Summary
本报告描述了用于表征细菌外膜蛋白与人体补体调节器 vitronectin 之间相互作用的协议。该协议可用于研究 vitronectin 在任何细菌物种中的结合反应和生物学功能。
Abstract
细菌利用补充调节器作为逃避宿主免疫反应的手段。在这里, 我们描述了评估在细菌细胞表面 vitronectin 获取的作用的协议, 以抵抗宿主免疫系统。流式细胞术实验确定人血浆 vitronectin 作为一种配体的细菌受体外膜蛋白 H 型流感嗜血杆菌 f。采用酶联免疫吸附法对纯化的重组蛋白 H 与 vitronectin 蛋白相互作用进行了表征, 并利用生物层干涉方法评估了结合亲和性。使用正常和 vitronectin 耗尽的人血清进行血清耐药性测定, 证实了 vitronectin 与蛋白 H 在细菌细胞表面的结合对宿主免疫应答的生物学重要性。采用无 vitronectin 涂层的玻片和革兰染色, 分析了 vitronectin 在细菌粘附中的重要性。最后, 对人肺泡上皮细胞膜的细菌黏附性进行了研究。这里描述的协议可以很容易地适应对任何细菌物种感兴趣的研究。
Introduction
Vitronectin (Vn) 是一种重要的人类糖蛋白, 通过调节纤溶系统来维持稳态。在 C5b6-7 复合形成和 C9 聚合过程中, Vn 还通过抑制末端补道来发挥补充调节作用。一些细菌病原体已被证明要招募 Vn 到细胞表面作为抵抗补体沉积1,2,3的手段。此外, Vn 在细菌和宿主上皮细胞受体之间充当 "三明治" 分子, 从而促进病原体的附着和内部化2,4,5。Vn 与细菌细胞表面的结合是由其他目前未识别的蛋白质介导的。因此, 充分阐明 vn 结合在规避软管免疫反应方面的功能作用, 将需要鉴定 vn 的蛋白质。
确定 vn 结合蛋白的最初步骤是测试是否有兴趣的病原体可以结合纯化的 vn. 流式细胞术是一种简便而直接的方法, 用于确定 vn 是否与病原细胞结合。在本研究中, 我们评估了 Vn 与不同类型的流感嗜血杆菌 (Hif) 临床分离6的结合。本文描述的方法是定量的, 可用于区分各种细菌菌株的结合能力。在以前的研究中, 我们将 Hif 的蛋白质 H (PH 值) 描述为 Vn 结合蛋白7。因此, 在本研究中, 用所述的方法比较了野生型 (WT) Hif 和 Hif M10Δlph突变体的 Vn 结合电位。
一旦确定病原体结合 Vn, 第二步是表征表面蛋白质组, 以确定潜在的 Vn 结合蛋白。可以使用多种方法来实现8、9, 但本报告没有介绍这些方法。最适合检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法是在大肠杆菌中制备表达选择的细菌表面蛋白, 并通过亲和层析纯化。在这里, 我们使用了 PH 及其分子相互作用与 Vn 来说明该方法。重组 PH 和 Vn 之间的相互作用采用酶联免疫吸附试验 (ELISA)7和最近开发的无标签技术 (称为生物层干涉法 (BLI)10,11) 进行了表征。虽然 ELISAs 可用于确认蛋白质-蛋白质相互作用, 但 BLI 提供有关相互作用的动力学参数的详细数据。
为了研究 Vn 在细菌粘附中的功能作用, 可以使用两种不同的检测法。这里描述的第一种检测方法是直接测量对 Vn 涂层玻璃表面的细菌附着, 而第二种检测则检查附着在上皮细胞表面。对于第一种检测方法, 玻璃玻片涂有 Vn, 用革兰染色和显微显微镜评估了 WT 或突变 Hif 菌株的结合度。这种技术可以根据结合 Vn12的能力, 轻松区分细菌。然后, 通过在 II. 型肺泡上皮细胞的单层添加培养细菌, 对哺乳动物细胞的细菌黏附性进行分析;通过计数菌落形成单位 (CFUs) 的数量来评估细菌附着。附着和内化细菌可在 Vn4、13的存在或缺失时加以区分。
