar interações da proteína-proteína é recombinantes expressam proteínas de superfície bacterianas selecionadas em e. coli e purificar por cromatografia de afinidade. Aqui, nós usamos o PH e sua interação molecular com Vn para ilustrar o método. Interações entre recombinante PH e Vn foram caracterizadas usando uma enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)7 e uma técnica livre de etiqueta desenvolvida recentemente conhecido como bio-camada interferometria (BLI)10,11. Considerando que o Elisa pode ser usada para confirmar as interações da proteína-proteína, BLI fornece dados detalhados sobre os parâmetros cinéticos das interações.
Para estudar o papel funcional de Vn na adesão bacteriana, podem ser utilizados dois ensaios diferentes. O primeiro ensaio descrito aqui é uma medição direta de aderência bacteriana Vn-revestido em superfícies de vidro, Considerando que o segundo ensaio examina aderência à superfície das células epiteliais. Para o primeiro ensaio, lâminas de vidro foram revestidas com Vn, e a ligação do WT ou estirpes mutantes de Hif foi avaliada pela coloração de Gram e microscopia. Esta técnica distingue prontamente bactérias baseadas na capacidade para vincular Vn12. Aderência bacteriana às células dos mamíferos foi então analisada pela adição de bactérias cultivadas em uma monocamada de células alveolares tipo II; fixação bacteriana foi avaliada pela contagem do número de formadoras unidades (CFUs). Bactérias aderidas e interiorizadas podem ser distinguidas na presença ou ausência de Vn4,13.
O papel da aquisição de Vn em resistência bacteriana soro foi avaliado usando um ensaio de matança de soro (ou seja, atividade bactericida do soro). Para avaliar a importância da aquisição de Vn na resistência do soro, a atividade bactericida do soro Vn-esgotada (VDS) foi comparada com o de soro humano normal (NHS). O método usado prontamente distingue Vn-ligação contra bactérias não-vinculativa com base na resistência do soro. Nós usamos este método para estudar o papel do Vn da resistência de soro de vários patógenos bacterianos4,12.
Inúmeros métodos têm sido relatados para estudar interações patógeno-hospedeiro. Aqui, descrevemos um conjunto de protocolos que pode facilmente ser adaptado para o estudo de qualquer agente patogénico a fim de avaliar o papel de Vn na patogênese. Nós testamos estes protocolos utilizando vários patógenos e Hif foi escolhido como um exemplo para este relatório.
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Protocol
1. análise de Vn como um ligante de proteína de superfície bacteriana
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Deteção de Vn-ligação na superfície bacteriana usando citometria de fluxo
Nota: Em citometria de fluxo, costumávamos lado scatter e dispersão frente portão eventos positivos. Para examinar as interações com Vn, Hif clínico isolados (n = 10)7 foram selecionados juntamente com Escherichia coli BL21 (DE3) como um controle negativo (Figura 1A).- Cultura Hif clínico isolados em suplementado com 10 µ g/mL NAD e hemina a 37 ° C com agitação a 200 rpm (BHI) de infusão cérebro-coração. Use meio de Luria-Bertani à cultura de Escherichia coli14. Colheita de Hif cada fase log de mid (OD600 = 0.3)15e ressuspender as bactérias em tampão fosfato salino (PBS), pH 7.2, contendo 1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) (tampão de bloqueio; PBS-BSA). Ajustar a suspensão para 109 UFC/mL.
- Transferir as alíquotas que contém 5 x 106 UFC para tubos de fundo redondo de 5 mL poliestireno (12 x 75 mm2) e adicione 1 mL de tampão de bloqueio. Centrifugar a suspensão de 3.500 × g em temperatura ambiente (RT)16 por 5 min para as bactérias de pelotas e, em seguida, Aspire cuidadosamente para remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Resuspenda as pelotas bacterianas com 50 μL de tampão de bloqueio contendo 250 nM Vn e incubar as amostras por 1h no RT sem tremer. Após a incubação, as bactérias de pelotas por centrifugação a 3.500 x g durante 5 min e, em seguida, lave as pelotas três vezes usando PBS e etapas de centrifugação semelhantes.
