Summary
В настоящем докладе описываются протоколы для характеризующие взаимодействия между бактериальной внешней мембранных белков и vitronectin регулятор человека дополнением. Протоколы могут использоваться для изучения реакции связывания и биологические функции vitronectin в любых бактериальных видов.
Abstract
Бактерии использовать дополнение регуляторы в качестве средства уклонения от иммунного ответа. Здесь мы описываем протоколы для оценки роли vitronectin приобретения в бактериальной клетке поверхности играет в сопротивление иммунной системы. Потока цитометрии эксперименты определены человеческой плазмы vitronectin как лиганд для белка наружной мембраны бактерий рецептор H Haemophilus influenzae типа f. Энзим соединенный assay иммуносорбента был нанят характеризовать белок белковых взаимодействий между очищенной рекомбинантных белков H и vitronectin, и обязательного соответствия была оценена с помощью био слоя интерферометрии. Биологическое значение привязки vitronectin белка H на поверхности бактериальных клеток в уклонение иммунного ответа было подтверждено с помощью пробирного сопротивления сыворотки с нормальным и vitronectin истощены человеческой сыворотки. Значение vitronectin в бактериальных присоединения был проанализирован с использованием стекла слайды с и без vitronectin покрытия, следуют грамм пятная. Наконец бактериальной адгезии клеток человека альвеолярного эпителия монослои было расследовано. Протоколы, описанные здесь может быть легко адаптирована к изучению любых бактериальных видов интерес.
Introduction
Vitronectin (Vn) является важным человека гликопротеин, участвующих в поддержании гомеостаза через регулирование фибринолитической системы. VN также функционирует как дополнение регулятор, подавляя терминала дополнением путь во время C5b6-7 комплекс формирования и C9 полимеризации. Было показано несколько бактериальных патогенов набирать Vn на поверхности клеток как средство противодействия дополнением осаждения1,2,3. Кроме того Vn функционирует как «сэндвич» молекула между бактериями и принимающих рецепторы эпителиальных клеток, способствуя присоединению и интернализации патогенов2,4,5. Связывание Vn к поверхности бактериальной клетки при посредничестве других в настоящее время неопознанные белков. Полностью определить функциональную роль Vn привязки в уклонение шланг иммунного ответа поэтому потребует идентификации Vn Рекрутинг белков.
Первым шагом в выявлении Vn связывающих белков является для тестирования ли возбудитель интереса можно привязать очищенный В.н. проточной цитометрии удобный и простой метод, чтобы определить, привязан ли Vn возбудителя клетки. В этом исследовании мы оценивали привязки Vn различных клинических изолятов Haemophilus influenzae типа f (Hif)6. Метод, описанный здесь количественных и может использоваться для различения связывающая способность широкого спектра бактериальных штаммов. В предыдущем исследовании мы охарактеризовал белка H (рН) Hif как Vn связывания белка7. Таким образом в настоящем исследовании, Vn привязки потенциал одичал тип (WT) Hif и Hif M10ΔЛПХ мутанты были сопоставлены с использованием описанных протоколов.
После того, как выясняется, что возбудитель связывает Vn, второй шаг должен характеризовать поверхности протеома с целью выявления потенциальных Vn связывающих белков. Различные подходы могут быть использованы для этой цели8,9, но эти методологии не описаны в настоящем докладе. Метод, наиболее подходящий для изучения взаимодействия протеин протеина является recombinantly выразить выбранный бактериальных белков на поверхности в E. coli и очищают хромотографией сродства. Здесь мы используем PH и ее молекулярного взаимодействия с Vn проиллюстрировать метод. Взаимодействие между рекомбинантных PH и ВН были охарактеризованы с помощью иммуноферментного анализа (ИФА)7 и недавно разработанных лейбл свободный метод, известный как био слоя интерферометрии (BLI)10,11. В то время как ELISAs может использоваться для подтверждения белок белковых взаимодействий, BLI предоставляет подробные данные относительно кинетические параметры взаимодействия.
Для изучения функциональной роли Vn бактериальных соблюдения, могут быть использованы два разных анализов. Первая проба, описанные здесь является прямое измерение бактериальной присоединения к Vn покрытием стеклянных поверхностей, в то время как второй assay рассматривает присоединение к поверхности эпителиальных клеток. Для первого assay стекло слайды были покрыты Vn, и связывание WT или мутантных штаммов Hif оценивали по Граму и микроскопии. Этот метод легко различает бактерии, основанный на способности связать Vn12. Бактериальной адгезии клеток млекопитающих затем анализируется путем добавления искусственного бактерий на монослое типа II альвеолярных клеток эпителия; Бактериальные вложение оценивалась путем подсчета количества формирования колонии единиц (CFUs). Соблюдаться и интернализированных бактерии могут быть выделены в наличие или отсутствие Vn4,13.
