Summary
Bu rapor bakteriyel dış membran proteinlerinin ve insan tamamlayıcı regülatörü vitronectin arasındaki etkileşimler karakterize için iletişim kurallarını açıklar. İletişim kurallarını bağlama reaksiyonlar ve biyolojik fonksiyonu herhangi bir bakteri türlerinde vitronectin eğitim için kullanılabilir.
Abstract
Bakteri tamamlayıcı düzenleyiciler konak immün yanıt evading bir araç olarak kullanmaktadır. Burada, biz rol vitronectin edinme bakteri hücre yüzey çalış, direnç ana bağışıklık sistemi için değerlendirmek için protokol tanımlamak. Akış Sitometresi deneyler insan plazma vitronectin Haemophilus influenzae tip f bakteriyel reseptör dış membran protein H için bir ligand olarak teşhis etti. Bir enzim bağlı immunosorbent assay saflaştırılmış Rekombinant protein H ve vitronectin arasındaki protein-protein etkileşimler karakterize etmek için istihdam edildi ve benzeşme bağlama biyo-katman Interferometry kullanarak değerlendirildi. Vitronectin protein H Ana bilgisayar bağışıklık yanıtının kaçakçılığı bakteri hücre yüzeyinde bağlama biyolojik önemi bir serum direnç tahlil normal ve vitronectin tükenmiş insan serumu ile kullanarak teyit edildi. Vitronectin bakteriyel uyum içinde önemi ve vitronectin kaplama, Gram boyama tarafından takip olmadan cam slaytlar kullanılarak analiz. Son olarak, insan alveoler epitel hücre monolayers için bakteriyel yapışma araştırılmıştır. Burada açıklanan protokoller faiz bakteriyel herhangi bir tür çalışma odasına kolayca adapte edilebilir.
Introduction
Vitronectin (Vn) önemli bir insan glikoprotein homeostazı, düzenleme, fibrinolitik sistem üzerinden sürdürmek için yer var. VN da C5b6-7 karmaşık oluşumu ve C9 polimerizasyon sırasında terminal tamamlayıcı yolu engelleyerek bir tamamlayıcı regülatör işlev görür. Birçok bakteriyel patojenler Vn hücre yüzeyine karşı kompleman birikimi1,2,3aracı olarak işe gösterilmiştir. Buna ek olarak, bakteri ve ana bilgisayar epitel hücre reseptörleri, böylece teşvik bağlılık ve patojenler2,4,5içselleştirilmesi arasında bir "sandviç" molekül Vn görür. Vn bağlama bakteri hücre yüzeyine Şu anda kimliği belirsiz diğer proteinler tarafından aracılık ettiği. Vn-hortum bağışıklık yanıtının kaçakçılığı bağlamasında işlevsel rolü tam olarak elucidating bu nedenle kimlik Vn-işe proteinlerin gerektirir.
Vn bağlanıcı proteinler belirlenmesinde ilk adım bir patojen ilgi arıtılmış Vn. akış sitometresi bağlayabilirsiniz olup olmadığını sınamak için Vn patojen hücrelere bağlı olup olmadığını belirlemek için uygun ve basit bir yöntem olmasıdır. Bu çalışmada, Vn bağlamaya çeşitli Haemophilus influenzae tip f (kurulan) klinik yalıtır6değerlendirildi. Burada açıklanan yöntemi kantitatif ve çok çeşitli bakteri suşları bağlama kapasitesi ayırt etmek için kullanılabilir. Bir önceki çalışmada, protein H (PH) kurulan bir Vn bağlayıcı protein7olarak karakterize. Bu nedenle, mevcut çalışmada, yaban tipi (WT) kurulan ve kurulan M10Δlph mutantlar Vn-bağlama potansiyelini karşılaştırıldığında açıklanan protokolleri kullanarak.
Bir patojen Vn bağlar belirlendikten sonra olası Vn bağlanıcı proteinler tanımlamak için yüzey Proteom karakterize ikinci adımıdır. Yaklaşımlar çeşitli bu amaç8,9için kullanılabilir, ancak bu metodolojileri bu raporda açıklanan değildir. Protein-protein etkileşimlerinin incelenmesi için en uygun recombinantly E. coli seçilen bakteri yüzey proteinleri hızlı ve benzeşme Kromatografi tarafından arındırmak için yöntemidir. Burada, PH ve moleküler etkileşim Vn ile belgili tanımlık yöntem göstermek için kullanırız. Rekombinant PH ve Vn arasındaki etkileşimler bir enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA)7 ve biyo-katman Interferometry (BLI)10,11bilinen son zamanlarda gelişmiş bir etiket içermeyen tekniği kullanılarak karakterize. ELISAs protein-protein etkileşimleri onaylamak için kullanılan ise saçınıza etkileşimlerin kinetik parametreleri ile ilgili ayrıntılı verileri sağlar.