- Ao pellet bacteriana, adicione 50 μL de ovelhas primário anti-humano Vn Anticorpos policlonais de (pAbs) na diluição de 1: 100 em PBS-BSA. Incube a suspensão por 1h no RT e, em seguida, lavar as bactérias três vezes com PBS para remover anticorpos desacoplados (conforme descrito na etapa 1.1.3).
- Em seguida, adicione 50 μL de PBS-BSA contendo isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugados burro anti-ovelha pAbs (diluição de 1: 100) e incubar a RT por 1h no escuro.
- Prepare um controle em branco incubando bactérias com o bloqueio de buffer apenas e pAbs sem Vn.
- Lavar as bactérias três vezes com 1 mL de tampão de bloqueio e a suspensão de pelotas por centrifugação, conforme descrito na seção 1.1.2. Finalmente, resuspenda o pellet bacteriano com 300 µ l de PBS e analisar por citometria de fluxo7.
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Análise de ELISA da interação entre PH recombinante e Vn
Nota: Controles precisam ser incluídos para excluir a ligação inespecífica. Proteína humana fator H (FH) ou ligação C4b (C4BP) são usados como controles positivos e negativos, respectivamente.- Diluir cada uma das proteínas humanas (Vn, FH e C4BP) separadamente a 50 nM em Tris-HCl, pH 9.0 (tampão de revestimento). Dispense a 100 µ l de solução de proteína em cada poço de uma placa de microtitulação de Polysorp. Feche as placas com a tampa e armazenar a 4 ° C durante a noite (16 h) para facilitar a imobilização de proteínas para os poços da microplaca placa.
- Descartar a solução da placa de microtitulação pela inclinação de cabeça para baixo na pia e lavar os poços três vezes com 300 µ l de PBS/poço. Bloquear os Poços revestidos por 1h no RT com PBS contendo 2,5% (p/v) BSA (PBS-BSA).
- Depois de remover a solução de bloqueio, lave os poços três vezes com 300 µ l de PBS contendo 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST) por poço. Adicione 100 µ l de 50 recombinante nM com sua tag PH de cada amostra bem e incubar durante 1 h em RT Em poços de controle, adicione 100 µ l de PBS-BSA.
Nota: O gene lph codificação PH de Hif foi amplificado por PCR e clonado no vetor de expressão pET26b que adiciona uma 6 × sua marca no C-terminal da proteína expressa. O vetor recombinante foi transformado em Escherichia coli BL21(DE3) para expressão. NI-NTA resina foi usada para purificar a proteína recombinante15. - Descartar a solução de proteína e remover as proteínas unbound lavando os poços três vezes com 300 µ l de PBST por bem. Adicione 100 µ l de PBS-BSA contendo peroxidase de rábano silvestre (HRP)-conjugado antisua pAbs (01:10, 000 diluição) e incube por 1h no RT
- Prepare a solução de 20 mM A dissolvendo tetrametilbenzidina em uma solução de 5% de acetona e 45% de metanol. Para preparar a solução B, dissolver 19,2 g de ácido cítrico em 1.000 mL de H2O, ajustar o pH a 4,25 adicionando-se KOH e, em seguida, adicione µ l 230 de 30% H2O2. Armazenar as duas soluções no escuro no RT Apenas antes de usar, misture 500 µ l da solução B com 9,5 mL da solução A preparar o reagente de detecção de ELISA.
- Lavar os poços três vezes com 300 µ l de PBST por alvéolo e detectar complexos antígeno-anticorpo, adicionando-se 100 µ l de reagente de detecção de ELISA a cada poço.
- Adicionar 50 µ l de 1 M H2então4pois para parar a reação. Medir a densidade óptica dos poços a 450 nm, utilizando um leitor de microplacas.
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Estudo sobre a cinética de interação de recombinação PH e Vn usando BLI
- Imobilize Vn humana nos sensores amina reativos, usando a amina acoplamento método, de acordo com orientações11 do fabricante.