Роль Vn приобретения в бактериальных сыворотки сопротивление было оцениваются с помощью пробирного убийство сыворотки (то есть, бактерицидную активность сыворотки). Чтобы оценить значение Vn приобретения в сыворотке сопротивления, бактерицидная активность сыворотки, Vn истощены (VDS) был по сравнению с нормальной человеческой сыворотки (NHS). Метод, используемый легко отличает Vn привязки против обязательной бактерий на основе сыворотки сопротивления. Мы использовали этот метод для изучения роли Vn в сыворотке сопротивление ряда бактериальных патогенов4,12.
Были зарегистрированы многочисленные методы для изучения взаимодействия хост патогена. Здесь мы описывают набор протоколов, которые могут быть легко адаптированы к изучению любых возбудитель для того, чтобы оценить роль в патогенезе Vn. Мы проверили эти протоколы, используя различные патогенные микроорганизмы, и Hif была выбрана в качестве примера для этого отчета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. анализ Vn как лиганд бактериального белка на поверхности
-
Обнаружение Vn-привязки на поверхности бактерий с помощью проточной цитометрии
Примечание: В проточной цитометрии, мы использовали стороны точечной и вперед разброс для ворот позитивные события. Для изучения взаимодействия с Vn, Hif клинических изолятов (n = 10)7 были выбраны вместе с е. coli BL21 (DE3) как отрицательный контроль (рис. 1А).- Культура Hif клинических изолятов в мозг сердце среднего инфузии (BHI) дополнена NAD 10 мкг/мл и гемин при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин. Используйте Лурия-Бертани среднего для культуры е. coli14. Урожай Hif на этапе среднего журнала (OD600 = 0,3)15и Ресуспензируйте бактерий в фосфат амортизированное saline (PBS), рН 7,2, содержащей 1% (w/v), бычьим сывороточным альбумином (БСА) (блокирующий буфер; PBS-BSA). Настройка подвески 109 кое/мл.
- Передача аликвоты, содержащие 5 х 106 кое по 5 мл, полистирола раунд нижней трубы (12 x 75 мм2) и добавьте 1 mL блокировки буфера. Центрифуга подвеска на 3500 × g при комнатной температуре (RT)16 5 мин для пеллет бактерий, а затем тщательно удалить чтобы удалить супернатант не нарушая гранулы.
- Ресуспензируйте бактериальных окатышей с 50 мкл блокирующий буфер, содержащий 250 Нм Vn и Проинкубируйте образцы для 1 h на RT без встряхивания. После инкубации Пелле бактерии центрифугированием в 3500 x g 5 минут, а затем вымыть окатышей, три раза с использованием PBS и аналогичные шаги центрифугирования.
- Для бактериальных Пелле добавьте 50 мкл первичных овец античеловеческие Vn поликлональных антител (пабы) в разведении 1: 100 в PBS-BSA. Инкубировать подвеска для 1 h на RT, а затем промойте бактерий в три раза с PBS удалить несвязанные антитела (как описано в шаге 1.1.3).
- Затем добавьте 50 мкл PBS-BSA, содержащий флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-конъюгированных осла анти овец пабы (разбавления 1: 100) и Инкубируйте на RT 1 h в темноте.
- Подготовьте пустой элемент управления путем инкубации бактерий с блокировкой только буфера и пабы без Vn.
- Промойте бактерий в три раза с 1 мл раствора блокировки буфера и Пелле подвеска центрифугированием, как описано в разделе 1.1.2. Наконец Ресуспензируйте бактериальных лепешка с 300 мкл PBS и анализировать поток цитометрии7.
-
ИФА анализ взаимодействия между рекомбинантных PH и ВН
Примечание: Элементы управления должны быть включены для исключения неспецифического связывания. Человеческий фактор H (FH) или C4b-связывания белка (C4BP) используются в качестве положительной и отрицательной контроля, соответственно.- Развести каждого человека белков (Vn, FH и C4BP) отдельно до 50 Нм в Tris-HCl, рН 9,0 (покрытие буфера). Отказаться от 100 мкл раствора белка в каждой скважине плиты микротитровальных Polysorp. Закройте пластины с крышкой и хранить при 4 ° C на ночь (16 h) для облегчения иммобилизации белков на микротитровальных тарелка скважин.