Vn işlevsel rolü bakteriyel uyum içinde çalışmak için iki farklı deneyleri yararlı olabilir. Burada açıklanan ilk tahlil Vn kaplı cam yüzeyler, bakteriyel bağlılık doğrudan ölçülmesi ise ikinci tahlil yüzey epitel hücrelerinin bağlılığı inceliyor. İlk tahlil için cam slaytlar Vn ile kaplı ve bağlama WT veya mutant kurulan suşları Gram boyası ve mikroskopi tarafından değerlendirildi. Bu teknik kolayca bakterileri Vn12bağlama yeteneği göre ayırt eder. Memeli hücre bakteriyel yapışma o zaman kültürlü bakteri türü II alveoler epitel hücresi monolayer üzerine ekleyerek analiz edildi; bakteriyel eki değerlendirildi koloni oluşturan sayısını sayarak birimleri (CFUs). Yapıştırılan ve içselleştirilmiş bakteri Vn4,13içinde ayırt edici olabilir.
Bakteriyel serum direnç Vn edinme rolünün bir serum öldürme tahlil (yani, serum bakterisidal etkinlik) kullanılarak değerlendirilmiştir. Serum direnç www.cdc.gov/drugresistance Vn edinme önemini değerlendirmek için Vn tükenmiş bir serum (VDS) bakterisidal etkinlik bu normal insan serumu (NHS) ile karşılaştırıldı. Kolayca kullanılan yöntem Vn-bağlama karşı bağlayıcı bakterileri serum direnci üzerinde göre ayırt eder. Vn rolde birkaç bakteriyel patojenler4,12serum direnç eğitim için bu yöntemi kullandık.
Ana bilgisayar-patojen etkileşimleri eğitimi için çok sayıda yöntem bildirilmiştir. Burada, kolayca herhangi bir patojen çalışma odasına Vn rol patogenezinde değerlendirmek için adapte edilebilir iletişim kuralları kümesi açıklar. Bu protokoller çeşitli patojenler kullanarak test ettik ve kurulan bu rapor için bir örnek olarak seçildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bir bakteri yüzey Protein Ligand olarak Vn Analizi
-
Vn-bağlama kullanarak akış sitometresi bakteriyel yüzeyde tespiti
Not: akış sitometresi yan dağılım ve ileri dağılım olumlu olaylar kapı yapardık. Yalıtan Vn ile etkileşimleri incelemek için kurulan klinik (n = 10)7 E. coli BL21 ile birlikte seçildi (DE3) negatif kontrol (Şekil 1A) olarak.- Kültür kurulan klinik beyin-kalp infüzyon (BHI) orta 10 µg/mL NAD ve 200 devir / dakikada sallayarak ile hemin 37 ° C'de ile takıma izole ediyor. Luria-Bertani orta E. coli14kültür için kullanın. Hasat kurulan orta günlük aşamasında (OD600 0,3 =)15ve fosfat tamponlu tuz (PBS), %1 (w/v) Sığır serum albumin (BSA) (engelleme arabellek; içeren pH 7.2, bakterilerde resuspend PBS-BSA). Süspansiyon 10 ayarlamak9 CFU/mL.
- 5 x 10-6 CFU 5 mL polistren yuvarlak alt tüpler (12 x 75 mm2) içeren aliquots aktarmak ve engelleme arabellek 1 mL ekleyin. Süspansiyon 3500 × g oda sıcaklığında (RT)16 5 min için de bakteri cips santrifüj kapasitesi, sonra dikkatlice süpernatant Pelet bozmadan kaldırmak için Aspire edin.
- Bakteriyel granül 50 μL engelleme arabelleği içeren 250 ile resuspend nM Vn ve sallayarak olmadan örnekleri RT, 1 h için kuluçkaya. Kuluçka sonra bakteri tarafından Santrifüjü 3.500 x g 5 min için de cips sonra granül üç PBS ve benzer aralıklarla adımları kullanarak kez yıkayın.
- Bakteriyel Pelet için 1: 100 seyreltme PBS-BSA içinde 50 μL birincil koyun anti-insan Vn poliklonal antikorlar (pAbs) ekleyin. RT, 1 h için süspansiyon kuluçkaya sonra bakteri ilişkisiz antikorlar (1.1.3. adımda anlatıldığı gibi) kaldırmak için üç kez PBS ile yıkayın.
- Sonra PBS-BSA içeren floresein isothiocyanate (FITC) 50 μL ekleyin-Birleşik eşek Anti-koyun pAbs (1: 100 seyreltme) ve RT karanlıkta 1 h için kuluçkaya.
- Boş bir denetim sadece tampon ve pAbs Vn olmadan engelleme ile bakteri kuluçka tarafından hazırlayın.
- Üç kez engelleme arabelleği 1 mL ile bakteri yıkama ve süspansiyon Santrifüjü tarafından 1.1.2 bölümünde açıklandığı gibi cips. Son olarak, bakteriyel Pelet PBS 300 µL ile resuspend ve akış sitometresi7tarafından analiz.