- Usando o PBS, serialmente diluir o ligante (recombinante PH) de 0 a 4 µM e transferir as soluções resultantes de uma placa de microtitulação 96 poços preto, de fundo plano. Execute o experimento a 30 ° C, usando um instrumento BLI17.
- Carrega a pasta de dados do software de análise de dados BLI. Selecione a opção 'Seleção de sensor' . Em seguida, selecione 'referência bem' (Vn-revestido sensor em PBS) para subtração.
- Selecione 'alinhar o eixo y para a linha de base' e 'interstep correção e alinhar a associação'. Pressione 'dados processo' que automaticamente irão abrir o guia de análise.
- Na guia de análise, selecione a opção 'associação e dissociação' em encaixe de curva. Selecione o modelo ' 1:1 ligação e montagem global'. Pressione 'ajustar curva' e exportação encaixe dados17.
2. caracterização do papel da Vn na aderência bacteriana
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Estudo de aderência bacteriana às superfícies de vidro revestido Vn
- Prepare uma solução de 2 µ g/mL de Vn em PBS e pipetar 10 µ l desta solução em um microscópio de vidro deslizam como uma única gota. Permita a entrega secar no slide por 30 min em RT. Coat um slide com albumina de soro humano (HSA) como controlo negativo.
- Lave as lâminas de vidro revestido proteína três vezes mergulhando os slides por dois segundos em um béquer contendo PBS para remover o excesso da proteína sem revestimento. Adicionar 20 mL de cultura recente do Hif (descrita na etapa 1.1.1) em um prato de petri de plástico estéril e submergir o Vn - vidro revestido HSA slides em meio de cultura. Incube os pratos a 37 ° C, durante 1 h com agitação a 20 rpm.
Nota: Hif M10 e Hif M10Δlph foram cultivadas em meio líquido BHI ou em placas de agar chocolate. O meio para o mutante lph foi suplementado com 10 µ g/mL canamicina15. - Após a incubação, remova qualquer bactéria desacoplada submergindo os slides três vezes em um copo cheio de PBS. Visualize as bactérias por coloração de Gram, conforme descrito.
- Remova excesso PBS de cada slide inclinando-a e tocando a borda no papel de tecido. Secar as lâminas durante 3-5 min à RT e corrigir as bactérias aderidas por passar cada slide três vezes sobre uma chama.
- Segure o slide pelas bordas com dois dedos em uma bandeja de coloração, em seguida, adicione 3-4 gotas (200 – 300 µ l) da solução de violeta de cristal de 2,3%. Espere 60 s e, em seguida, lave os slides sob uma ligeira corrente da torneira de água para 3 – 4 s.
- Adicione 3-4 gotas de solução de iodo de 0,33% sobre os slides. Espere 1 minuto e, em seguida, lave o slide em um fluxo suave de água da torneira. Seca cuidadosamente os slides por papel mata-borrão.
- Adicione 3-4 gotas de solução de descoloração contendo álcool isopropílico 75% e 25% de acetona para o slide. Após 5 a 10 s, lave o slide sob uma ligeira corrente de água da torneira.
- Adicione 3-4 gotas (200 – 300 µ l) de solução de carbolfuchsin básica. Espere 1 minuto e, em seguida, lave os slides em um fluxo suave de água da torneira. Seque os slides usando papel mata-borrão.
- Visualize as bactérias sob um microscópio de luz, selecionando uma lente objetiva de imersão de óleo em 100 X ampliação de18. Compare a aderência do Hif WT e bactérias mutantes nas superfícies de vidro Vn e HSA-revestido.
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Estudo da aderência de Vn-dependente de bactérias às células epiteliais
Nota: Este ensaio de aderência eficiente foi usado em nossos anteriores estudos4,7.- Cultura A549 células (tipo II alveolar epiteliais) em um frasco de cultura de tecidos de 75cm2 com F12 suplementado com 10% de soro fetal bezerro (vol/vol) (FCS) (médio completo) e 5 µ g/mL gentamicina. Incubar o frasco em uma incubadora com 5% CO2 a 37 ° C durante 3 dias até 80% de confluencia (confluência pode ser estimada através da visualização de cobertura de superfície pelas células usando microscópio invertido). As quatro etapas a seguir descrevem como preparar as células epiteliais para o ensaio de19,20.
