Summary
Dieser Bericht beschreibt die Protokolle für die Charakterisierung von Interaktionen zwischen bakteriellen äußeren Membranproteine und menschliche Ergänzung Regler Vitronectin. Die Protokolle können verwendet werden, um die Bindung Reaktionen und die biologische Funktion von Vitronectin in alle Bakterienarten zu studieren.
Abstract
Bakterien nutzen Ergänzung Regulatoren als Mittel zur Umgehung der Host Immunantwort. Hier beschreiben wir Protokolle für die Bewertung des Rolle Vitronectin Erwerbs bei der bakteriellen Zelle Oberfläche spielt im Widerstand gegen das Immunsystem des Wirts. Flow Cytometry Experimente identifiziert Humanplasma Vitronectin als Liganden für die bakterielle Rezeptor Außenmembran Protein H von Haemophilus Influenzae Typ f. Ein Enzym-linked Immunosorbentprobe-Assay wurde eingesetzt, um die Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen gereinigtes rekombinante Protein H und Vitronectin zu charakterisieren, und verbindliche Affinität wurde anhand Bio-Schicht Interferometrie. Die biologische Bedeutung der Bindung von Vitronectin an Protein H an der bakteriellen Zellenoberfläche in Umgehung der Wirt Immune Antwort bestätigte mit einem Serum-Widerstand-Assay mit normal- und Vitronectin erschöpft Humanserum. Die Bedeutung der Vitronectin in der bakterielle Haftfähigkeit war mit Glas-Objektträger mit und ohne Vitronectin Beschichtung, gefolgt von gramfärbung analysiert. Zu guter Letzt wurde bakterielle Adhäsion zur menschlichen alveoläre Epithelzelle Monolagen untersucht. Die hier beschriebenen Protokolle können die Studie von einer bakteriellen Spezies von Interesse leicht angepasst.
Introduction
Vitronectin (Vn) ist eine wichtige menschliche Glykoprotein Homöostase per Verordnung das fibrinolytische System beteiligt. VL fungiert auch als Regulator Ergänzung durch Hemmung des terminal Ergänzung Weges während der C5b6-7 Komplexbildung und C9 Polymerisation. Verschiedene bakterielle Krankheitserreger haben gezeigt, VL an der Zelloberfläche als Mittel der widerstehenden Ergänzung Ablagerung1,2,3zu rekrutieren. Darüber hinaus fungiert VL wie ein "Sandwich" Molekül zwischen Bakterien und Host epithelialen Zell-Rezeptoren, dadurch Förderung festhalten und Internalisierung von Krankheitserregern2,4,5. Bindung des Vn an der bakteriellen Zellenoberfläche wird durch andere derzeit nicht identifizierte Proteine vermittelt. Voll die funktionale Rolle der Vn-Bindung in Umgehung der Schlauch Immunantwort Aufklärung erfordert daher Identifizierung von Proteinen, VL-recruiting.
Der erste Schritt bei der Ermittlung von Vn-bindende Proteine ist zu prüfen, ob ein Erreger von Interesse gereinigten VL. Durchflusszytometrie binden kann eine bequeme und einfache Methode um festzustellen, ob VL Erreger Zellen gebunden ist. In dieser Studie untersuchten wir die Bindung von Vn an verschiedenen Haemophilus Influenzae Typ f (Hif) klinischen Isolaten6. Die hier beschriebene Methode ist quantitativ und kann verwendet werden, um die Bindungskapazität einer Vielzahl von Bakterienstämmen zu unterscheiden. In einer früheren Studie gekennzeichnet wir Protein H (PH) der Hif als Vn-bindende Protein7. Daher in der vorliegenden Studie das Vn-Bindung-Potenzial der Wildtyp (WT) Hif und Hif M10ΔLph Mutanten wurden verglichen mit den beschriebenen Protokollen.
Sobald festgestellt wird, dass ein Erreger Vn bindet, ist der zweite Schritt, die Oberfläche Proteom zu charakterisieren, um potenzielle Vn-bindende Proteine zu identifizieren. Eine Vielzahl von Ansätzen eignet sich für diesen Zweck8,9, aber diese Methoden sind nicht in diesem Bericht beschrieben. Die Methode am besten geeignet für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist rekombinant express ausgewählte bakterielle Oberflächenproteine in E. Coli und reinigen durch Affinitätschromatographie. Hier verwenden wir PH und seine molekularen Wechselwirkung mit VL um die Methode zu veranschaulichen. Wechselwirkungen zwischen rekombinante PH und VL zeichneten sich mit einem Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)7 und eine neu entwickelte markierungsfreie Technik bekannt als Bio-Schicht Interferometrie (BLI)10,11. Während ELISAs verwendet werden können, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu bestätigen, bietet BLI detaillierte Daten über die kinetischen Parameter der Interaktionen.