- Отменить решение от микротитровальных пластины, наклоняя вниз над раковиной и Промыть лунки три раза с 300 мкл PBS/хорошо. Блокировать покрытием скважин на 1 ч на RT с PBS, содержащие 2,5% (w/v) BSA (PBS-BSA).
- После удаления блокировки решение, промойте скважин три раза с 300 мкл PBS, содержащие 0,05% (v/v) анимации 20 (PBST) за хорошо. 100 мкл 50 Нм рекомбинантного его меткой PH для каждого образца хорошо и инкубировать 1 час на RT. В скважинах управления только 100 мкл PBS-BSA.
Примечание: Ген ЛПХ , кодирование PH от Hif усиливается ПЦР и клонирован в вектор выражения pET26b, который добавляет 6 × его тег в C-terminus выраженной белка. Рекомбинатные вектор был преобразован в E. coli BL21(DE3) для выражения. Ni-НТА смола используется для очистки рекомбинантных белков15. - Отменить решение белка и удалите unbound протеины, промывки скважин три раза с 300 мкл PBST за хорошо. 100 мкл PBS-BSA содержащие пероксидазы (ПХ)-конъюгированных против его пабы (1:10, 000 разрежения) и инкубировать 1 час на RT.
- Готовят раствор 20 мм A путем растворения тетраметилбензидина в раствор 5% ацетона и 45% метанола. Подготовить раствор B, распустить 19,2 г лимонной кислоты в 1000 мл, H2O, регулировка рН до 4.25, добавив Кох, затем 230 мкл 30% H2O2. Хранить оба решения в темноте на RT. Непосредственно перед использованием Смешайте 500 мкл раствора B с 9,5 мл раствора A подготовить ELISA обнаружения реагента.
- Промыть лунки три раза с 300 мкл PBST за хорошо и выявления комплексов антиген антитела, добавив 100 мкл Реагента ELISA обнаружения для каждой скважины.
- Добавьте 50 мкл 1 М H2так4/well чтобы остановить реакции. Измерение оптической плотности скважин на 450 Нм, используя Считыватель микропланшетов.
-
Исследование кинетики взаимодействия рекомбинантных PH и Vn, используя BLI
- Иммобилизации человека Vn Амин реактивной датчиков с помощью аминов, муфты метод, по словам производителя рекомендации11.
- С помощью PBS, серийно разбавить лиганда (рекомбинантной PH) от 0 до 4 мкм и передать результирующее решения 96-луночных черный, с плоским дном микротитровальных плиту. Запустите эксперимент при 30 ° C, с помощью инструмента BLI17.
- Загрузите папку данных в программное обеспечение для анализа данных BLI. Выберите параметр «Выбор датчика» . Затем, выберите «ссылка хорошо» (Vn покрытием датчик в PBS) для вычитания.
- Выберите «Выровнять оси y базовой линии» и «interstep коррекции и выровнять ассоциации». Пресс «данных процесса», который будет автоматически открывать вкладку анализ.
- На вкладке Анализ выберите параметр «ассоциации и диссоциация» под кривой. Выберите модель ' 1:1 привязки и глобальные установки '. Нажмите «подходят кривой» и установку данных17экспорта.
2. характеристика роли Vn в бактериальных присоединения
-
Исследование бактериальных присоединения к Vn покрытием стеклянных поверхностей
- Подготовьте раствор 2 мкг/мл в PBS и пипетки 10 мкл этого решения на стекло микроскопа слайд как одна капля Vn. Разрешить падение сушиться на слайде 30 мин на RT. пальто слайд с человеческого сывороточного альбумина (HSA) как отрицательный контроль.
- Вымойте белка покрытием стекла слайды три раза путем окунать слайды на две секунды в стакан, содержащие PBS для удаления избыточного немелованной белка. Добавить 20 мл свежего Hif культуры (описано в шаге 1.1.1) в стерильных пластиковых Петри и погрузите Vn- / покрытием HSA стеклышки в среде культуры. Инкубируйте блюда при 37 ° C в течение 1 ч при встряхивании в 20 об/мин.