- Lave a monocamada de células no frasco duas vezes com 20 mL de PBS e agitando suave. Para separar as células da superfície do balão, adicionar 2 mL de solução de enzima de desprendimento de célula e incubar o frasco por 5 min a 37 ° C. Toque o balão com a palma da mão para retirar todas as células da superfície do plástica. Pipetar para cima e para baixo algumas vezes para dispersar grupos de célula.
- Adicionar 18 mL de meio completo F12 no balão e transfira a suspensão de toda a célula a um tubo estéril de Falcon 50 mL. Centrifugar a suspensão de eritrócitos por 5 min a 200 x g em RT e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 10 mL de meio completo F12.
- Remover 10 µ l da suspensão celular e colocá-lo em um tubo de Eppendorf, em seguida, adicione 90 µ l de solução de azul de Tripan. Carregar a amostra em um hemocytometer (profundidade de 0,1 mm) depois de colocar a lamela.
- Contar todas as células viáveis em áreas A, B, C e D (cada campo é composto por 16 quadrados e cada quadrado tem uma área de 0,0025 mm2), em seguida, calcule o número médio de células ([A + B + C + D] / 4). Calcule o número de células por mililitro, utilizando a seguinte equação:
Viável de células/mL = média célula contagem × 104 × diluição fator20.
Nota: Aqui, o factor de diluição é 10. - Dilua a suspensão de células para 5.0 x 103 células/mL, usando completo médio contendo gentamicina de 5 µ g/mL. Dispense a 500 µ l de suspensão de células em cada poço de uma placa de cultura de células 24 poços. Incube a placa a 37 ° C em 5% CO2 até que as células são 90% de Confluencia.
- Antes da infecção bacteriana, remover o meio dos poços e adicionar F12 médio (sem FCS) e incubar durante uma noite a 37 ° C.
- Lave a monocamada celular três vezes com 500 µ l de PBS em RT. lugar a placa no gelo e adicionar 100 µ l de pre-refrigerados F12 médio contendo 10 µ g/mL de placa Vn. Incubar a 4 ° C, durante 1 h. Para poços de controle, adicione apenas F12 médio.
- Após a incubação, descartar a solução pipetando e lave a camada celular duas vezes com 1 mL de PBS em RT. Ressuspender uma cultura de recém crescido Hif M10 (etapa 1.1.1) no meio de F12 (2 × 108 UFC/mL). Adicione 100 µ l da suspensão bacteriana a cada poço e incubar a placa por 2 h a 37 ° C.
Nota: Cada bem contém cerca de 2 x 105 A549 de células. Para a infecção, 2 x 107 UFC bacteriana foram adicionados, correspondendo a uma multiplicidade de infecção de 100. - Retire o meio pipetando e lave as células epiteliais A549 três vezes com PBS. Adicionar 50 µ l/poço de solução de desprendimento de célula e incubar a placa por 5 min a 37 ° C.
- Em seguida, adicione 50 µ l de meio completo F12 por alvéolo para parar a reação enzimática. Transferi as células epiteliais (≈100 μL [ou seja, todo o volume]) de cada poço para um tubo de vidro de 6 mL contendo quatro esferas de vidro. Lise as células em RT vortexing por 2 min.
- Diluir 10 µ l do lisado celular 100-fold, adicionando 10 µ l de lisado a 990 µ l de meio F12. Placa de 10 µ l da amostra diluída em uma placa de ágar chocolate.
- Incubar a placa de ágar chocolate a 37 ° C durante a noite e, em seguida, contar as colônias. Cada colônia representa um UFC.