-
Rekombinant PH ve Vn arasındaki etkileşimi ELISA Analizi
Not: Denetimleri nonspesifik bağlama dışlamak için dahil edilmesi gerekiyor. İnsan faktörü H (FH) veya C4b bağlayıcı protein (C4BP) sırasıyla pozitif ve negatif denetimleri kullanılır.- Her biri ayrı ayrı 50'ye insan proteinler (Vn, FH ve C4BP) seyreltik nM Tris-HCl, pH 9.0 (kaplama arabellek) içinde. 100 µL protein çözüm Polysorp microtiter plaka her kuyuya dağıtmak. Plakalar kapak ile kapatın ve microtiter plaka wells 4 ° protein immobilizasyon kolaylaştırmak için C bir gecede (16 h) saklayın.
- Baş aşağı lavabo üzerinde eğerek microtiter plaka çözümden atın ve wells üç kez PBS/iyi 300 µL ile yıkayın. RT %2.5 (w/v) BSA (PBS-BSA) içeren PBS ile 1 h için kaplamalı wells engelleyin.
- Engelleme çözüm kaldırdıktan sonra wells üç kez 300 µL % 0.05 (v/v) ara 20 (PBST) iyi ücret içeren PBS ile yıkayın. O'nun öğesini PH her örnek için iyi ve RT. 1 h için kuluçkaya 50 nM rekombinant 100 µL Ekle Denetim wells, PBS-BSA sadece 100 µL ekleyin.
Not: PH üzerinden kurulan kodlama lph gen PCR tarafından güçlendirilmiş ve ifade protein C-terminus adlı bir His 6 × etiketi ekler pET26b ifade vektör içine klonlanmış. Rekombinant vektör E. coli BL21(DE3) ifade için dönüştü. Ni-NTA reçine Rekombinant protein15arındırmak için kullanılmıştır. - Protein çözüm atın ve ilişkisiz proteinler wells üç kez PBST 300 µL iyi ücret ile yıkayarak çıkarın. PBS-BSA içeren horseradish peroksidaz (HRP) 100 µL eklemek-Anti-O'nun pAbs (1:10, 000 seyreltme) Birleşik ve RT. 1 h için kuluçkaya
- 20 mM çözüm A tetramethylbenzidine %5 aseton ve % 45 metanol bir çözümde çözülerek hazırlayın. Çözüm B hazırlamak için 19.2 g sitrik asit H2O 1000 ml geçiyoruz, KOH ekleyerek 4,25 için pH ayarlayın, daha sonra 230 µL % 30 H2O2ekleyin. Her iki çözüm de RT. kararınca saklayın Sadece kullanmadan önce B çözeltinin 500 µL 9.5 mL çözeltisi ELISA algılama reaktif hazırlamak için A ile karıştırın.
- Wells üç kez ile PBST 300 µL başına iyi yıkama ve her şey için 100 µL ELISA algılama reaktif ekleyerek antijen-antikor kompleksleri algılamak.
- Yani 1 M H250 µL eklemek4/well reaksiyonu durdurmak için. Kuyu 450 de optik yoğunluğunu ölçmek Mikroplaka Okuyucu kullanarak nm.
-
Etkileşim kinetik rekombinant PH ve saçınıza kullanarak Vn incelenmesi
- İnsan Vn kullanarak yöntemi, kaplin amin amin-reaktif sensörlerimizde üreticinin yönergeleri11göre hareketsiz.
- PBS kullanarak, seri olarak 4 µM için 0 (rekombinant PH) ligand sulandırmak ve elde edilen çözümler bir 96-şey siyah, düz-alt microtiter tabağa aktarın. Deneme 30 ° C'de bir BLI enstrüman17kullanarak çalıştırın.
- ALMA verileri analiz yazılımı veri klasörü yükleyin. 'Sensör seçimi' seçeneğini belirleyin. O zaman, seçme 'iyi '(Vn kaplı sensör PBS) için referans çıkarma.
- 'Temel y ekseni Hizala' ve 'düzeltme interstep ve derneğe Hizala'seçin. Basın 'otomatik olarak analiz sekmesi açılır işlem veri'.
- Analiz sekmesi altında eğri uydurma 'Derneği ve ayrılma' seçeneğini belirleyin. Modeli seçin ' 1:1 bağlama ve genel montaj '. 'Eğrisi Sığdır' ve ihracat verileri17uygun tuşuna basın.
2. bakteriyel uyum içinde Vn rolü karakterizasyonu
-
Vn kaplı cam yüzeyler bakteriyel bağlılık incelenmesi
- Vn içinde PBS ve damlalıklı 10 µL üzerine cam mikroskop bu çözümün tek bir damla slayt 2 µg/mL çözeltisi hazırlamak. İnsan serum albumin (HSA) ile bir slayt dik kat, 30 dk için slayt üzerinde kurumaya bırakma negatif bir denetim sağlar.
- Protein kaplı cam slaytları slaytlar iki saniyeliğine aşırı kaplamasız protein kaldırmak için PBS içeren bir ölçek daldırma tarafından üç kez yıkayın. Yeni kurulan Kültür (1.1.1. adımda açıklanan) 20 mL steril plastik petri kabına ekleyin ve Vn - daldırın / HSA kaplı cam slaytlar kültür ortamında. Yemekler için 1 h 37 ° C'de 20 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.