Примечание: Hif M10 и Hif M10ΔЛПХ были выращены в жидкой среде BHI или на шоколадный агар пластины. Средство для ЛПХ мутант был дополнен 10 мкг/мл канамицин15. - После инкубации удалите любые свободные бактерии, погрузив слайды три раза в стакан, наполненный PBS. Визуализация бактерии с грамм пятная, как описано.
- Удалите избыток PBS из каждого слайда, наклоняя его и трогательно края на папиросной бумаги. Просушите слайды для 3-5 мин на RT и исправить придерживался бактерий, передавая каждый слайд три раза на огне.
- Держите слайд за края двумя пальцами на окрашивание лоток, а затем добавить 3-4 капли (200 – 300 мкл) фиолетовый кристалл 2,3% раствора. Подождите 60 s, а затем вымыть слайды под нежный поток водопроводной воды для 3-4 s.
- Добавьте 3-4 капли раствора йода 0,33% на слайды. Подождите 1 мин, затем ополосните слайд под нежным струей водопроводной воды. Тщательно высушите слайды на промокательной бумаги.
- Добавьте 3-4 капли обесцвечивания раствора, содержащего 75% изопропиловый спирт и 25% ацетона на слайд. После 5-10 сек Вымойте слайд под нежным струей водопроводной воды.
- Добавьте 3-4 капли (200 – 300 мкл) основных carbolfuchsin раствора. Подождите 1 мин, затем ополосните слайды под нежным струей водопроводной воды. Сухие слайды с помощью промокательной бумаги.
- Визуализируйте бактерий под микроскопом света, при выборе объектива нефти погружение на 100 X увеличение18. Сравните присоединения Hif WT и мутантов бактерий на поверхности стекла Vn - и HSA покрытием.
-
Изучение Vn-зависит от приверженности эпителиальных клеток бактерий
Примечание: Этот assay эффективного соблюдения был использован в наших предыдущих исследований4,7.- Культура A549 клетки (тип II альвеолярные клетки эпителия) в 75-cm2 культуры ткани колба с F12 среднего дополнена 10% плода теленка (vol/vol) сыворотки (FCS) (полная средний) и 5 мкг/мл гентамицина. Инкубируйте 3 дней до 80% притока колбу в инкубаторе с 5% CO2 при 37 ° C (confluency может быть оценена путем визуализации поверхности покрытия с помощью инвертированного микроскопа клетки). Следующие четыре шага описывается, как подготовить эпителиальных клеток для пробирного19,20.
- Вымойте монослое клеток в колбу дважды с 20 мл PBS, нежный закрученной. Чтобы отсоединить клетки с поверхности колбы, добавить 2 мл раствора фермента отряд клеток и инкубировать Фляга для 5 минут при 37 ° C. Нажмите колбу с вашей ладони, чтобы отсоединить все клетки с поверхности пластика. Пипетка вверх и вниз несколько раз чтобы разгонять скопления клеток.
- Добавить 18 мл F12 полной среды в колбу и передать всю ячейку подвеска 50 мл стерильной пробирке Falcon. Центрифуга суспензию клеток для 5 минут при 200 x g в RT и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл полные средства F12.
- Удаление 10 мкл суспензии клеток и поместите его в пробирку Эппендорф, затем 90 мкл раствора Трипановый синий. Загрузить образец в Горяева (глубина 0,1 мм) после размещения coverslip.
- Подсчет всех жизнеспособных клеток в областях A, B, C и D (каждое поле состоит из 16 квадратов, и каждая площадь имеет площадь 0,0025 мм2), затем вычислить среднее количество клеток ([A + B + C + D] / 4). Рассчитайте количество клеток на миллилитр, используя следующее уравнение:
Жизнеспособных клеток/мл = средний клеток фото × 104 × разрежения фактор20.
Примечание: Здесь, коэффициент разрежения составляет 10. - Разбавления суспензии клеток до 5,0 x 103 клеток/мл, используя полный средних содержащего гентамицин 5 мкг/мл. Отказаться от 500 мкл суспензии клеток в каждой скважине плиты культуры клеток 24-хорошо. Инкубируйте пластины при 37 ° C в 5% CO2 , до тех пор, пока клетки являются 90% притока.
- До бактериальной инфекции удалите средство из скважин и F12 среднего (без FCS), затем Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
- Вымойте монослое клеток три раза с 500 мкл PBS на RT. место пластину на льду и 100 мкл предварительно охлажденные средства F12, содержащие 10 мкг/мл В.н. инкубировать пластины на 4 ° C на 1 ч. Для контроля скважин добавьте только F12 среднего.