- Cultura A549 células (tipo II alveolar epiteliais) em um frasco de cultura de tecidos de 75cm2 com F12 suplementado com 10% de soro fetal bezerro (vol/vol) (FCS) (médio completo) e 5 µ g/mL gentamicina. Incubar o frasco em uma incubadora com 5% CO2 a 37 ° C durante 3 dias até 80% de confluencia (confluência pode ser estimada através da visualização de cobertura de superfície pelas células usando microscópio invertido). As quatro etapas a seguir descrevem como preparar as células epiteliais para o ensaio de19,20.
3. análise de Vn-dependente, resistência à atividade bactericida do soro humano
- NHS de compra de uma fonte comercial. Prepare-se como descrito anteriormente12VDS. Reabastecer o VDS com 180 nM Vn que é equivalente a Vn presente no NHS.
- Prepare soro inativado por calor (HIS), NHS de aquecimento a 56 ° C durante 30 min para inativar proteínas do complemento.
Nota: A concentração sérica ideal (5%) e o tempo de incubação (15 min) para o ensaio descrito nos passos 3.3 – 3.7 foram determinados empiricamente para Hif15; esses parâmetros podem variar para outros patógenos bacterianos. - Cultura de bactérias (no caso, Hif M10 e o mutante Hif M10Δlph) para fase log de mid (OD600 = 0,3). Bactérias de pelotas por centrifugação a 3.500 x g durante 10 minutos.
- Resuspenda o pellet bacteriano com 1 volume de gelatina dextrose Veronal tampão (DGVB ++; pH 7,3) contendo 2,5% (p/v) de glicose, 2 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2e gelatina de 0,1% (wt/vol).
- Adicionar 1,5 x 103 UFC de bactérias para 100 µ l de DGVB ++ contendo 5% de soro (NHS, dele, VDS, ou VDS + 180 nM Vn). Incube a amostra a 37 ° C por 15 min com agitação a 300 rpm.
- Retire uma alíquota 10 µ l da mistura reacional em 0 min (amostra de T0 ) e 15 min (amostra det T) e placa de ágar chocolate. Incube a placa a 37 ° C durante a noite.
- Após a incubação, contam-se as colônias que aparecem na placa. Calcular a percentagem de bactérias matou12 usando a seguinte equação: (CFU em Tt) / (CFU em T0) × 100.
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Representative Results
Vn-vinculação à superfície de bactérias foi determinada por citometria de fluxo. Hif todos os isolados clínicos testados neste estudo recrutou Vn à superfície da célula. Nenhuma interação de Vn com superfície celular foi observada para a tensão de controle negativo de e. coli (Figura 1A). Como mostrado na Figura 1B, PH é uma major Vn-proteína na superfície das células de Hif. Vinculação de Vn pela tensão WT Hif M10 causaram uma mudança na população, Considerando que o Hif M10Δlph não se ligam a Vn e apareceu semelhante ao controle.
Interações da proteína-proteína entre PH e Vn foram estimadas por ELISA e BLI. PH recombinante foi autorizado a vincular com o factor humano H, Vn e C4BP (controle negativo) revestido em poços da microplaca placas ELISA. Vinculado PH foi estimada usando um antisua pAbs. Os resultados indicaram claramente uma interação significativa entre PH e Vn e fator H, em comparação com C4BP(Figura 2). Interação entre PH e Vn foram estimados em tempo real usando BLI. Figura 2 B mostra curvas de resposta de vinculação de PH para a superfície do sensor Vn-revestido. Afinidade de ligação (neste caso, Kd = 2,2 µM) foi estimada por encaixe os dados de cinética de ligação do estado estacionário.
Bactérias, falta de expressão do PH na superfície das células (Hif M10Δlph) exibida reduziram aderência Vn-revestido em superfícies de vidro em comparação com células WT(Figura 3). Além disso, a presença de Vn na superfície das células epiteliais aprimorado significativamente a aderência do Hif (Figura 3B). Estes resultados indicaram que a interação de PH-Vn contribuíram significativamente para a aderência bacteriana.