利用血清杀灭试验 (即血清杀菌活性) 评价了 Vn 在细菌性血清耐药性中的作用。为了评价 vn 在血清耐药性中的意义, 与正常人血清 (NHS) 的杀菌活性进行了比较。该方法可以很容易地区分 Vn 结合与非结合细菌的血清耐药性。我们用这种方法研究了 Vn 在几种细菌病原体的耐药性中的作用4,12。
许多方法已经报告了研究寄主病原体的相互作用。在这里, 我们描述了一套协议, 可以很容易地适应任何病原体的研究, 以评估 Vn 在发病机制中的作用。我们使用各种病原体测试了这些协议, 并选择了 Hif 作为本报告的示例。
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Protocol
1. Vn 作为细菌表面蛋白配体的分析
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应用流式细胞仪检测细菌表面的 Vn 结合
注: 在流式细胞术中, 我们使用侧散射和正向散射来门正事件。为了检查与 Vn 的相互作用, Hif 临床分离 (n=10)7与大肠杆菌BL21 (DE3) 一起选择作为阴性对照 (图 1a)。- 培养 Hif 在脑心脏输液 (BHI) 培养基中的临床分离剂, 辅以10µg/毫升 NAD 和氯化血红素37摄氏度, 振动 200 rpm。使用 Luria 贝塔尼培养基培养大肠杆菌14。收获 Hif 在中对数阶段 (OD600 = 0.3)15, 并重悬磷酸盐缓冲盐水 (PBS), pH 7.2, 含有 1% (w/v) 牛血清白蛋白 (BSA) 的细菌 (阻断缓冲;PBS BSA)。调节悬浮液至 109 CFU/毫升。
- 将含有 5 x 106 CFU 的等份转移至5毫升聚苯乙烯圆底管 (12 x 75 mm2), 并添加1毫升的阻塞缓冲液。离心悬浮液在室温下 3500 x g (RT)16 5 分钟, 以使细菌沉淀, 然后仔细抽吸以除去上清液而不干扰颗粒。
- 将含有 250 nM Vn 的50微升阻断缓冲液重悬, 并在室温下孵育 1 h 的样品, 不摇晃。孵育后, 用 3500 x g离心5分钟, 然后用 PBS 和类似的离心步骤清洗颗粒三次。
- 对细菌颗粒, 添加50微升的原绵羊抗人 Vn 多克隆抗体 (pAbs) 在1:100 稀释的 PBS BSA。孵育 1 h 在 RT 的悬浮液, 然后用 PBS 洗涤细菌三次, 以去除未绑定的抗体 (如步骤1.1.3 中所述)。
- 接下来, 加入50微升的 PBS BSA 含荧光素异氰酸酯 (FITC)-共轭驴抗绵羊 pAbs (1:100 稀释) 和孵育在 RT 1 h 在黑暗中。
- 只用阻塞缓冲液孵育细菌, pAbs 无 Vn, 即可制备空白控制。
- 如第1.1.2 节所述, 用1毫升的阻断缓冲液清洗细菌三次, 然后离心悬浮液。最后, 用300µL 的 PBS 重悬细菌颗粒, 用流式细胞仪7进行分析。
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重组 PH 与 Vn 相互作用的 ELISA 分析
注意: 需要包括控件以排除非特异性绑定。人因子 H (FH) 或 C4b-binding 蛋白 (C4BP) 分别用作阳性和阴性对照。- 将人类蛋白质 (Vn、FH 和 C4BP) 分别稀释到三盐酸盐中的 50 nM, pH 9.0 (涂层缓冲液)。将100µL 的蛋白质溶液分配到 Polysorp 微量滴定板的每个井中。用盖子关闭盘子, 在4摄氏度过夜 (16 小时), 以促进蛋白质固定在微量滴定板井上。