Um die funktionale Rolle der Vn in der bakterielle Haftfähigkeit zu studieren, können zwei verschiedene Tests genutzt werden. Der erste Test hier beschriebenen ist direkte Messung der bakteriellen Einhaltung der Vn-beschichtete Glasoberflächen, während der zweite Test festhalten an der Oberfläche der Epithelzellen untersucht. Für den ersten Test Glas-Objektträger wurden mit VL beschichtet, und die Bindung von WT oder mutierten Hif Stämme wurde durch gramfärbung und Mikroskopie beurteilt. Diese Technik unterscheidet leicht Bakterien basiert auf der Fähigkeit, VL12binden. Bakterielle Adhäsion für Säugerzellen war dann analysiert, durch Zugabe von kultivierten Bakterien auf einem monomolekularen Film der Typ II alveolären Epithelzellen; bakterielle Anlage wurde beurteilt durch zählen der Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE). Eingehalten und internalisierte Bakterien können in das Vorhandensein oder Fehlen von VL4,13unterschieden werden.
Die Rolle der Vn-Akquisition im bakteriellen Serum Widerstand wurde mit einem Serum Tötung Assay (d.h. Serum bakterizide Aktivität) ausgewertet. Um die Bedeutung der Vn-Akquisition im Serum Widerstand zu beurteilen, wurde die bakterizide Aktivität von Vn-abgereicherte Serum (VDS) mit der normalen menschlichen Serum (NHS) verglichen. Die Methode leicht unterscheidet Vn-Bindung im Vergleich zu nicht-bindenden Bakterien anhand Serum Widerstand. Wir haben diese Methode zur Untersuchung der Rolle der Vn im Serum Widerstand von einigen bakteriellen Krankheitserregern4,12verwendet.
Zahlreiche Methoden wurden für die Untersuchung von Wirt-Pathogen Interaktionen beschrieben. Hier beschreiben wir eine Reihe von Protokollen, die für die Untersuchung von jeder Erreger leicht angepasst werden kann, um die Rolle der Vn in der Pathogenese zu bewerten. Wir testeten diese Protokolle mit verschiedenen Krankheitserregern und Hif wurde gewählt als Beispiel für diesen Bericht.
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Protocol
1. Analyse der Vn als eine bakterielle Oberfläche Protein-Ligand
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Erkennung von Vn-Bindung an der bakteriellen Oberfläche mit Durchflusszytometrie
Hinweis: In der Durchflusszytometrie verwendeten wir Side Scatter und forward Scatter um positive Ereignisse Tor. Untersuchen die Wechselwirkungen mit Vn Hif klinische Isolate (n = 10)7 ausgewählt wurden, zusammen mit E. Coli BL21 (DE3) als Negativkontrolle (Abb. 1A).- Kultur Hif klinische Isolate im Gehirn-Herz Infusion (BHI) Medium mit 10 µg/mL NAD und Hämin bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min ergänzt. Verwenden Sie Luria-Bertani Medium, um E. Coli14Kultur. Hif an Mid Log-Phase zu ernten (OD600 = 0,3)15, und Aufschwemmen der Bakterien in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, mit 1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA) (Sperrung Puffer; PBS-BSA). Einstellen die Federung, 109 KBE/mL.
- Übertragen Sie der Aliquote mit 5 x 106 KBE bis 5 mL Polystyrol Rundboden Röhrchen (12 x 75 mm2) und 1 mL blockierende Puffer. Zentrifugieren Sie die Federung bei 3.500 × g bei Raumtemperatur (RT)16 für 5 min um die Bakterien zu Pellets, dann Aspirieren Sie vorsichtig um den überstand zu entfernen, ohne zu stören das Pellet.
- Aufschwemmen der bakteriellen Pellets mit 50 μL der blockierenden Puffer mit 250 nM VL und inkubieren Sie die Proben für 1 h bei RT ohne schütteln. Nach der Inkubation pellet-die Bakterien durch Zentrifugation bei 3.500 X g für 5 min, dann waschen Sie die Pellets drei Mal mit PBS und ähnliche Zentrifugation Schritte.
- Die bakterielle Pellet fügen Sie 50 μL der primären Schafe Anti-Human Vn polyclonal Antikörper (pAbs hinzu) bei 1: 100 Verdünnung in PBS-BSA. Inkubieren Sie die Aufhängung für 1 h bei RT, dann waschen Sie die Bakterien dreimal mit PBS, ungebundenen Antikörper zu entfernen (siehe Schritt 1.1.3).
- Fügen Sie dann 50 μL der PBS-BSA mit Fluorescein erfolgt (FITC)-konjugiert Esel Anti-Schafe pAbs (1: 100 Verdünnung) und 1 h im Dunkeln bei RT inkubieren.
- Bereiten Sie ein leeres Steuerelement durch Inkubation Bakterien mit Sperrung nur Puffer und pAbs ohne VL.
- Waschen Bakterien dreimal mit 1 mL Puffer blockiert und die Suspension durch Zentrifugation, pellet, wie im Abschnitt 1.1.2 beschrieben. Zu guter Letzt Aufschwemmen der bakteriellen Pellets mit 300 µL PBS und Analysieren von Flow Cytometry7.
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ELISA Analyse der Interaktion zwischen rekombinante PH und VL
Hinweis: Steuerelemente müssen aufgenommen werden, um unspezifische Bindung ausschließen. Menschliches Faktor H (FH) oder C4b-Binding Protein (C4BP) bzw. als positive und negative Kontrollen verwendet werden.- Verdünnen Sie die menschliche Proteine (VL, FH und C4BP) separat auf 50 nM im Tris-HCl, pH 9,0 (Beschichtung Puffer). 100 µL der Proteinlösung in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte eine Polysorp zu verzichten. Die Platten mit dem Deckel schließen und bei 4 ° C über Nacht (16 h) zur Erleichterung der Immobilisierung des Proteins auf Mikrotiter Platte Brunnen lagern.