Vn é um inibidor do complemento conhecido. Para estimar a atividade inibindo complemento, a matança da soro foi examinada na presença e ausência de células Vn. WT Hif exibiu maior resistência de soro que M10Δlph células mutantes. Nenhuma bactéria foram morta na presençadele (Figura 4). Curiosamente, WT Hif exibiu sobrevivência reduzida em VDS, e reabastecimento de Vn aumentou a sobrevivência bacteriana. No entanto, o Hif M10Δlph estirpe não respondeu ao esgotamento de Vn porque ele não poderia recrutar Vn à superfície da célula (Figura 4B). Estes resultados demonstram claramente que Vn é um factor importante de acolhimento que protege as bactérias da matança mediada por complemento (Figura 4A-B).
Figura 1 : Haemophilus influenzae sorotipo f vincula Vn através de doutoramento de superfície-expresso (A) fluxo cytometry resultados mostrando a ligação do Vn a células de isolados clínicos de Hif. Cada clínico isolado (5 x 106 UFC) foi incubado com 250 nM humano Vn. Bound ligante foi detectada usando uma ovelha anti-Vn pAbs e conjugado FITC burro antianticorpos ovelha secundários. Escherichia coli BL21 (DE3) foi incluída como um controle negativo. Os dados são apresentados como a intensidade de fluorescência média de análises triplicadas em três experimentos distintos e barras de erro representam histogramas de citometria de fluxo de SD. (B) demonstrando a vinculação de Vn à superfície do WT Hif M10 e PH-exclusão Hif M10Δ lph mutante. Dados representativos de um dos três experimentos separados são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : PH recombinante vincula a Vn. (A) ELISA resultados demonstrando a vinculação do PH recombinante Vn, FH e C4BP. FH foi usado como controle positivo, Considerando que C4BP foi usado como um controle negativo. Para analisar as interações da proteína-proteína, Vn, FH e C4BP foram revestidas em equimolar (50 nM) concentrações para os poços das placas de microtitulação. Em seguida, 50 recombinante nM, PH-His6x foi adicionado. Obrigado PH foi detectada usando um conjugado HRP antisua pAbs. Dados mostrados são os meios de análises triplicadas de três experimentos independentes, e as barras de erro indicam SD. * * *, ≤0.001 P. (B) BLIanalysis de ligação de PH a Vn: Vn recombinante foi imobilizada em sensores de AR2G e a cinética de ligação do PH (0,25-4 µM) para Vn foram gravadas usando o instrumento BLI. A constante de afinidade de equilíbrio foi calculada usando sinais obtidos para cada concentração no estado de equilíbrio, e os dados foram ajustados de acordo com a cinética do estado estacionário. O experimento foi repetido três vezes, e um conjunto de dados representativo é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Interação entre PH e Vn melhora a aderência bacteriana às superfícies de vidro e células epiteliais. (A) luz microscópicas imagens mostrando a aderência do Hif Vn-revestido de lâminas. As bactérias foram visualizadas por coloração de Gram. São mostradas imagens representativas de um dos três experimentos independentes. Este painel foi anteriormente publicado no Jornal de Imunologia7 e está reproduzido aqui com permissão da associação americana de imunologistas. (B) aderência do WT Hif M10 células às células epiteliais A549 na presença e na ausência de Vn, meios de análises triplicadas de três experimentos independentes são plotados e barras de erro representam SD. *, p ≤0.05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Vn recrutado à superfície da célula de Hif protege bactérias da matança da soro. (A) WT Hif M10 e mutante Hif M10Δlph foram incubados durante 15 min em 5% do NHS ou dele. (B) resistência de Hif M10 e Hif M10Δlph para bactericida efeitos em 5%, VDS e VDS suplementados com 250 nM purificado Vn. dados representam meios de análises triplicadas de três experimentos independentes, e as barras de erro indicam SD. * * *, p ≤0.001; NS, não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Patógenos bacterianos recrutam Vn à superfície da célula e utilizam este regulador de complemento para impedir a deposição de factores do complemento e conclusão da membrana ataque complexo2. Vn também funciona como uma molécula de ponte entre proteínas de superfície bacterianas e receptores de superfície celular hospedeiro, permitindo assim a patógenos de aderir à superfície das células epiteliais e posteriormente mediar a internalização. Neste estudo, descrevemos os protocolos que podem ser usados para estimar i) ligação do Vn a superfície das células bacterianas, interações proteína-proteína ii) e constantes de afinidade e iii) o papel funcional de Vn no fornecimento de soro resistência e reforço da aderência à superfície das células do hospedeiro.