Not: Kurulan M10 ve kurulan M10Δlph sıvı BHI orta veya çikolata ağar kaplamalar yetiştirilmiştir. Orta lph mutant için 10 µg/mL sefaloridin15ile desteklenmiş. - Kuluçka sonra üç kez bir ölçek PBS ile dolu slaytlar batış tarafından ilişkisiz herhangi bir bakteri kaldırın. Bakteri Gram boyama tarafından açıklandığı gibi gözünde canlandır.
- Aşırı PBS Bu yatırma ve doku kağıt üzerine kenar dokunmadan her slayttan çıkarın. 3-5 dk RT az slaytlarını kurumasına ve bir alev üzerinde üç kez her slayt geçirerek yapıştırılır bakteri düzeltin.
- İki parmak ile kenarları tarafından slayt boyama bir tepsi üzerinde tutun, sonra 3-4 damla (200 – 300 µL) % 2,3 kristal violet çözüm ekleyin. Bekle 60 s, daha sonra 3-4 sn için slaytları dokunun yumuşak akışı altında su yıkama.
- %0,33 iyot çözeltisi slaytlar üzerine 3-4 damla ekleyin. 1 dakika bekleyin sonra slayt musluk suyu nazik akışı altında durulayın. Dikkatle slayt Bloting kağıt tarafından kuru.
- Decolorizing çözüm % 75 izopropil alkol ve % 25 aseton bir slayda içeren 3-4 damla ekleyin. 5 – 10 s sonra slayt musluk suyu nazik akışı altında yıkayın.
- 3-4 damla (200 – 300 µL) temel carbolfuchsin çözüm ekleyin. 1 dakika bekleyin sonra slaytları musluk suyu nazik akışı altında durulayın. Bloting kağıt kullanarak slaytları kuru.
- Bir petrol-daldırma objektif lens 100 X büyütme18seçerek bir ışık mikroskop altında bakteri görselleştirin. Bağlılık kurulan WT ve mutant bakteri Vn ve HSA kaplı cam yüzeylerde karşılaştırın.
-
Bakterilerin Vn-bağımlı bağlılığı epitel hücreleri çalışma
Not: Bu verimli bağlılık tahlil bizim önceki çalışmalar4,7' kullanıldı.- Kültür A549 hücrelerinde (tip II alveoler epitel hücreleri) 75 cm2 doku kültürü şişesi ile F12 orta % 10 (vol/vol) fetal buzağı serum (FCS) (tam orta) ve 5 µg/mL gentamisin ile desteklenmiştir. 3 gün öncesine kadar % 80 birleşmesi için bir kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 şişeye kuluçkaya (confluency tahmini ters mikroskop kullanarak hücreleri tarafından yüzey kapsama görselleştirme tarafından). Aşağıdaki dört adım epitel hücreleri için tahlil19,20hazırlamak nasıl açıklar.
- İki kez PBS 20 mL ile balonun içinde hücre monolayer yumuşak swirling tarafından yıkayın. Hücreleri şişesi yüzeyinden ayırmak için hücre dekolmanı enzim çözümü 2 mL ekleyin ve şişeye 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya Şişeye plastik yüzey hücrelerin tümünü ayırmak için palmiye ile dokunun. Yukarı ve aşağı birkaç kez-pipet hücre kümeleri dağıtmak.
- Şişesi için F12 tam orta 18 mL ekleyin ve tüm hücre süspansiyon 50 mL steril Falcon tüp aktarın. Hücre süspansiyon için de RT 200 x g , 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hücre Pelet F12 tam orta 10 mL resuspend.
- Hücre süspansiyon 10 µL kaldırmak ve bir Eppendorf tüp yerleştirin, sonra 90 µL Trypan mavi çözüm ekleyin. Örnek bir hemasitometre yük (derinlik 0,1 mm) coverslip koyarak sonra.
- Alanlarda A, B, C ve D tüm hücrelerin sayısı (her alan 16 kareler oluşur ve her bir kare 0.0025 mm2lik bir alana sahiptir), hücrelerin ortalama sayısını hesaplamak ([A + B + C + D] / 4). Aşağıdaki denklemi kullanarak mililitre başına hücre sayısını hesaplar:
Geçerli hücre/mL = ortalama hücre sayısı × 104 × seyreltme faktörü20.
Not: Burada, 10 seyreltme faktörü. - 5. 0 x 103 hücre/mL tam orta içeren 5 µg/mL gentamisin kullanarak hücre süspansiyon sulandırmak. Hücre süspansiyon, 500 μL 24-şey hücre kültür plaka her kuyuya dağıtmak. Hücreleri % 90 birleşmesi kadar % 5 CO2 37 ° C'de plaka kuluçkaya.
- Bakteriyel enfeksiyon önce Orta kuyulardan kaldırın ve F12 Orta (FCS) olmadan eklemek sonra gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Plaka buz üzerinde dik yerde üç kez PBS 500 µL ile hücre monolayer yıkayın ve Vn. Incubate plaka 1 h için 4 ° C'de 10 µg/mL içeren önceden soğutulmuş F12 orta 100 µL ekleyin. Denetim kuyular için sadece F12 orta ekleyin.