- Entsorgen Sie die Lösung aus der Mikrotiterplatte durch Kippen kopfüber über dem Waschbecken und waschen Sie der Brunnen dreimal mit 300 µL PBS/gut. Die beschichteten Vertiefungen für 1 h bei RT mit PBS mit 2,5 % (w/V) BSA (PBS-BSA) zu blockieren.
- Waschen Sie nach dem Entfernen der blockierenden Lösung, die Brunnen dreimal mit 300 µL PBS mit 0,05 % (V/V) Tween 20 (PBST) pro Bohrloch. Hinzufügen von 100 µL 50 nM rekombinante sein-tagged PH zu jeder Probe gut und 1 h bei RT inkubieren Fügen Sie im Kontroll-Vertiefungen nur 100 µL PBS-BSA.
Hinweis: Das Lph gen Kodierung PH von Hif wurde durch PCR verstärkt und in den pET26b Ausdruck Vektor, der einen 6 × His-Tag am C-Terminus des Proteins ausgedrückt fügt geklont. Der rekombinante Vektor verwandelte sich in E. Coli BL21(DE3) für Ausdruck. NI-NTA-Harz wurde verwendet, um das rekombinante Protein15zu reinigen. - Die Proteinlösung verwerfen und die ungebundenen Proteine durch die Brunnen dreimal mit 300 µL pro Bohrloch PBST Waschen zu entfernen. Hinzufügen von 100 µL PBS-BSA mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Anti-His pAbs (01:10, 000 Verdünnung) und 1 h bei RT inkubieren
- Bereiten Sie 20 mM Lösung A durch Tetramethylbenzidine in einer Lösung von 5 % Aceton und 45 % Methanol auflösen. Zur Vorbereitung der Lösung B lösen Sie 19,2 g Zitronensäure in 1.000 mL H2O, stellen Sie den pH-Wert auf 4,25 durch Zugabe von KOH, dann fügen Sie 230 µL 30 % H2O2. Speichern Sie beide Lösungen im Dunkeln bei RT Kurz vor dem Einsatz mischen Sie 500 µL Lösung B mit 9,5 mL der Lösung A, das ELISA-Erkennung-Reagenz vorzubereiten.
- Waschen Sie die Brunnen dreimal mit 300 µL PBST pro Bohrloch und erkennen Sie Antigen-Antikörper-komplexe durch Zugabe von 100 µL ELISA Erkennung Reagenz in jede Vertiefung zu.
- Fügen Sie 50 µL 1 M H2SO4/well, die Reaktion zu stoppen. Messung die optische Dichte der Brunnen bei 450 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.
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Studie der Interaktion Kinetik der rekombinanten PH und VL mit BLI
- Menschlichen Vn auf Amin-reaktive Sensoren verwenden das Amin Kupplung Methode, gemäß des Herstellers Leitlinien11zu immobilisieren.
- Mit PBS, seriell verdünnen Sie den Liganden (rekombinante PH) von 0 bis 4 µM und übertragen Sie die daraus resultierenden Lösungen auf einer 96-Well schwarz, flach-Boden Mikrotiterplatte. Führen Sie das Experiment, bei 30 ° C mit einem BLI Instrument17.
- Laden Sie den Data-Ordner in der BLI-Daten-Analyse-Software. Wählen Sie die Option "Sensorauswahl" . Dann wählen Sie "Referenz gut' (VL-beschichtete Sensor mit PBS-Puffer) für die Subtraktion.
- Wählen Sie "Y-Achse zur Basislinie ausrichten" und "interstep Korrektur und Verband auszurichten". Drücken Sie auf "Prozessdaten", die automatisch die Registerkarte "Analyse öffnet".
- In der Registerkarte "Analyse" die Option "Assoziation und Dissoziation" unter Kurvenanpassung. Wählen Sie das Modell "1:1-Bindung und globale Fitting". Drücken Sie "fit Kurve" und Exportieren Daten17passend.
2. Charakterisierung der Rolle der Vn in der bakterielle Haftfähigkeit
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Untersuchung der bakteriellen Einhaltung der Vn-beschichtete Glasoberflächen
- Bereiten Sie eine 2 µg/mL Lösung der Vn in PBS und pipettieren 10 µL dieser Lösung auf dem Glas Mikroskop als einen einzigen Tropfen zu schieben. Lassen Sie die Tropfen auf der Folie für 30 min bei RT. Mantel eine Folie mit menschlichen Serum Albumin (HSA) Trocknen als Negativkontrolle.
- Waschen Sie die Protein-beschichtete Glasplatten durch Eintauchen der Folien für zwei Sekunden in einen Becher mit PBS entfernen Sie überschüssiges Protein ungestrichenes dreimal. Fügen Sie 20 mL frische Hif-Kultur (im Schritt 1.1.1 beschrieben) in eine sterile Petrischale aus Kunststoff und Tauchen die Vn- / HSA-beschichtete Glas gleitet in das Kulturmedium. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° C für 1 h unter Schütteln bei 20 u/min.