- 将解决方案从微量滴定板上翻转倒在水槽上, 用300µL PBS/井冲洗三次井。使用包含 2.5% (w/v) bsa (pbs bsa) 的 pbs, 在 RT 中阻断1小时的涂层井。
- 除去阻塞解决方案后, 用300µL 的 PBS (0.05% (v/v) 补间 20 (PBST) 每孔洗涤三次井。添加100µL 50 nM 重组他标签 PH 到每个样本井和孵育 1 h 在 RT。在控制井中, 只添加100µL 的 PBS BSA。
注: lph基因编码 Hif 的 PH 值被 PCR 放大并克隆到 pET26b 表达载体中, 在表达蛋白的 c-终点添加6×他的标记。重组载体转化为大肠杆菌BL21 (DE3) 表达。采用镍 NTA 树脂纯化重组蛋白15。 - 用300µL 的 PBST, 丢弃蛋白质溶液并去除未绑定的蛋白质三次。添加100µL 含有辣根过氧化物酶 (HRP)-共轭抗他的 pAbs (1:10,000 稀释) 和孵育 1 h 在 RT 的 PBS BSA。
- 在5% 丙酮和45% 甲醇溶液中溶解 tetramethylbenzidine, 制备 20 mM 溶液 A。为制备溶液 B, 在1000毫升的 H2O 中溶解19.2 克柠檬酸, 通过添加 KOH 调节 pH 至 4.25, 然后添加230µL 30% O 2.在黑色的 RT 中存储两种解决方案。在使用前, 将500µL 溶液 B 与9.5 毫升溶液 a 混合, 制备 ELISA 检测试剂。
- 用300µL PBST 每孔冲洗三次, 并通过添加100µL 的 ELISA 检测试剂, 检测抗原抗体配合物。
- 添加50µL 1 米2所以4/好停止反应。使用微孔板读取器测量 450 nm 井的光学密度。
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基于 BLI 的重组 PH 和 Vn 的相互作用动力学研究
- 根据制造商的准则11, 使用胺耦合法固定人 Vn 在胺反应传感器上。
- 使用 PBS, 串行稀释配体 (重组 PH) 从0到4µM, 并将产生的解决方案转移到96孔的黑色, 平底微量滴定板。使用 BLI 仪器17在30摄氏度运行实验。
- 在 BLI 数据分析软件中加载数据文件夹。选择 "传感器选择"选项。然后, 在 PBS 中选择 "参考井" (Vn 涂层传感器) 进行减法运算。
- 选择"将 Y 轴与基线对齐" , 然后选择"interstep 校正并对齐到关联"。按 "处理数据" 将自动打开分析选项卡。
- 在 "分析" 选项卡中, 选择 "曲线拟合" 下的"关联和分离"选项。选择模型 "1:1 绑定和全局拟合"。按"拟合曲线"和导出拟合数据17。
2. Vn 在细菌粘附中的作用表征
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Vn 涂层玻璃表面细菌附着性的研究
- 在 PBS 中制备2µg/毫升的 Vn 溶液, 将此溶液的10µL 移到玻璃显微镜幻灯片上作为单滴。允许在滑块上晾干30分钟. 涂上人体血清白蛋白 (HSA) 作为阴性对照的幻灯片。
- 通过在含有 PBS 的烧杯中浸泡两秒钟的玻片来去除多余的未涂布蛋白, 将三倍的蛋白质涂覆玻片冲洗。将20毫升新鲜的 Hif 文化 (在步骤1.1.1 中描述) 放入无菌塑料培养皿中, 并将 Vn/白蛋白涂层玻璃玻片浸入培养基中。在37摄氏度下孵育1小时, 振动 20 rpm。