- Kuluçka sonra çözüm pipetting tarafından atmak ve hücre katmanı iki kez PBS 1 mL ile dik Resuspend taze yetişkin kurulan M10 kültürünün yıkayın (adım 1.1.1) F12 Orta (2 × 108 CFU/mL). Her şey için bu bakteriyel süspansiyon, 100 µL ekleyin ve 37 ° C'de 2 h plaka kuluçkaya
Not: Her şey yaklaşık 2 x 105 A549 hücreler içerir. Enfeksiyon için 2 x 107 bakteriyel CFU ilave edilmiştir, enfeksiyon 100 çeşitliliği için karşılık gelen. - Pipetting tarafından orta kaldırmak ve A549 epitel hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. 50 µL/iyi hücre dekolmanı çözüm ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için plaka kuluçkaya
- Sonra 50 µL F12 tam orta iyi enzimatik reaksiyon durdurmak için ücret ekleyin. Epitel hücreleri (≈100 μL [yani, birimin tümü]) dört cam boncuk içeren bir 6-mL Cam tüp her kuyudan aktarın. RT, hücreleri tarafından vortexing 2 min için koşullar.
- 100-fold hücre lysate 10 µL sulandırmak için F12 orta 990 µL lysate, 10 µL ekleyerek. Bir çikolata agar plaka üzerine seyreltilmiş örnek 10 µL plaka.
- Çikolata agar plaka 37 ° C'de gecede kuluçkaya sonra kolonilerin sayımı. Her koloni bir CFU temsil eder.
- Kültür A549 hücrelerinde (tip II alveoler epitel hücreleri) 75 cm2 doku kültürü şişesi ile F12 orta % 10 (vol/vol) fetal buzağı serum (FCS) (tam orta) ve 5 µg/mL gentamisin ile desteklenmiştir. 3 gün öncesine kadar % 80 birleşmesi için bir kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 şişeye kuluçkaya (confluency tahmini ters mikroskop kullanarak hücreleri tarafından yüzey kapsama görselleştirme tarafından). Aşağıdaki dört adım epitel hücreleri için tahlil19,20hazırlamak nasıl açıklar.
3. analiz insan serumu bakterisidal etkinlik Vn-bağımlı direnç
- Satınalma NHS ticari bir kaynaktan. VDS yukarıda açıklanan12olarak hazırlayın. VDS 180 ile doldurmak nM Vn NHS içinde mevcut eşdeğerdir Vn.
- Isı inaktive serum (HIS) tarafından Isıtma NHS için 30 dk 56 ° C'de kompleman proteinleri devre dışı bırakabilirsiniz için hazırlayın.
Not: Optimum serum konsantrasyonu (% 5) ve kuluçka süresi (15 dk) açıklanan adımları 3.3-3.7 tahlil için kurulan15için ampirik olarak belirlenmiştir; bu parametreler için diğer bakteriyel patojenler değişebilir. - Kültür bakteriler (Bu durumda, kurulan M10 ve mutant kurulan M10Δlph) orta log fazı (OD600 0,3 =). Santrifüjü 3.500 x g 10 dk de tarafından bakteri cips.
- Bakteriyel Pelet Dekstroz Jelatin ilacı arabellek (DGVB++; pH 7.3) içeren % 2.5 (w/v) glikoz, 2 mM MgCl2, 0.15 mM CaCl2ve % 0.1 (wt/vol) jelatin 1 hacmi ile resuspend.
- 1.5 x 10 Ekle3 CFU bakteri DGVB++ 100 µL için %5 serum içeren (NHS, onun, VDS, veya VDS + 180 nM Vn). 300 devir / dakikada sallayarak ile örnek 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
- 10 µL aliquot 0 dk (T0 örnek) ve 15 dk (Tt örnek) ve çikolata agar tabağa tepki karisimin kaldırın. 37 ° C'de plaka gecede kuluçkaya.
- Kuluçka sonra plaka üzerinde görünen koloniler sayılır. Bakteri yüzdesi öldürdü12 aşağıdaki eşitliği kullanarak hesaplar: (CFU Tt)/ (T0, CFU) × 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VN-bağlama bakteri yüzeyine Akış Sitometresi tarafından tespit edilmiştir. Tüm kurulan klinik yalıtır Bu çalışmada test Vn hücre yüzeyine işe. Vn etkileşimi ile hücre yüzeyine E. coli negatif kontrol zorlanma (Şekil 1A) gözlenmiştir. Şekil 1' deBgösterildiği gibi PH kurulan hücre yüzeyinde büyük Vn-bağlayıcı protein olur. Oysa kurulan M10Δlph Vn bağlanamadı ve denetimine benzer ortaya çıktı Vn WT kurulan zorlanma tarafından bağlama M10 bir kayma kalabalıkta, neden oldu.