Hinweis: Hif M10 und Hif M10ΔLph wurden in flüssigen BHI-Medium oder auf Schokolade Agarplatten gewachsen. Das Medium für die Lph -Mutante wurde mit 10 µg/mL Kanamycin15ergänzt. - Entfernen Sie nach der Inkubation alle ungebundenen Bakterien durch Eintauchen der Folien dreimal in einen Becher gefüllt mit PBS. Visualisieren Sie Bakterien durch gramfärbung, wie beschrieben.
- Entfernen Sie überschüssige PBS aus jeder Folie durch Kippen und berühren den Rand auf Seidenpapier. An der Luft Trocknen der Folien für 3-5 min bei RT und haftende Bakterien zu beheben, indem man jedes Dia dreimal über einer Flamme.
- Halten Sie die Folie an den Rändern mit zwei Fingern auf einem Tablett Färbung und Tropfen Sie 3 – 4 (200 – 300 µL) 2,3 % Kristallviolett-Lösung. Warten Sie 60 s, dann die Folien unter einen sanften Strom von Hahn für 3 – 4 s Wasser zu waschen.
- 3 – 4 Tropfen von 0,33 % Jod-Lösung auf den Objektträger. 1 min warten, dann die Folie unter einen sanften Strom von Wasser aus dem Wasserhahn abspülen. Trocknen Sie sorgfältig die Folien durch Löschpapier.
- 3 – 4 Tropfen der Aufhellung Lösung mit 75 % Isopropyl-Alkohol und 25 % Aceton auf der Folie. Abspülen Sie nach 5 – 10 s Objektträger unter einen sanften Strom von Wasser aus dem Wasserhahn.
- Fügen Sie 3 – 4 Tropfen (200 – 300 µL) grundlegende Carbolfuchsin Lösung. 1 min warten, dann die Folien unter einen sanften Strom von Wasser aus dem Wasserhahn abspülen. Trocknen Sie die Folien mit Löschpapier.
- Visualisieren Sie die Bakterien unter einem Lichtmikroskop, Auswahl einer Öl-Immersion-Objektivs 100 X Vergrößerung18. Vergleichen Sie die Einhaltung von Hif WT und mutierten Bakterien auf den Vn und HSA-beschichtete Glasoberflächen.
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Studie des Vn-abhängige Einhaltung von Bakterien Epithelzellen
Hinweis: Diese effiziente Einhaltung-Assay wurde in unserem vorherigen Studien4,7eingesetzt.- Kultur A549 Zellen (Typ II alveolären Epithelzellen) in einem 75-cm2 Gewebekultur Kolben mit F12 Medium mit 10 % (Vol/Vol) fetalen Kälberserum (FCS) (komplette Medium) und 5 µg/mL Gentamicin ergänzt. 3 Tage bis zu 80 % Zusammenfluss den Kolben in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C inkubieren (Konfluenz abgeschätzt werden durch die Visualisierung Flächendeckung durch die Zellen mit inversen Mikroskop). Die folgenden vier Schritte beschreiben, wie die Epithelzellen der Assay-19,-20vorzubereiten.
- Waschen Sie die Zelle Monolayer in den Kolben zweimal mit 20 mL PBS durch sanftes schütteln. Um die Zellen von der Oberfläche der Küvette abzunehmen, fügen Sie 2 mL Enzymlösung Zelle Ablösung und inkubieren den Kolben für 5 min bei 37 ° c Tippen Sie auf den Kolben mit der Handfläche, alle Zellen aus der Kunststoffoberfläche zu lösen. Pipette nach oben und unten ein paar Mal zu Zelle Klumpen zu zerstreuen.
- Der Kolben 18 mL F12 komplette Medium hinzu und übertragen Sie die gesamte Zellsuspension auf eine 50 mL steriles Falcon Röhrchen. Die Zellsuspension für 5 min bei RT 200 X g Zentrifugieren und den überstand verwerfen. Die Zelle Pellet in 10 mL F12 komplette Medium aufzuwirbeln.
- Entfernen Sie 10 µL Zellsuspension und legen Sie sie in ein Eppendorf-Röhrchen, dann 90 µL Trypan blau-Lösung. Laden Sie die Probe in ein Hemocytometer (Tiefe 0,1 mm) nach der Platzierung des Deckglases.
- Zählen alle lebensfähige Zellen in den Bereichen A, B, C und D (jedes Feld besteht aus 16 Quadrate, und jeder Platz hat eine Fläche von 0,0025 mm2), dann berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Zellen ([A + B + C + D] / 4). Berechnen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter unter Verwendung der folgenden Gleichung:
Lebensfähige Zellen/mL = durchschnittliche Zelle zählen 10 ×4 × Verdünnung Faktor20.
Hinweis: Hier ist der Verdünnungsfaktor 10. - Verdünnen Sie die Zellsuspension auf 5,0 x 103 Zellen/mL mit komplette mittlere enthält 5 µg/mL Gentamicin. 500 μl Zellsuspension in jede Vertiefung eine Kultur 24 Wohlen Zellplatte zu verzichten. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in 5 % CO2 , bis die Zellen 90 % Zusammenfluss sind.