注: Hif M10 和 Hif M10Δlph生长在液体 BHI 培养基或巧克力琼脂板上。lph突变体的培养基辅以10µg/毫升卡那霉素15。 - 孵育后, 通过在充满 PBS 的烧杯中浸入三次, 去除未绑定的细菌。如所述, 通过革兰染色可视化细菌。
- 将多余的 PBS 从每张幻灯片中移除, 通过倾斜并接触到纸巾上的边缘。在 RT 中风干3-5 分钟的幻灯片, 并通过在火焰上传递每张幻灯片三次来修复附着的细菌。
- 用两根手指在染色托盘上握住滑块的边缘, 然后加入3–4滴 (200–300µL) 2.3% 水晶紫溶液。等待六十年代, 然后在温和的自来水流 3–4 s 冲洗幻灯片。
- 在幻灯片上加入3–4滴0.33% 碘溶液。等待1分钟, 然后在柔和的自来水流下冲洗幻灯片。用印迹纸仔细擦干幻灯片。
- 将含有75% 异丙醇和25% 丙酮的3–4的脱色液加入到滑块中。5–10后, 在轻柔的自来水下冲洗滑梯。
- 添加基本简便易行解决方案的3–4滴 (200–300µL)。等待1分钟, 然后在柔和的自来水流下冲洗幻灯片。用印迹纸擦干幻灯片。
- 在光显微镜下可视化细菌, 选择100X 放大倍率18的油浸物镜。比较 Hif WT 和突变菌在 Vn 和白蛋白涂层玻璃表面的粘附性。
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Vn 依赖性细菌对上皮细胞的粘附研究
注意: 在我们以前的研究4,7中使用了这种有效的粘附试验。- 培养 A549 细胞 (II. 型肺泡上皮细胞) 在一个75厘米2组织培养烧瓶与 F12 培养基补充 10% (卷/vol) 胎儿小牛血清 (FCS) (完整培养基) 和5µg/毫升庆大霉素。孵育在孵化器与 5% CO2在37摄氏度3天, 直到80% 汇合 (融合可以通过使用倒置显微镜可视化的细胞表面覆盖估计)。以下四步骤描述了如何为检测19,20制备上皮细胞。
- 用轻柔旋转的20毫升 PBS 在烧瓶中洗涤细胞单层两次。要从烧瓶表面分离细胞, 添加2毫升细胞脱离酶溶液, 并在37摄氏度下孵育5分钟。用手掌轻触烧瓶, 从塑料表面分离出所有的细胞。移液器上下几次以分散细胞团簇。
- 将18毫升 F12 完整培养基添加到烧瓶中, 将整个细胞悬浮液转移到50毫升无菌猎鹰管中。在 RT 的 200 x g处离心细胞悬浮液5分钟, 并丢弃上清液。在10毫升 F12 完整培养基中重悬细胞颗粒。
- 取出10µL 细胞悬浮液, 放入 Eppendorf 管中, 再加入90µL 的台盼蓝溶液。放置盖玻片后, 将样品装入血细胞计数器 (深度 0.1 mm)。
- 计算区域 A、B、C 和 D 中的所有可行单元格 (每个字段由16个正方形组成, 每个正方形的面积为 0.0025 mm2), 然后计算平均单元格数 ([A + B + C + D]/4)。使用以下公式计算每毫升的细胞数:
活细胞/毫升 = 平均细胞计数 x 104 x 稀释因子20。
注: 在这里, 稀释系数是10。 - 使用含有5µg/毫升庆大霉素的完整培养基稀释细胞悬浮液至 5.0 x 103细胞/毫升。将500微升的细胞悬浮液分配到24孔细胞培养板的每个孔中。孵育板在37°c 5% CO2 , 直到细胞90% 汇合。
- 在细菌感染之前, 从井中取出培养基并添加 F12 培养基 (不含 FCS), 然后在37摄氏度的夜间孵育。
- 用500µL PBS 在 RT 上洗涤细胞单层三次. 将盘子放在冰上, 加入100µL 预冷 F12 培养基中含有10µg/毫升的 Vn. 孵育板在4摄氏度为 1 h。对于控制井, 只添加 F12 介质。