PH ve Vn arasındaki protein-protein etkileşimler ELISA ve BLI tahmin edilmiştir. Rekombinant PH insan faktörü H, Vn ve C4BP ile bağlamak için izin verilen (negatif kontrol) kaplı microtiter kuyu ELISA plakaları. Bağlı PH tahmin kullanarak bir anti-O'nun pAbs. Sonuçlar açıkça PH ve Vn ve faktör H, C4BP ile karşılaştırıldığında arasında önemli bir etkileşim belirtilen (Şekil 2A). PH ve Vn arasındaki etkileşim gerçek zamanlı olarak BLI kullanarak tahmin. Resim 2 B PH bağlama yanıt eğrileri Vn kaplı algılayıcı yüzeyine gösterir. Benzeşme bağlama (Bu durumda, Kd = 2,2 µM) veri için kararlı durum bağlama kinetik yaklaştırarak tahmin edildi.
PH ifade sergilenen hücre yüzeyinde (kurulan M10Δlph) eksik bakteri Vn kaplı cam yüzeyler ile karşılaştırıldığında WT hücreleri (Şekil 3A) bağlılığı azalır. Buna ek olarak, Vn varlığı epitel hücrelerinin yüzeyinde kurulan (Şekil 3B) bağlılık önemli ölçüde geliştirilmiş. Bu sonuçlar PH-Vn etkileşim önemli bakteriyel bağlılık bulunmuştur belirtti.
VN iyi bilinen tamamlayıcı inhibitörü olduğunu. Tamamlayıcı inhibe aktivite tahmin etmek için serum-aracılı öldürme huzurunda incelenmiş ve devamsızlık Vn. WT kurulan hücre M10Δlph mutant hücreleri daha yüksek serum direniş sergiledi. Hiçbir bakteri onun (Şekil 4varlığındaA) öldürüldü. İlginçtir, WT kurulan VDS azaltılmış hayatta kalma sergilendi ve ikmal Vn bakteriyel hayatta kalma arttı. Ancak, bu değil işe Vn hücre yüzeyine (Şekil 4B) çünkü kurulan M10Δlph zorlanma Vn tükenmesi için yanıt vermedi. Bu sonuçlar açıkça Vn bakteri kompleman aracılı öldürme (Şekil 4A-B) dan korur bir önemli ana etken olduğunu gösteriyor.
Resim 1 : Haemophilus influenzae serotip f Vn PH. yüzey ifade ile bağlar (A)akış sitometresi sonuçları Vn bağlama için kurulan klinik yalıtır hücrelerinin gösterilen. Her klinik izole (5 x 106 CFU) Vn. bağlı ligand bir koyun anti-Vn pAbs ve eşek FITC Birleşik Anti-koyun ikincil antikorları kullanarak algılandı 250 nM insan ile inkübe. Escherichia coli Bl21 (DE3) bir negatif kontrol dahil. Üç ayrı deneyler ve hata çubukları onaylatılacak analizleri üzerinden ortalama floresans yoğunluk temsil gibi SD (B) akış sitometresi histogramlar Vn bağlama WT kurulan M10 ve PH-silme kurulan M10Δ yüzeyine gösteren veri sunulmaktadır LPH mutant. Üç ayrı deneyler birinin temsilcisi veri gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Rekombinant PH bağlar için Vn. (A) ELISA sonuçları rekombinant PH Vn, FH ve C4BP bağlama gösteren. C4BP bir negatif kontrol kullanılan, ancak FH olumlu bir denetim olarak kullanıldı. Protein-protein etkileşimleri analiz etmek için Vn, FH ve C4BP içinde ekimolar kaplı (50 nM) kuyuları üzerine konsantrasyonları microtiter plakaları. Daha sonra 50 nM rekombinant PH-His6x eklendi. Bağlı PH bir HRP Birleşik kullanarak Anti-O'nun pAbs algılandı. Gösterilen veriler çoğu üç bağımsız deneyler üzerinden onaylatılacak analizleri araçlarının ve hata Çubuklarõn SD ***, P≤0.001. (B) BLIanalysis PH bağlama için Vn: AR2G sensörleri ve PH bağlama kinetik rekombinant Vn immobilize (0.25-4 µM) için Vn BLI enstrüman kullanarak kaydedildi. Denge benzeşme sabit denge her konsantrasyonu için elde edilen sinyallerini kullanarak hesaplanır ve verileri kararlı durum kinetik göre monte edildi. Deneme üç kez tekrarlandı ve temsil eden veri kümesi gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : PH ve Vn arasındaki etkileşimi cam yüzeyler ve epitel hücreleri bakteri bağlılık geliştirir. Kurulan bağlılık Vn kaplı cam slaytlara gösterilen(a)ışık mikroskobik görüntüler. Bakteri görselleştirildiği Gram boyama tarafından. Üç bağımsız deneyler birinin temsilcisi görüntüleri gösterilir. Bu panel ve İmmünoloji günlük7 ' daha önce yayınlanan Amerikan Derneği Immunologists izniyle burada çoğaltılabilir. (B) bağlılık WT kurulan M10, hücreleri A549 epitel hücrelere Vn de, üç bağımsız deneyler üzerinden onaylatılacak analizleri araçlarının çizilen ve hata çubukları temsil SD *, p ≤0.05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Kurulan hücre yüzeyine işe Vn korur bakteri serum-aracılı öldürme. (A)WT kurulan M10 ve mutant kurulan M10Δlph %5 NHS veya onun 15 dakika inkübe. (B) direnç kurulan M10 ve kurulan M10Δlph için bakteri yok edici etkileri % 5 VDS ve 250 nM saf Vn. veri temsil anlamına gelir üç bağımsız deneyler üzerinden onaylatılacak analizleri ile takıma VDS ve hata Çubuklarõn SD ***, p ≤0.001; NS, önemli değil. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriyel patojenler Vn hücre yüzeyine için recruit ve kompleman faktörler birikimi ve membran saldırı karmaşık2tamamlanmasını önlemek için bu tamamlayıcı regülatör kullanmaktadır. VN aynı zamanda bakteri yüzey proteinleri ve konak hücre yüzey reseptörlerinin, arasında bir köprü molekül olarak böylece patojenler epitel hücrelerinin yüzeyine uygun ve daha sonra içselleştirilmesi arabuluculuk etkinleştirme çalışır. Bu çalışmada serum direnci ve enhancement-in sağlanmasında Vn i) bağlama bakteri hücreleri, II) protein-protein etkileşimleri ve benzeşme sabitler yüzeyi ve III) Vn işlevsel rolü için tahmin etmek için kullanılan protokolleri açıklamak Konak hücre yüzeyine yapışma.