- Entfernen Sie vor der bakteriellen Infektion das Medium aus dem Brunnen und fügen Sie F12 Medium (ohne FCS), dann über Nacht bei 37 ° c inkubieren
- Waschen Sie der Zelle Monolage dreimal mit 500 µL PBS an RT. Stelle der Platte auf dem Eis und 100 µL vorgekühlt F12-Medium mit 10 µg/mL VL. Incubate Platte bei 4 ° C für 1 h. Fügen Sie für Kontroll-Vertiefungen nur F12 Medium.
- Nach der Inkubation, verwerfen die Lösung durch pipettieren und Waschen der Zellschicht zweimal mit 1 mL PBS bei RT Aufschwemmen eine Kultur der frisch gewachsenen Hif M10 (Schritt 1.1.1) in F12 Medium (2 × 108 KBE/mL). Jedes gut 100 µL dieser Bakteriensuspension hinzu und inkubieren die Platte für 2 h bei 37 ° c
Hinweis: Jede enthält nun ca. 2 x 105 A549 Zellen. Für eine Infektion, 2 x 107 bakterielle KBE wurden hinzugefügt, eine Vielzahl von Infektionen von 100 entspricht. - Entfernen Sie das Medium durch pipettieren und waschen Sie die Epithelzellen A549 dreimal mit PBS. Fügen Sie 50 µL/Well Zelle Ablösung Lösung und inkubieren die Platte für 5 min bei 37 ° c
- Fügen Sie dann 50 µL F12 komplette Medium pro Bohrloch, die enzymatische Reaktion zu stoppen. Übertragen Sie die Epithelzellen (≈100 μL [d.h., das gesamte Volumen]) aus jedem Brunnen, ein 6-mL-Glasrohr mit vier Glasperlen. Lyse der Zellen bei RT durch Vortexen 2 min. lang.
- 10 µL der Zelle lysate 100fach verdünnt durch Zugabe von 10 µL lysate, 990 µL F12 Medium. Platte 10 µL der verdünnten Probe auf eine Schokolade nährbodenplatte.
- Über Nacht inkubieren Sie die Schokolade nährbodenplatte bei 37 ° C, dann zählen Sie die Kolonien. Jede Kolonie stellt eine KBE.
- Kultur A549 Zellen (Typ II alveolären Epithelzellen) in einem 75-cm2 Gewebekultur Kolben mit F12 Medium mit 10 % (Vol/Vol) fetalen Kälberserum (FCS) (komplette Medium) und 5 µg/mL Gentamicin ergänzt. 3 Tage bis zu 80 % Zusammenfluss den Kolben in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C inkubieren (Konfluenz abgeschätzt werden durch die Visualisierung Flächendeckung durch die Zellen mit inversen Mikroskop). Die folgenden vier Schritte beschreiben, wie die Epithelzellen der Assay-19,-20vorzubereiten.
3. Analyse der Vn-abhängigen Widerstand gegen die bakterizide Aktivität von Humanserum
- Kauf-NHS aus kommerziellen Quellen. VDS als zuvor beschriebenen12vorbereiten. Auffüllen der VDS mit 180 nM Vn, die Vn im NHS entspricht.
- Bereiten Sie Hitze-inaktivierten Serum (KIS) durch Erhitzen von NHS bei 56 ° C für 30 min um Ergänzungs-Proteine inaktivieren.
Hinweis: Die optimale Serumkonzentration (5 %) und die Inkubationszeit (15 min) zum Test in Schritten 3.3 – 3.7 beschrieben wurden empirisch ermittelt für Hif15; diese Parameter könnte für andere bakterielle Erreger variieren. - Kultur von Bakterien (in diesem Fall, Hif M10 und der Mutant Hif M10ΔLph), Mid Log-Phase (OD600 = 0,3). Pellet-Bakterien durch Zentrifugation bei 3.500 X g für 10 Minuten.
- Die bakterielle Pellet mit 1 Volumen von Dextrose Gelatine Veronal Puffer (angehört++; pH 7.3) mit 2,5 % (w/V) Glukose, 2 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2und 0,1 % (wt/Vol) Gelatine aufzuwirbeln.
- Hinzufügen von 1,5 x 103 KBE von Bakterien zu 100 µL angehört++ mit 5 % Serum (NHS, seine, VDS, oder VDS + 180 nM Vn). Inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 15 min mit schütteln bei 300 u/min.
- Entfernen Sie eine 10 µL aliquoten aus der Reaktionsmischung bei 0 min (T0 Probe) und 15 min (Tt Probe) und Platte auf Schokolade Agar. Über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C.
- Nach der Inkubation zählen der Kolonien auf der Platte erscheinen. Der Anteil der Bakterien getötet12 unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: (KBE bei Tt) / (KBE bei T0) × 100.
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Representative Results
VN-Bindung an der Oberfläche der Bakterien wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Alle klinische Isolaten in dieser Studie getestet Hif rekrutiert Vn an der Zelloberfläche. Keine Interaktion des Vn mit der Zelloberfläche wurde für die E. Coli Negativkontrolle Belastung (Abb. 1A) beobachtet. Wie in Abbildung 1B, ist PH eine große VL-bindendes Protein auf der Oberfläche des Hif Zellen. Bindung des Vn der WT Hif-Stamm verursacht M10 eine Verschiebung in der Bevölkerung, während Hif M10ΔLph VL nicht binden und mit dem-Steuerelement erschien.
Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen PH und VL wurden von ELISA und BLI geschätzt. Rekombinante PH durfte mit menschlichen Faktor H, VL und C4BP binden (Negativkontrolle) beschichtet auf die Vertiefungen der Mikrotiter-ELISA-Platten. Gebunden PH wurde geschätzt, mit einem Anti-His pAbs. Die Ergebnisse zeigten deutlich eine signifikante Wechselwirkung zwischen PH und VL und Faktor H, im Vergleich zu C4BP (Abb. 2A). Interaktion zwischen PH und VL wurden geschätzt, in Echtzeit mit BLI. Abbildung 2 B zeigt PH Bindung Wirkungs-Kurven für die Vn-beschichteten Sensoroberfläche. Verbindliche Affinität (in diesem Fall, Kd = 2,2 µM) wurde durch die Anpassung der Daten an stationären verbindliche Kinetik geschätzt.
Bakterien fehlen Ausdruck des pH-Wertes auf der Zelloberfläche (Hif M10ΔLph) ausgestellt reduziert Einhaltung der Vn-beschichtete Glasoberflächen im Vergleich zu WT-Zellen(Abbildung 3). Darüber hinaus verbessert die Präsenz der Vn auf der Oberfläche der Epithelzellen deutlich die Einhaltung von Hif (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse zeigten, dass die PH-Vn-Interaktion wesentlich zur Einhaltung der bakteriellen beigetragen.
VL ist ein bekannter Ergänzung-Hemmer. Um die Ergänzung-hemmende Aktivität zu schätzen, Serum-vermittelten Tötung wurde untersucht, in Anwesenheit und Abwesenheit von VL. WT Hif Zellen ausgestellt höhere Serum-Widerstand als M10ΔLph mutierten Zellen. Keine Bakterien wurden im Beisein seiner (Abb. 4A) getötet. Interessanterweise, WT Hif stellte reduzierte Überleben in VDS und Auffüllung der Vn erhöhte bakterielle überleben. Jedoch hat die Hif M10ΔLph Belastung auf VL Erschöpfung nicht reagiert, weil es VL an der Zelloberfläche (Abbildung 4B) nicht rekrutieren konnte. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass Vn eine wichtige Host-Faktor ist, der Komplement-vermittelten Tötung (Abbildung 4A-B) Bakterien schützt.
Abbildung 1 : Haemophilus influenzae Serotyp f bindet Vn über pH Oberfläche ausgedrückt. (A) Flow Cytometry Ergebnisse zeigen Bindung des Vn an Zellen von Hif klinischen Isolaten. Jeder klinische Isolate (5 x 106 KBE) wurde mit 250 nM-Mensch, VL. gebundenen Liganden erkannt wurde über eine Anti-Vn pAbs Schafe und Esel FITC-konjugierten Anti-Schafe Sekundärantikörper, inkubiert. Escherichia coli BL21 (DE3) wurde als Negativkontrolle. Daten werden dargestellt, wie der mittlere Fluoreszenzintensität von dreifacher Analysen in drei separaten Experimente und Fehlerbalken darzustellen SD (B) Flow Cytometry Histogramme zeigen Bindung von Vn an der Oberfläche des WT Hif M10 und PH-Löschung Hif M10Δ LPH Mutant. Repräsentative Daten aus einer von drei separaten Experimenten werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Rekombinante PH bindet an VL. (A), ELISA-Ergebnisse zeigen die Bindung des rekombinanten PH Vn, FH und C4BP. FH diente als Positivkontrolle, während C4BP als Negativkontrolle verwendet wurde. Um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu analysieren, VL, FH und C4BP wurden in äquimolaren beschichtet (50 nM) Konzentration auf die Brunnen von Mikrotiterplatten. Als nächstes 50 nM rekombinante, PH-His6x hinzugefügt wurde. Gebunden PH mit einer HRP-konjugierten Anti-His pAbs erkannt wurde. Angezeigten Daten sind die Mittel von dreifacher Analysen aus drei unabhängigen Experimenten und Fehlerbalken zeigen SD ***, P≤0.001. (B) BLIanalysis PH Bindung an VL: rekombinante VL war auf AR2G Sensoren und die verbindliche Kinetik der PH immobilisiert (0,25-4 µM), VL verzeichneten mit dem BLI-Instrument. Die Gleichgewicht Affinität Konstante wurde anhand Signale für jede Konzentration im Gleichgewicht erhalten und die Daten wurden laut Steady-State Kinetik ausgestattet. Das Experiment wurde dreimal wiederholt, und ein repräsentativer Datensatz wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Interaktion zwischen PH und VL steigert bakteriellen Einhaltung von Glasflächen und Epithelzellen. (A) leichte mikroskopische Aufnahmen zeigen, Einhaltung von Hif Vn-beschichtete Glasplatten. Bakterien wurden visualisiert durch gramfärbung. Repräsentative