- 孵育后, 通过移液和洗涤细胞层两次, 用1毫升 PBS 在 RT 中丢弃溶液. 在 F12 培养基中重悬新生长的 Hif M10 (步骤 1.1.1) 的培养 (2×108 CFU/毫升)。将这种细菌悬浮液中的100µL 添加到每个井中, 并在37摄氏度下孵育2小时的盘子。
注: 每个井包含大约 2 x 105 A549 细胞。对于感染, 增加了 2 x 107细菌菌群, 对应于100的多重感染。 - 通过移液移除培养基, 用 PBS 冲洗 A549 上皮细胞三次。添加50µL/井的细胞脱离溶液, 并孵育5分钟在37摄氏度的盘子。
- 下一步, 添加50µL F12 完整培养基每井停止酶反应。将上皮细胞 (≈100微升 [即整个体积]) 从每个油井转移到含有四个玻璃珠的6毫升玻璃管中。通过涡旋在 RT 中裂解细胞2分钟。
- 稀释10µL 细胞裂解物100倍通过加入10µL 裂解液到990µL 的 F12 培养基。将稀释后的样品10µL 到巧克力琼脂板上。
- 在37摄氏度的夜间孵育巧克力琼脂板, 然后计算菌落数。每个殖民地代表一个 CFU。
- 培养 A549 细胞 (II. 型肺泡上皮细胞) 在一个75厘米2组织培养烧瓶与 F12 培养基补充 10% (卷/vol) 胎儿小牛血清 (FCS) (完整培养基) 和5µg/毫升庆大霉素。孵育在孵化器与 5% CO2在37摄氏度3天, 直到80% 汇合 (融合可以通过使用倒置显微镜可视化的细胞表面覆盖估计)。以下四步骤描述了如何为检测19,20制备上皮细胞。
3. Vn 对人体血清杀菌活性的抗性分析
- 从商业来源购买 NHS。如前所述, 准备 VDS12。补充 VDS 与 180 nM vn, 相当于 vn 目前在 NHS。
- 通过加热 NHS 在56摄氏度为30分钟, 以禁用补充蛋白质准备热灭活血清 (他)。
注: 在 Hif15中, 对步骤3.3–3.7 中所述测定的最佳血清浓度 (5%) 和孵育时间 (15 分钟) 进行了经验测定; 这些参数可能因其他细菌病原体而异。 - 培养细菌 (在这种情况下, Hif M10 和突变体 Hif M10Δlph) 到中对数阶段 (OD600 = 0.3)。在 3500 x g离心的颗粒细菌10分钟。
- 用1体积葡萄糖明胶 Veronal 缓冲液 (DGVB+ +pH 7.3) 重悬细菌颗粒, 含有 2.5% (w/v) 葡萄糖、2 mM 氯化镁2、0.15 mM CaCl2和 0.1% (wt/vol) 明胶。
- 添加 1.5 x 103细菌菌到100µL 包含5% 血清 (NHS, 他的, VDS, 或 VDS+180 nM Vn) 的 DGVB。在37摄氏度孵育样品15分钟, 振动 300 rpm。
- 从反应混合物中取出10µL 等分0分钟 (t0样品) 和15分钟 (tt样本) 和巧克力琼脂上的板。在37摄氏度的晚上孵育盘子。
- 孵化后, 计数在板块上出现的菌落。使用以下公式计算杀死12的细菌的百分比: (在 tt)/(cfu 在 t0) x 100。
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Representative Results
用流式细胞仪测定了对细菌表面的 Vn 结合。在这项研究中, 所有的 Hif 临床分离试验都是在细胞表面进行的。大肠杆菌阴性对照菌株未观察到 Vn 与细胞表面的相互作用 (图 1A)。如图 1B所示, PH 值是 Hif 细胞表面的一种主要的 Vn 结合蛋白。Hif 应变 M10 对 vn 的束缚导致了种群的转移, 而 Hif M10Δlph不结合 vn, 出现类似于对照。