- После инкубации, отказаться от решения, закупорить и мыть слоя клеток дважды с 1 мл раствора PBS на RT. Ресуспензируйте культуры свежезаваренным выращенных Hif M10 (шаг 1.1.1) в F12 (2 × 108 кое/мл). 100 мкл этой бактериальных подвеска для каждой скважины и инкубировать пластину для 2 ч при 37 ° C.
Примечание: Каждый хорошо содержит приблизительно 2 x 105 A549 клетки. Для инфекции, 2 x 107 бактериальных CFU были добавлены, соответствующий к разносторонности инфекции 100. - Удалите носитель, закупорить и мыть A549 эпителиальных клеток в три раза с PBS. Добавьте 50 мкл/хорошо мобильный отряд решения и инкубировать пластину для 5 минут при 37 ° C.
- Добавьте 50 мкл F12 полного среднего за хорошо чтобы остановить ферментативной реакции. Передать эпителиальных клеток (≈100 мкл [то есть, весь объем]) от каждой скважины 6-mL стеклянная трубка, содержащая четыре стеклянных бусин. Лизируйте клетки на RT, vortexing на 2 мин.
- 100 раз разбавлять 10 мкл lysate клетки путем добавления 10 мкл lysate 990 мкл средства F12. Пластина 10 мкл разбавленного образца на шоколадный агар пластину.
- Инкубировать шоколадный агар пластины при 37 ° C на ночь, а затем подсчитать колоний. Каждая колония представляет один кое.
- Культура A549 клетки (тип II альвеолярные клетки эпителия) в 75-cm2 культуры ткани колба с F12 среднего дополнена 10% плода теленка (vol/vol) сыворотки (FCS) (полная средний) и 5 мкг/мл гентамицина. Инкубируйте 3 дней до 80% притока колбу в инкубаторе с 5% CO2 при 37 ° C (confluency может быть оценена путем визуализации поверхности покрытия с помощью инвертированного микроскопа клетки). Следующие четыре шага описывается, как подготовить эпителиальных клеток для пробирного19,20.
3. анализ Vn-зависит от сопротивления бактерицидную активность сыворотки крови человека
- Покупка ГСЗ из коммерческих источников. Как было описано выше12Подготовьте VDS. Пополнять ДСТС с 180 Нм Vn, что эквивалентно Vn, присутствующих в ГСЗ.
- Подготовка тепло инактивированная сыворотки (HIS) путем нагревать ГСЗ в 56 ° C за 30 мин для инактивации белков комплемента.
Примечание: Hif15эмпирически определены оптимальные сывороточной концентрации (5%) и время инкубации (15 мин) для assay, описанные в шагах 3.3 – 3,7; эти параметры могут различаться для других бактериальных патогенов. - Культуры бактерий (в данном случае, Hif M10 и мутанта Hif M10ΔЛПХ) к середине журнала фазы (OD600 = 0,3). Пелле бактерий центрифугированием в 3500 x g за 10 мин.
- Ресуспензируйте бактериальных лепешка с 1 объем декстрозы желатин Veronal буфера (DGVB++; рН 7.3) содержащий 2,5% (w/v) глюкозы, 2 мм MgCl2, 0,15 мм CaCl2и 0,1% (wt/vol) желатина.
- Добавить 1,5 х 103 CFU бактерий до 100 мкл DGVB++ , содержащая 5% сыворотки (NHS, его, VDS, или VDS + 180 Нм Vn). Инкубируйте образца при 37 ° C 15 мин с встряхивания на 300 об/мин.
- Удаление 10 мкл аликвота из реакционной смеси на 0 мин (T0 образец) и 15 мин (Tt образец) и пластины на шоколадный агар. Инкубируйте пластины при 37 ° C на ночь.
- После инкубации счетчик колоний, появляясь на плите. Рассчитать процент бактерий убиты12 , используя следующее уравнение: (CFU на Tt) / (CFU T0) × 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VN привязки к поверхности бактерий определяется проточной цитометрии. Все Hif клинических изолятов испытания в этом исследовании набраны Vn на поверхности клеток. Не взаимодействие Vn с поверхности клеток наблюдалось отрицательного контроля штамм E. coli (рис. 1A). Как показано на рисунке 1B, рН является основным Vn связывающий белок на поверхности клеток Hif. Связывание Vn, штамм WT Hif M10 вызвало сдвиг в популяции, тогда как Hif M10ΔЛПХ не связывать Vn и появился похож на элемент управления.