Bilder von einem der drei unabhängigen Experimenten werden angezeigt. Dieses Panel wurde zuvor im Journal of Immunology7 veröffentlicht und ist hier mit freundlicher Genehmigung von der American Association Immunologen wiedergegeben. (B) die Einhaltung der WT Hif M10 Zellen, Epithelzellen A549 in an- und Abwesenheit des Vn, Mittel, dreifacher Analysen aus drei unabhängigen Experimenten werden grafisch dargestellt und Fehlerbalken darzustellen SD *, p ≤0.05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Vn an der Zelloberfläche Hif rekrutiert schützt Bakterien aus Serum-vermittelten Tötung. (A) WT Hif M10 und Mutant Hif M10ΔLph wurden für 15 min in 5 % NHS oder seine inkubiert. (B) Widerstand der Hif M10 und Hif M10ΔLph , Bakterizide Wirkungen in 5 % VDS und VDS ergänzt mit 250 nM gereinigt VL. Daten repräsentieren dreifacher Analysen aus drei unabhängigen Experimenten und Fehlerbalken zeigen SD ***, p ≤0.001; NS, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Bakterielle Krankheitserreger rekrutieren Vn an der Zelloberfläche und Ergänzung der Regler zur Verhinderung der Ablagerung von Komplementfaktoren und Fertigstellung der Membrane Angriff Komplex2zu nutzen. VL fungiert auch als eine Brücke Molekül zwischen bakteriellen Oberflächenproteine und Host-Zell-Oberfläche Rezeptoren, so dass Krankheitserreger an der Oberfläche der Epithelzellen haften und anschließend vermitteln Verinnerlichung. In dieser Studie beschreiben wir Protokolle, die verwendet werden, um (i) Bindung des Vn an der Oberfläche von Bakterienzellen, Ii) Protein-Protein-Wechselwirkungen und Affinität Konstanten und (Iii) die funktionale Rolle der Vn schätzen bei der Bereitstellung von Serum Widerstand und die Verbesserung der Festhalten an der Oberfläche der Wirtszellen.
Durchflusszytometrie ist eine quantitative Verfahren häufig verwendet, um sicherzustellen, dass Bakterien Vn binden. Allerdings muss die Vn-Konzentration optimiert werden, da die Vn-Bindungskapazität (und verschiedene Rezeptoren) abhängig von der bakteriellen Spezies unterschiedlich sein können. Im hier beschriebenen Test wurden 1 – 100 µg/mL der Vn verwendet, um lineare Bindung und Sättigung Parameter zu schätzen. Vergleich der verbindliche Muster von WT Hif, Hif M10ΔLph Mutant und Negativkontrolle E. Coli Zellen zeigte einen deutlichen Unterschied bei einer VL-Konzentration von 20 µg/mL (250 nM). Daher wurde diese Konzentration in allen Flow Cytometry Experimente verwendet. Die Verwendung von VL bei Konzentrationen über den Sättigungspunkt konnte falsch-Positive Signale erzeugen. Verdünnung der primären und sekundären Antikörper muss auch separat für jeden Erreger optimiert werden. Die maximale Verdünnung der Antikörper zeigen ein gutes Signal sollte gewählt werden. In dieser Studie haben wir 2,5 % BSA als ein blockierungsmittel verwendet. BSA ist jedoch keine universelle blockierende Reagenz geeignet für alle Krankheitserreger. In Fällen, in denen BSA unspezifische Antikörper Interaktionen nicht blockiert wird, können andere blockierenden Reagenzien verwendet werden, z. B. fischgelatine. Bindung des Vn an der Oberfläche der bakterielle Erreger Zellen wird oft durch mehrere Rezeptoren21,22vermittelt. Einige Rezeptoren haben hohe VL-Bindungsaffinität, während andere niedrige Bindungsaffinität aufweisen können. Löschung von nur einem Gen Kodierung eine Oberfläche Protein kann somit keinen Rückgang der Vn Interaktionen von Durchflusszytometrie bewertet führen. Alternativ zur Durchflusszytometrie kann Proteinbindung auf der bakteriellen Zellenoberfläche mittels Immunfluoreszenz-Assay (IFA) oder Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) untersucht werden. Obwohl Immunofluoreszenz von Fluororeagent-konjugierten Antikörpern in Durchflusszytometrie und IFAs problematisch sein kann, beinhaltet TEM umständlich Probenvorbereitung mit erheblichen Risiko der Einschleppung von Artefakten23,24. Flow-zytometrie-Analyse ist in der Tat vorzuziehen, IFA und TEM aufgrund einfacher Beispiel Vorbereitung Protokolle und die Möglichkeit des Testens viele Proben innerhalb eines kurzen Zeitrahmens.