通过 ELISA 和 BLI 估计了 PH 和 Vn 之间的蛋白质-蛋白质相互作用。重组 PH 被允许与人因子 H、Vn 和 C4BP (负控制) 结合在微量滴定 ELISA 板的孔上。结合 PH 值估计使用了抗他的 pAbs。结果表明, 与 C4BP (图 2a) 相比, PH 值与 Vn 和因子 H 之间存在显著的相互作用。使用 BLI 实时估计 PH 值和 Vn 之间的相互作用。图 2B显示 Vn 涂层传感器表面的 PH 结合响应曲线。结合亲和性 (在这种情况下, Kd = 2.2 µM) 通过拟合数据到稳态结合动力学估计。
在细胞表面 (Hif M10Δlph) 缺乏 PH 值表达的细菌与 WT 细胞相比, 减少了对 Vn 涂层玻璃表面的附着 (图 3A)。此外, 在上皮细胞表面有 Vn 的存在显著增强了 Hif 的附着性 (图 3B)。结果表明, PH-Vn 相互作用对细菌的附着性有显著影响。
Vn 是一种众所周知的补剂抑制剂。为了估计补体抑制活性, 对血清介导的杀戮在存在和缺乏的情况下进行了检查. Hif 细胞比 M10Δlph突变细胞具有更高的血清抗性。在他面前没有细菌死亡 (图 4A)。有趣的是, WT Hif 在 VDS 中的存活率降低, 并且补充了 Vn 增加了细菌存活。然而, Hif M10Δlph菌株没有响应 vn 耗尽, 因为它不能招募 vn 到细胞表面 (图 4B)。这些结果清楚地表明, Vn 是保护细菌免受补体介导的杀戮的重要宿主因素 (图 4A-b)。
图 1:流感嗜血杆菌血清型 f 通过表面表达的 PH 值结合 Vn.(A) 流式细胞术结果显示 Vn 与 Hif 临床分离细胞的结合。每个临床隔离 (5 x 106 CFU) 孵育 250 nM 人 vn. 用绵羊抗 Vn pAbs 和 FITC 结合的驴抗绵羊次生抗体检测束缚配体。大肠杆菌BL21 (DE3) 作为负控制被包括在内。在三个单独的实验中, 数据以三项分析的平均荧光强度表示, 误差条代表 SD. (B) 流式细胞术直方图, 证明 Vn 与 WT Hif M10 表面的结合和 PH 删除 Hif M10Δlph变种人显示三个独立实验之一的代表性数据。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 重组 PH 值与 Vn 结合.(A) ELISA 结果表明重组 PH 值与 Vn、FH 和 C4BP 的结合。FH 被用作一个积极的控制, 而 C4BP 被用作一个负控制。为了分析蛋白质-蛋白质相互作用, Vn、FH 和 C4BP 被涂在等摩尔 (50 nM) 浓度的微量滴定板孔上。接下来, 添加了 50 nM 重组 PH-His6x。用 HRP 共轭反他的 pAbs 检测到了束缚 PH 值。所显示的数据是从三个独立实验中进行三项分析的方法, 误差条表示 SD. ***, P≤0.001。(B) BLIanalysis 与 vn 的 ph 结合: 重组 vn 固定在 AR2G 传感器上, 使用 BLI 仪器记录 ph 值 (0.25-4 µM) 与 vn 的结合动力学。用在平衡时获得的信号计算平衡亲和常数, 并根据稳态动力学对数据进行拟合。实验重复了三次, 显示了一个代表性数据集。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: PH 和 Vn 之间的相互作用增强了细菌对玻璃表面和上皮细胞的附着性.(A) 光显微图像显示 Hif 粘附在 Vn 涂层玻璃玻片上。细菌通过革兰染色可视化。显示三个独立实验之一的代表性图像。这个小组以前发表在《免疫学7 》杂志上, 并在美国免疫学家协会的许可下转载。