Citometria de fluxo é uma técnica quantitativa, comumente usada para verificar que as bactérias se ligam Vn. No entanto, a concentração de Vn deve ser otimizada, como a capacidade de Vn-ligação (e vários receptores) podem diferir dependendo da espécie bacteriana. No ensaio descrito aqui, de 1 a 100 µ g/mL de Vn foram usados para estimar ligação linear e parâmetros de saturação. Comparação entre os padrões de vinculação de Hif WT, o Hif M10Δlph mutante e células de Escherichia coli de controlo negativo mostrou uma clara diferença em uma concentração de Vn de 20 µ g/mL (250 nM). Portanto, esta concentração foi usada em todos os experimentos de citometria de fluxo. O uso de Vn em concentrações acima do ponto de saturação pode produzir sinais falso-positivos. Diluição dos anticorpos primários e secundários também deve ser otimizada separadamente para cada patógeno. Deve ser escolhida a diluição máxima de anticorpos mostrando um bom sinal. Neste estudo, usamos 2,5% BSA como um agente de bloqueio. No entanto, BSA não é um reagente universal de bloqueio apropriado para todos os agentes patogénicos. Nos casos em que BSA não bloqueia interações de anticorpos inespecíficos, podem ser usados outros reagentes de bloqueio, tais como gelatina de peixe. Ligação do Vn a superfície das células bacterianas patógeno frequentemente é mediada por vários receptores21,22. Alguns receptores têm alta afinidade de ligação Vn, enquanto outros podem apresentar afinidade de ligação de baixa. Assim, a exclusão de apenas um gene que codifica uma proteína não pode resultar em uma diminuição interações Vn avaliada por citometria de fluxo. Como uma alternativa para citometria de fluxo, emperramento da proteína na superfície das células bacterianas pode ser examinado usando um ensaio de imunofluorescência (IFA) ou microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Embora o fotobranqueamento de anticorpos conjugados a fluororeagent pode ser problemático em citometria de fluxo e IFAs, TEM envolve a preparação da amostra pesada, com substancial risco de introdução de artefatos23,24. Análise de citometria de fluxo é certamente preferível IFA e TEM devido a protocolos de preparação de amostra mais simples e a possibilidade de testar muitas amostras dentro de um curto espaço de tempo.
Interações da proteína-proteína em um sistema livre de células foram analisadas por ELISA(Figura 2)e BLI (Figura 2B). Em ambas estas técnicas, um dos parceiros vinculação foi imobilizado, em um biossensor (para BLI) ou uma placa de microtitulação (ELISA). A vantagem do BLI e ELISA é que eles permitem a análise de interações da proteína-proteína em seu estado nativo, evitando interações não específicas fora do sítio de ligação activa. A utilidade da BLI, no entanto, pode ser limitada dependendo da imobilização usada. A amina acoplamento procedimento utilizado aqui aleatoriamente forma uma ligação Amida entre qualquer grupo de amina superfície exposta da proteína e a superfície da biosensor. Isso resulta em imobilização de moléculas de proteína na superfície do sensor em várias orientações. Isso pode resultar em ligação heterogênea que não cabe um modelo de cinética de ligação 1:1. Este potencial problema pode ser resolvido selecionando sensores de biotina e adicionando uma tag streptavidin na proteína recombinante para ser imobilizado. A confiabilidade do BLI é similar de ressonância de plasmon de superfície (SPR). A associação e dissociação de moléculas podem ser medidos em tempo real usando qualquer técnica. No entanto, o dispositivo BLI não usa microfluídica e, portanto, é fácil de manter. Além disso, 96 interações podem ser testadas simultaneamente em BLI, Considerando que apenas quatro amostras de cada vez podem ser testadas usando SPR. Há mais um passo crítico no BLI que deve ser otimizado. Se os sensores são reutilizados, condições de regeneração também devem ser otimizadas, como isso pode variar para cada complexo proteína-proteína. Neste estudo, ácido etilenodiaminotetracético de 10 mM foi encontrado apropriado para regeneração do sensor.