Akış Sitometresi bakteri Vn bağlamak doğrulamak için yaygın olarak kullanılan nicel bir tekniktir. Vn-bağlama kapasitesi (ve çeşitli reseptörleri) bağlı olarak bakteriyel türler farklı olabilir olarak ancak, Vn konsantrasyon, optimize edilmiş olması gerekir. Burada açıklanan assay olarak, 1-100 µg/mL Vn doğrusal bağlama ve doygunluk parametrelerini tahmin etmek için kullanılmıştır. WT kurulan bağlama kalıpları, kurulan M10Δlph mutant ve negatif kontrol E. coli hücreleri gösterdi açık bir fark 20 µg/mL Vn konsantrasyonu (250 nM). Bu nedenle, bu konsantrasyon tüm akış sitometresi deneylerde kullanılıyordu. Vn kullanımı doygunluk noktasına yukarıda konsantrasyonlarda yanlış sinyalleri üretmek olabilir. Birincil ve ikincil antikorların seyreltme da ayrı ayrı her patojen için optimize edilmiş olması gerekir. İyi sinyal gösterilen antikorlar maksimum seyreltme seçilmelidir. Bu çalışmada, % 2.5 BSA engelleme bir ajan olarak kullanılır. Ancak, BSA evrensel engelleme reaktif tüm patojenler için uygun değildir. BSA nonspesifik antikor etkileşimleri engellemez durumlarda diğer engelleme reaktifler, balık jelatin gibi kullanılabilir. Vn bağlama bakteriyel pathogen hücre yüzeyine kez birden fazla reseptörleri21,22tarafından aracılık ettiği. Oysa diğerleri düşük bağlama benzeşme sergileyebilirler bazı reseptörleri yüksek Vn-bağlama ilgi olması. Böylece, tek bir gen bir yüzey protein kodlama silinmesi akış sitometresi tarafından değerlendirildi Vn etkileşimleri azalmasına neden olabilir değil. Akış Sitometresi alternatif, bakteri hücre yüzeyinde protein bağlayıcı bir ayirt tahlil (IFA) veya iletim elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak incelenebilir. Photobleaching fluororeagent Birleşik antikorların akış sitometresi ve IFAs sorunlu olmasına rağmen TEM eserler23,24tanıtılması önemli risk ile hantal numune hazırlama içerir. Akış Sitometresi Analizi IFA ve TEM gerçekten basit örnek hazırlama protokolleri ve kısa bir zaman çerçevesi içinde pek çok örnekleri test olasılığı nedeniyle iyidir.
Protein-protein etkileşimlerinin bir hücre ücretsiz sisteminde ELISA (Şekil 2A) tarafından analiz ve saçınıza (Şekil 2B). Her iki bu teknikleri, bağlama ortaklarından biri, bir biyoalgılayıcı (için BLI) veya bir microtiter tabak (ELISA) immobilize. Avantajı BLI ve ELISA etkin bağlama site dışındaki spesifik olmayan etkileşimleri engelleme protein-protein etkileşimler içinde onların yerli durum analizini etkinleştirmek var. BLI, yarar ancak, immobilizasyon tekniği kullanılan bağlı olarak sınırlı olabilir. Burada rastgele kullanılan yordam kaplin amin herhangi bir yüzey maruz amin grubu protein ve biyoalgılayıcı yüzey arasındaki bir Amid bağı oluşturur. Çeşitli yönleri sensör yüzeyinde protein moleküllerinin immobilizasyon sonuçlanır. Bu bir 1:1 bağlama kinetik modelini uymuyor heterojen bağlamasında neden olabilir. Biotin sensörler seçip immobilize için Rekombinant protein streptavidin etiket ekleme potansiyel bu sorun çözülebilir. Saçınıza güvenilirliğini yüzey plasmon rezonans (SPR) için benzer. Dernek ve ayrılma moleküllerin gerçek zamanlı olarak her iki tekniği kullanılarak ölçülebilir. Ancak, alma aygıtı Havacilik kullanmaz ve bu nedenle bakımı kolaydır. Bir defada yalnızca dört örnekleri SPR. kullanarak test edilebilir, ancak buna ek olarak, 96 etkileşimler aynı anda BLI test edilebilir Optimize edilmiş olması gerekir BLI başka bir önemli adım vardır. Sensörler tekrar kullanılırsa bu her protein-protein kompleksi değişebilir gibi rejenerasyon koşulları da, optimize edilmelidir. Bu çalışmada, 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit sensör rejenerasyon için uygun bulundu.