(B) 将 WT Hif M10 细胞粘附在 A549 上皮细胞的存在和缺失的情况下, 三个独立实验的三项分析方法被绘制出来, 误差条表示 SD. *, p ≤0.05。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: Hif 细胞表面的 Vn 保护细菌免受血清介导的杀戮.(A) WT Hif M10 和突变 Hif M10Δlph在 5% NHS 或他的15分钟孵育。(B) Hif M10 和 Hif M10Δlph对 5% vds 和 vds 中的杀菌效果进行补充, 250 nM 纯化的 Vn. 数据代表三个独立实验的三份分析方法, 误差条表示 SD. ***, p≤0.001;NS, 不重要。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
细菌病原体将 Vn 招募到细胞表面, 并利用此补充调节器防止补体因子的沉积和膜攻击复杂2的完成。Vn 还充当细菌表面蛋白和宿主细胞表面受体之间的桥梁分子, 从而使病原体能够附着在上皮细胞表面并随后调解内部化。在本研究中, 我们描述了可用于估计 i 的协议: vn 与细菌细胞表面的结合, ii) 蛋白质-蛋白质相互作用和亲和常数, iii. vn 在提供血清耐药性和增强的作用附着在宿主细胞表面。
流式细胞术是一种定量技术, 常用于验证细菌结合 Vn。然而, vn 浓度必须优化, 因为 vn 结合能力 (和各种受体) 可以根据细菌种类不同而有所不同。在这里描述的试验中, 1–100µg/毫升用于估计线性结合和饱和度参数。Hif、Hif M10Δlph突变体和阴性对照大肠杆菌细胞的结合模式比较表明, 20 µg/毫升 (250 nM) 的 Vn 浓度明显不同。因此, 该浓度用于所有流式细胞术实验。在浓度高于饱和点的情况下使用 Vn 可能产生假阳性信号。主要和二级抗体的稀释也必须分别针对每个病原体进行优化。应选择最大稀释的抗体显示一个良好的信号。在本研究中, 我们使用 2.5% BSA 作为阻断剂。然而, BSA 不是一种适用于所有病原体的通用阻断剂。在 BSA 不阻断非特异性抗体相互作用的情况下, 可以使用其他阻断试剂, 如鱼明胶。Vn 与细菌病原细胞表面的结合通常由多受体21,22。有些受体具有较高的 Vn 结合亲和性, 而另一些则可能表现出低结合亲和力。因此, 仅删除一个编码表面蛋白的基因可能不会导致通过流式细胞仪评估的 Vn 相互作用的减少。作为流式细胞术的替代品, 可以使用免疫荧光检测 (IFA) 或透射电镜 (TEM) 检查细菌细胞表面的蛋白质结合。虽然 fluororeagent 共轭抗体的光漂白在流式细胞仪和 IFAs 中都可能有问题, 但 TEM 涉及繁琐的样品制备, 有很大的风险引入文物23,24。流式细胞仪分析确实比 IFA 和 TEM 更可取, 因为样品制备方案更简单, 并且在短时间内测试许多样品的可能性。
通过 ELISA (图 2a) 和 BLI (图 2B) 分析了无细胞系统中蛋白质-蛋白质的相互作用。在这两种技术中, 有一个结合的合作伙伴是固定的, 无论是在生物传感器 (BLI) 或微量滴定板 (ELISA)。BLI 和 ELISA 的优势在于它们能够在其原生状态下分析蛋白质-蛋白质相互作用, 防止活性结合部位外的非特异性相互作用。但是, BLI 的效用可以根据使用的固定化技术来限制。在这里使用的胺耦合程序随机形成酰胺键之间的任何表面暴露的胺基团的蛋白质和表面的生物传感器。这会导致传感器表面的蛋白质分子固定在不同的方向上。这可能导致不符合1:1 绑定动力学模型的异构绑定。这一潜在的问题可以通过选择生物素传感器和添加在重组蛋白的链霉亲和标记被固定化解决。BLI 的可靠性与表面等离子体共振 (SPR) 相似。可以使用任一技术实时测量分子的关联和分离。但是, BLI 设备不使用微流体, 因此易于维护。此外, 可以在 BLI 中同时测试96个交互, 而一次只能使用 SPR 测试四样本。在 BLI 中还有一个必须优化的关键步骤。如果传感器被重复使用, 再生条件也应该进行优化, 因为每个蛋白质-蛋白质复合体可能会有所不同。在本研究中, 发现了适合于传感器再生的10毫米乙酸酸。