Белок белковых взаимодействий между PH и Vn оценивались по ELISA и BLI. Рекомбинатные PH было разрешено связываться с человеческий фактор H, Vn и C4BP (отрицательный контроль) покрытием на скважинах микротитровальных ELISA пластины. Связанные PH оценивалась с использованием анти его пабы. Результаты четко показали значительное взаимодействие между PH и ВН и фактор H, по сравнению с C4BP(рис. 2). Взаимодействие между PH и Vn оценивались в реальном времени с помощью BLI. Рисунок 2 B показывает кривые ответ привязки PH для датчика Vn покрытием поверхности. Привязка соответствия (в данном случае, Kd = 2,2 мкм) оценивалась путем установки данных для привязки установившегося кинетики.
Бактерии, отсутствует выражение PH на поверхности клеток (Hif M10ΔЛПХ) выставлены уменьшена присоединения к Vn покрытием стеклянных поверхностях по сравнению с WT клеток (рис. 3А). Кроме того присутствие Vn на поверхности эпителиальных клеток значительно усилить приверженность Hif (рис. 3B). Эти результаты показали, что PH-Vn взаимодействие способствовало присоединение бактериальной.
VN является ингибитором известных дополнением. Оценить деятельность ингибирования комплемента, сыворотка опосредованной убийства был рассмотрен в присутствии и отсутствии В.н. WT Hif клеток выставлены сыворотки сопротивление выше чем M10ΔЛПХ мутантные клетки. Не бактерии были убиты в присутствии его (рис. 4A). Интересно, что WT Hif выставлены снижение выживаемости в VDS, и пополнение Vn увеличилось бактериальных выживания. Однако Hif M10ΔЛПХ штамм не реагировать Vn истощения потому что он не мог набирать Vn на поверхности клеток (рис. 4B). Эти результаты ясно продемонстрировать, что Vn является важным принимающей фактор, который защищает бактерии от дополнения опосредованной убийства (рис. 4A-B).
Рисунок 1 : Haemophilus influenzae серотип f связывает Vn через выразил поверхности тел. (A) потока цитометрии результаты показаны привязки Vn клетки Hif клинических изолятов. Каждый клинического изолята (5 х 106 CFU) был инкубировали с 250 Нм человека, В.н. граница лигандом был обнаружен с помощью пабы анти Vn овец и осла FITC-конъюгированных вторичные антитела анти овец. Кишечная палочка BL21 (DE3) был включен в качестве отрицательного контроля. Данные представлены как среднее флуоресценции интенсивности от трех экземплярах анализов в трех отдельных экспериментов и погрешностей представляют SD. (B) потока цитометрии гистограммы демонстрирует привязку Vn к поверхности WT Hif M10 и PH-удаление Hif M10Δ ЛПХ мутант. Показываются репрезентативных данных из одного из трех отдельных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Рекомбинантных PH привязывается к Vn. (A) ИФА результаты демонстрируют привязку рекомбинантных PH Vn, FH и C4BP. FH был использован как позитивный элемент управления, в то время как C4BP был использован в качестве отрицательного контроля. Для анализа взаимодействий протеин протеина, Vn, FH и C4BP были покрыты в эквимолярных (50 Нм) концентрации на колодцы микротитровальных плит. Далее, 50 Нм рекомбинантной добавленные PH-His6x. Связанные PH был обнаружен с помощью HRP-конъюгированных против его пабы. Данные средства тройные анализов из трех независимых экспериментов, и погрешностей указывают SD. ***, P≤0.001. (B) BLIanalysis PH привязки к Vn: рекомбинантные Vn была иммобилизованных на AR2G датчики и привязки кинетика PH (0.25-4 мкм) для Vn были записаны с помощью инструмента BLI. Чонстанта равновесия близость была рассчитана с использованием сигналов, полученных для каждой концентрации в равновесии, и данные были установлены согласно установившегося кинетики. Эксперимент был повторен в три раза, и один представитель набора данных отображается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Взаимодействие между PH и Vn улучшает бактериальный приверженность стеклянных поверхностей и эпителиальных клеток. (A) света микроскопических изображений показаны приверженность Hif Vn покрытием стеклянных скольжениях. Бактерии были визуализированы путем пятнать грамм. Показываются представитель изображений из одного из трех независимых экспериментов. Эта группа была ранее опубликована в Журнале иммунологии7 и здесь воспроизводится с разрешения от Американской ассоциации иммунологов. (B) присоединение WT Hif M10 клеток к A549 эпителиальных клеток в присутствия и отсутствия Vn, выводятся средства тройные анализов из трех независимых экспериментов и погрешностей представляют SD. *, p ≤0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Vn, набранных на поверхности клеток Hif защищает бактерии от сыворотки опосредованной убийства. (A) WT Hif M10 и мутанта Hif M10ΔЛПХ инкубировали 15 мин в 5% NHS или его. ЛПХ (B) сопротивление Hif M10 и Hif M10Δ к бактерицидная эффектов в 5% VDS и VDS, дополнена 250 Нм очищенного В.