Vn rol bakteriyel uyum içinde Vn ile kaplı cam yüzeyler kullanılarak doğrudan test edildi. Bu yaklaşım bağlama bakteriyel herhangi bir patojen için analiz etmek için istihdam edilebilir hem gram-negatif - pozitif bakteriler dahil. Bu bağlama için bir patojen'ın kapasite hızlı değerlendirmesi için Vn sağlar semiquantitative bir tekniktir. Makul sonuçlar elde etmek için Vn kaplama optimize edilmiş olması gerekir. Burada açıklanan yöntemi, 1, 2 ve 5 µg/mL Vn ile kaplama incelenmiş ve 2 µg/mL (Şekil 3A) Bu çalışmada yürütülen deneyler için en uygun toplama bulundu. Aşırı Vn kaplı yüzey üzerinde kolayca tespit ve boyama örnek sırasında çıkardı kalın bir tabaka oluşturabilirsiniz. Ayrıca, bakteriyel kültür hücrelerinin büyük kümeleri olmamalıdır; Bu olabilir bir aliquot slaytlara eklemeden önce kültür vortexing tarafından kaçınılmalıdır.
Yüzey epitel hücrelerinin bakteriyel bağlılık bir plaka sayısı tekniği (Şekil 3A) kullanılarak incelenmiştir. Bu tahlil de dikkatle gözlem Vn rolünün bakteriyel bağlılık içinde etkinleştirmek için optimize edilmiş olması gerekir. VN vardır (, C-terminus) bakteriler için farklı bağlayıcı siteleri ve yüzey integrin reseptörleri (sitesinde N-terminal RGD bağlama) hücre. Vn bağlama integrinler için sinyal ve integrin-Vn karmaşık1alımını neden olmaktadır. Eğer böyle kompleksleri bakteri içselleştirilmiş, sonuçları yorumlamak zordur. Bu nedenle, Vn epitel hücre monolayer 4 ° C'de eklemeniz gerekir VN integrin reseptörleri epitel hücre yüzeyinde doymuş olan bir kez ücretsiz Vn bakteriyel Vn-bağımlı integrin bağlama engelleyebilir gibi aşırı Vn, yıkanmalıdır. Bu tahlil, toplam bakteri sayar epitel hücreleri ile ilişkili tahmini (yani, oluşan eşleştirmeyi yüzey bağlı ve içselleştirilmiş bakteri). Bu tahlil, tedavi gentamisin4tarafından dış ve hücre içi bakteriyel nüfus arasında ayırt etmek için genişletilebilir.
Burada açıklanan protokolünde kullanılan serum bakterisidal tahlil kısmen daha önce yayımlanmış yordamı12,22güncellenmiştir. Assay olarak burada, 1.5 x 103 CFUs kurulan %5 NHS için 15 dk, 5 dk önceden açıklanan tahlil (Şekil 4A) daha uzun ile inkübe açıklanan. WT kurulan ve PH yoksun isogenic mutant arasındaki farkı 10 dk 15 dk daha belirgin. Bu nedenle, biz 15 dk kuluçka süresi belirli bu deneme için seçildi. Serum bakteri yok edici etkileri serum konsantrasyonu, kuluçka ve bakteri sayısı zaman bağlıdır. Tüm patojenler serum bakterisidal etkinlik önlemek için önemli bir kapasite sergilemek; Diğerleri orta dayanıklı veya hassas olabilir, ancak bazı patojenlerin tamamen serum için dayanıklı olabilir. Serum konsantrasyonu bu nedenle incelendiğinde her belirli patojen için optimize edilmiş olması gerekir. Yine de, serum gram-pozitif hücreler1,5önemli bakteri yok edici etkisi yoktur beri burada açıklanan tahlil öldürme serum Ayagin Gram-negatif bakteriler, çalışma odasına sınırlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir maddi çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu eser hibe Anna Vakfı ve Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. ve Edla Johansson Vakfı, İsveçli Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir (sayı K2015-57 X-03163-43-4, vermek www.vr.se), kanser Vakfı Üniversitesi'nde Malmö, Physiographical toplum (Forssman'ın Vakfı) ve Skåne County Konseyi araştırma ve Geliştirme Vakfı hastanede.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