用 vn 涂覆的玻璃表面直接测试了 vn 在细菌粘附中的作用。这种方法可以用来分析任何细菌病原体的结合, 包括革兰氏阴性菌和阳性细菌。这是一种半定量技术, 可快速评估病原体与 Vn 的结合能力。为了获得合理的结果, 必须对 Vn 涂层进行优化。在这里描述的检测, 在 1, 2 和5µg/毫升涂层与 Vn 被检查, 和2µg/毫升被发现是最合适的浓度为实验进行的研究 (图 3A)。涂在表面上的过量 Vn 可能会产生厚层, 在样品固定和染色过程中容易剥离。此外, 细菌培养不应有大量的细胞团簇;在将等分添加到幻灯片之前, 可以通过涡旋区域性来避免这种方法。
采用板计数技术对上皮细胞表面的细菌黏附性进行了研究 (图 3a)。这种检测方法也必须经过仔细优化, 才能观察到 Vn 在细菌粘附中的作用。Vn 有不同的结合部位的细菌 (在 c-终点) 和细胞表面整合素受体 (在 n-末端 RGD 结合点)。vn 与整合素的结合诱导了整合素-Vn 复合物1的信令和吸收。如果这种复合物在没有细菌的情况下内在化, 结果将难以解释。因此, Vn 必须添加到上皮细胞单层4摄氏度。一旦 vn 在上皮细胞表面有饱和整合素受体, 过量的 vn 必须被冲洗掉, 因为游离的 vn 可以阻断细菌 vn 依赖性整合素的结合。在这个实验中, 我们估计与上皮细胞相关的总细菌计数 (即, 读出包括表面附着和内化细菌)。通过庆大霉素4的治疗, 可以扩展此检测方法, 以区分外部和胞内细菌种群。
此处描述的协议中使用的血清杀菌试验是从先前发布的过程12、22部分修改的。在这里描述的检测中, 1.5 x 103 CFUs 的 Hif 孵育 5% NHS 15 分钟, 5 分钟长于先前描述的测定 (图 4A)。Hif 与等基因系突变体缺乏 PH 值的差异在15分钟比10分钟更明显。因此, 我们选择了这个特定实验的15分钟孵育期。血清的杀菌效果取决于血清浓度、孵育时间和细菌数量。所有病原体均表现出显著的避免血清杀菌活性的能力;有些病原体可以完全抗血清, 而其他可以是适度的抗性或敏感。因此血清浓度必须针对每种特定病原体进行优化。然而, 此处描述的血清杀灭试验仅限于革兰阴性菌的研究, 因为血清对革兰阳性细胞没有显著的杀菌作用1,5。
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Disclosures
作者没有利益相关的金融冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了来自安娜和埃德温-伯杰基金会、Hierta、气流和 Edla 约翰逊基金会、瑞典医学研究理事会 (赠款号 K2015-57X-03163-43-4、www.vr.se)、大学癌症基金会的赠款的支持。在马尔默的医院, 地形协会 (Forssman 基金会), 和斯科讷郡议会的研究和发展基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
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