н. данные представляют собой средства тройные анализов из трех независимых экспериментов, и погрешностей указывают SD. ***, p ≤0.001; НС, не значительные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Патогенные набирать Vn на поверхности клетки и использовать этот регулятор дополнением для предотвращения осаждения факторов комплемента и завершения комплекс мембраны нападение2. VN также функционирует как молекула мост между бактериальных белков на поверхности и принимающей ячейки поверхности рецепторы, таким образом позволяя патогенов присоединиться к поверхности эпителиальных клеток и впоследствии посредником интернализации. В этом исследовании мы описываем протоколы, которые могут использоваться для оценки i) привязки Vn поверхности бактериальной клетки, ii) белок белковых взаимодействий и близость константы, и iii функциональная роль Vn в оказании сопротивления сыворотки и повышение присоединение к поверхности клеток хозяина.
Проточной цитометрии это Количественный метод обычно используется для проверки, что бактерии связывают Vn. Однако Vn концентрации должны быть оптимизированы, как Vn связывающая способность (и различных рецепторов) могут отличаться в зависимости от вида бактерий. В assay, описанные здесь 1 – 100 мкг/мл Vn использовались для оценки линейных привязки и параметры насыщения. Сравнение привязки модели WT Hif, Hif M10ΔЛПХ мутант и отрицательный контроль E. coli клеток показало четкое различие в Vn концентрации 20 мкг/мл (250 Нм). Таким образом эта концентрация была использована в всех экспериментов цитометрии потока. Использование Vn в концентрациях выше точки насыщения может дать ложно положительных сигналов. Разбавление первичных и вторичных антител также должны быть отдельно оптимизированы для каждого возбудителя. Максимальная разбавления антитела, показываю хороший сигнал должен быть выбран. В этом исследовании мы использовали 2,5% BSA как блокирующие агента. Однако BSA не является универсальной блокировки реагент, подходит для всех патогенных микроорганизмов. В тех случаях, в которых BSA не блокирует взаимодействий неспецифических антитела может использоваться другие блокирующие реагентов, например рыбий желатин. Связывание Vn на поверхности клеток бактериальных патогенов часто опосредовано несколько рецепторов21,22. Некоторые рецепторы имеют высокое сродство Vn, в то время как другие могут exhibit низкое сродство. Таким образом исключить только один ген кодирования поверхности белка может не привести к снижению взаимодействия Vn, оценены проточной цитометрии. В качестве альтернативы для проточной цитометрии связывания белков на поверхности бактериальной клетки может быть проверен с помощью помощью иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) или просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА). Хотя Фотообесцвечивание fluororeagent конъюгированных антител может быть проблематичным в проточной цитометрии и МФСА, ТЕА предполагает громоздких пробоподготовки, с существенным риском введения артефакты23,24. Анализ потока цитометрии предпочтительнее действительно ИФА и ТЕА благодаря простой пример подготовка протоколов и возможность тестирования многих образцов в течение короткого периода времени.
Белок белковых взаимодействий в системе свободной ячейки были проанализированы ELISA (рисA) и BLI (рис. 2B). В обоих этих методов один из партнеров привязки была иммобилизованных, либо на биосенсора (для BLI) или микротитровальных плиты (ELISA). Преимущество BLI и ELISA является, что они позволяют анализ белок белковых взаимодействий в их родном государстве, предотвращая неспецифического взаимодействия вне активной привязки сайта. Однако, Утилита BLI, могут быть ограничены в зависимости от метода иммобилизации. Амин, муфты процедура, используемая здесь случайно образует Амида связь между любой поверхности подвергаются аминовая группа белка и поверхности биосенсор. Это приводит к иммобилизации белковых молекул на поверхности датчика в различных направлениях. Это может привести к разнородные привязки, которая не соответствует модели кинетики 1:1 привязки. Этот потенциал проблема может быть решена путем выбора биотина датчиков и добавив тег стрептавидина рекомбинантным белком, чтобы быть иммобилизованным. Надежность BLI аналогична поверхностного плазмон резонанса (СРП). Ассоциации и диссоциации молекул может измеряться в режиме реального времени, используя либо технику. Однако устройство BLI не использовать микрофлюидика и поэтому легко поддерживать. Кроме того 96 взаимодействия может испытываться одновременно в BLI, тогда как только четырех образцов одновременно могут быть проверены с помощью СРП. Есть еще один важный шаг в BLI, которые должны быть оптимизированы. Если датчики используются повторно, регенерации условия должны также быть оптимизированы, как что может различаться для каждого комплекса протеин. В этом исследовании Этилендиаминтетрауксусная кислота 10 мм был найден подходящий для регенерации датчик.