O papel de Vn na aderência bacteriana foi testado usando diretamente as superfícies de vidro revestidas com Vn. Esta abordagem pode ser empregada para analisar a vinculação de qualquer agente patogénico bacteriano, incluindo bactérias Gram-negativas e - positivas. Esta é uma técnica semiquantitativa que fornece avaliação rápida da capacidade de um agente patogénico para vinculação de Vn. Para obter resultados razoáveis, Vn revestimento deve ser otimizado. No ensaio descrito aqui, analisou-se revestimento com Vn em 1, 2 e 5 µ g/mL, e 2 µ g/mL foi encontrado para ser a concentração mais apropriada para os experimentos realizados neste estudo(Figura 3). Vn excesso revestido na superfície poderia criar uma camada grossa que poderia ser facilmente arrancada durante a amostra de fixação e coloração. Além disso, a cultura bacteriana não deve ter grandes aglomerações de células; Isto pode ser evitado pela utilização do Vortex a cultura antes de adicionar uma alíquota para os slides.
Aderência bacteriana à superfície das células epiteliais foi examinada usando uma técnica de contagem de placa(Figura 3). Este ensaio também deve ser otimizado de cuidadosamente para permitir a observação do papel do Vn na adesão bacteriana. Vn possui sítios de ligação diferentes para bactérias (no C-terminal) e receptores de superfície integrinas (no local de ligação do N-terminal RGD) da pilha. Ligação do Vn a integrinas induz sinalização e captação da integrina-Vn complexo1. Se tais complexos são internalizados sem bactérias, os resultados serão difíceis de interpretar. Portanto, Vn deve ser adicionado para a monocamada de células epiteliais em 4 ° C. Uma vez que Vn tem saturado a integrina receptores na superfície das células epiteliais, Vn em excesso deve ser lavado, como Vn livre pode bloquear ligação de integrina bacteriana Vn-dependente. Neste ensaio, estimamos bacteriana total conta associada a células epiteliais (isto é, a leitura compreendida conectado à superfície e internalizada de bactérias). Este ensaio pode ser estendido para distinguir entre as populações bacterianas externas e intracelulares por tratamento com Gentamicina4.
O ensaio bactericida do soro utilizado no protocolo descrito aqui foi parcialmente modificado o procedimento anteriormente publicado12,22. No ensaio descrito aqui, 1.5 x 10que 3 CFUs de Hif foram incubados com NHS de 5% por 15 min, 5 min mais do que no ensaio descrito anteriormente(Figura 4). A diferença entre o Hif WT e o mutante isogénicas desprovido de PH foi mais evidente em 15 min do que em 10 min. Portanto, nós selecionamos o período de incubação de 15 min para esta experiência particular. Os efeitos bactericidos do soro dependem da concentração sérica, tempo de incubação e o número de bactérias. Todos os agentes patogénicos exibem uma notável capacidade para evitar a atividade bactericida do soro; alguns patógenos podem ser completamente resistentes ao soro, enquanto outros podem ser moderadamente resistente ou sensível. A concentração de soro, portanto, deve ser otimizada para cada patógeno específico examinado. No entanto, o soro matando ensaio descrito aqui é limitado para o estudo das bactérias Gram-negativas, desde que o soro não tem nenhum efeito bactericido significativo em células gram-positivas,1,5.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesses financeiros.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação de Anna e Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. e Edla Johansson Foundation, o sueco Medical Research Council (conceder o número K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), a Fundação de câncer da Universidade Hospital em Malmö, a sociedade Physiographical (Fundação do Forssman) e o Conselho de Condado de Skåne pesquisa e Fundação para o desenvolvimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
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