Роль Vn в бактериальных присоединения был испытан, непосредственно с помощью стеклянных поверхностей, покрытых Vn. Этот подход может быть использован для анализа привязки для любых бактериальных патогенов, включая как грамотрицательных и - положительных бактерий. Это полуколичественный метод, который обеспечивает быстрой оценки потенциала возбудитель для привязки к Vn. Чтобы получить удовлетворительные результаты, Vn покрытия должны быть оптимизированы. В assay, описанные здесь покрытия с ВН в 1, 2 и 5 мкг/мл был рассмотрен, и 2 мкг/мл оказался наиболее подходящим концентрации для экспериментов, проведенных в этом исследовании (рисA). Избыток Vn покрытием на поверхности можно создать толстый слой, который может быть легко снял во время выборки фиксации и окраски. Кроме того бактериальной культуры не должны иметь большие скопления клеток; Это можно избежать путем vortexing культуры перед добавлением Алиготе слайды.
Бактериальные присоединение к поверхности эпителиальных клеток был рассмотрен с использованием техники плиты граф (рисA). Этот assay также должны быть тщательно оптимизированы для включения наблюдения роли Vn в бактериальных присоединения. VN имеет различные привязки сайтов для бактерий (в C-terminus) и клеточной поверхности Интегрин рецепторов (в точке привязки N-терминальный РСЗ). Связывание Vn для интегринов индуцирует сигнализации и поглощение Интегрин Vn комплекс1. Если такие комплексы внедрено без бактерий, будет трудно интерпретировать результаты. Таким образом Vn должны добавляться в монослое эпителиальных клеток при 4 ° C. После Vn имеет насыщенный Интегрин рецепторов на поверхности эпителиальных клеток, избыток Vn должны быть смыты, как свободный Vn может блокировать бактериальных Vn зависимых Интегрин привязки. В этот assay, мы оценили, общей бактериальной подсчитывает связанные с эпителиальных клеток (т.е., считывания состоит как придает поверхности и интернализированных бактерии). Этот assay может быть продлен для различения между внешней и внутриклеточных бактериальных популяций путем обращения с гентамицин4.
Бактерицидная пробирного сыворотки, используется в протоколе описаны здесь был частично изменен из ранее опубликованных процедуры12,22. В assay описано здесь, 1,5 x 103 CFUs Hif инкубировали с NHS 5% за 15 мин, 5 мин дольше, чем в ранее описанных assay (рис. 4A). Разница между WT Hif и isogenic мутант лишенный PH был более очевидным в 15 мин, чем в 10 мин. Таким образом мы выбрали 15 мин инкубационный период для этого конкретного эксперимента. Бактерицидный эффект сыворотки зависят от концентрации сыворотки, время инкубации и количество бактерий. Все патогенов демонстрируют заметный потенциала для избежания бактерицидную активность сыворотки; Некоторые патогены могут быть полностью устойчивы к сыворотки, тогда как другие могут быть умеренно устойчив или чувствительной. Сывороточной концентрации должны быть оптимизированы таким образом для каждого конкретного возбудителя изучены. Тем не менее сыворотка убийство пробирного, описанные здесь ограничен к изучению грамотрицательных бактерий, так как сыворотки имеет без существенных бактерицидное действие на грам-положительных клеток в1,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких финансовых конфликтов интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана гранты от фонда Анна и Эдвин Бергер, Ларс Hierta, о.е. и Эдла Йоханссон фонд, шведский Совет медицинских исследований (Грант номер K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), Фонд рака в университете Больница в Мальмё, физиографические общества (Forssman в фонд) и Совет графства Сконе исследований и Фонд развития.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