Protein-Protein-Interaktionen in einer Zelle freies System analysiert wurden durch ELISA (Abb. 2A) und BLI (Abbildung 2B). In beiden dieser Techniken war eines der Bindungspartner immobilisiert, entweder auf einem Biosensor (für BLI) oder einer Mikrotiterplatte (ELISA). Der Vorteil von BLI und ELISA ist, dass sie ermöglichen eine Analyse von Protein-Protein-Interaktionen in ihrem nativen Zustand, unspezifische Interaktionen außerhalb der aktive Bindungsstelle zu verhindern. Das Dienstprogramm von BLI, kann jedoch je nach der verwendeten Technik der Immobilisierung beschränkt werden. Das Amin Kupplung Verfahren hier nach dem Zufallsprinzip bildet eine Amid-Bindung zwischen jeder Oberfläche ausgesetzt Amingruppe des Proteins und der Oberfläche der Biosensor. Dies führt zu Immobilisierung von Protein-Moleküle auf der Oberfläche des Sensors in verschiedenen Ausrichtungen. Dadurch können heterogene Bindung, die nicht über ein 1:1-Bindung-Kinetik-Modell passt. Dieses potentielle Problem kann gelöst werden, indem Sie Biotin Sensoren auswählen und Hinzufügen eines Streptavidin-Tags in das rekombinante Protein immobilisiert werden. Die Zuverlässigkeit von BLI ist ähnlich dem von Oberflächenplasmonenresonanz (SPR). Die Assoziation und Dissoziation von Molekülen können in Echtzeit mit beiden Verfahren gemessen werden. Jedoch das BLI-Gerät verwendet keine Mikrofluidik und ist daher leicht zu pflegen. Darüber hinaus können 96 Interaktionen gleichzeitig in BLI getestet werden während nur vier Proben gleichzeitig getestet werden können, mit SPR Es gibt einen weiteren wichtiger Schritt in BLI, die optimiert werden muss. Wenn Sensoren wiederverwendet werden, sollte auch Regeneration Bedingungen optimiert werden, da, die für jedes Protein-Protein-komplexe variieren könnten. In dieser Studie ergab 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure geeignet für Sensor-Regeneration.
Die Rolle der Vn in bakteriellen Einhaltung wurde direkt mit Glasflächen beschichtet mit Vn getestet. Dieser Ansatz kann eingesetzt werden, um verbindlich für alle bakteriellen Erreger analysieren einschließlich sowohl gram-positiven Bakterien. Dies ist eine semiquantitative Technik, die schnelle Bewertung eines Erregers Fähigkeit zur Bindung, VL. Um vernünftige Ergebnisse zu erhalten, muss der Vn Beschichtung optimiert werden. In der hier beschriebenen Test Beschichtung mit Vn bei 1, 2 und 5 µg/mL wurde untersucht, und 2 µg/mL wurde festgestellt, dass die am besten geeignete Konzentration für die Experimente in dieser Studie(Abbildung 3). Überschüssige Vn beschichtet die Oberfläche könnte eine dicke Schicht erstellen, die während der Probe Fixierung und Färbung leicht abgestreift werden kann. Darüber hinaus sollten die Bakterienkultur keinen großen Klumpen von Zellen; Dies kann vermieden werden durch aufschütteln die Kultur bevor Sie die Folien eine Aliquote hinzufügen.
Bakterielle festhalten an der Oberfläche der Epithelzellen wurde geprüft mit einer Keimzahl Technik(Abbildung 3). Dieser Test muss auch sorgfältig optimiert werden, um Beobachtung der Rolle der Vn in der bakterielle Haftfähigkeit zu ermöglichen. VL hat verschiedene Bindungsstellen für Bakterien (am C-Terminus) und Zelle Oberfläche Integrin-Rezeptoren (auf der N-terminalen RGD-Bindungsstelle). Bindung des Vn an Integrine induziert Signal- und Aufnahme der Integrin-Vn komplexe1. Wenn solche komplexe ohne Bakterien internalisiert werden, werden Ergebnisse schwer zu interpretieren. Daher muss Vn die Epithelzelle Monolage bei 4 ° c hinzugefügt werden VL Integrin-Rezeptoren an der Oberfläche der Epithelzelle gesättigt hat, muss überschüssige Vn ab, gewaschen werden, da kostenlose Vn bakterielle Vn-abhängige Integrin Bindung blockieren kann. In diesem Test wurde geschätzt insgesamt bakterielle zählt mit Epithelzellen (d.h.das Auslesen umfasste sowohl Oberfläche befestigt und verinnerlicht Bakterien). Dieser Test kann zur Unterscheidung zwischen externen und intrazellulären Bakterienpopulationen durch Behandlung mit Gentamicin4erweitert werden.
Der Serum bakterizide Assay verwendet in dem hier beschriebenen Protokoll wurde teilweise von den bisher veröffentlichten Verfahren12,22geändert. Im Test beschriebenen hier 1,5 x 103 KBE Hif mit 5 % NHS für 15 min, 5 min länger als bei den zuvor beschriebenen Assay (Abb. 4A) inkubiert wurden. Der Unterschied zwischen WT Hif und der isogenen Mutante frei von PH war deutlicher bei 15 min als 10 min. Daher haben wir die 15 min Inkubationszeit für dieses besondere Experiment ausgewählt. Die bakterizide Wirkung des Serums ist abhängig von der Serum-Konzentration, Inkubation und Anzahl der Bakterien. Alle Krankheitserreger zeigen eine bemerkenswerte Kapazität für die bakterizide Aktivität des Serums zu vermeiden; einige Krankheitserreger kann völlig resistent gegen Serum, während andere mäßig resistent oder empfindlich sein können. Die Serum-Konzentration muss daher für jeden spezifischen Erreger untersucht optimiert werden. Dennoch ist das Serum töten Assay hier beschriebenen beschränkt sich auf die Untersuchung von Gram-negativen Bakterien, da Serum keine deutliche bakterizide Wirkung auf grampositive Zellen1,5 hat.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der Stiftung Anna und Edwin Berger, Lars Hierta, O.E und Edla Johansson Stiftung, dem schwedischen Medical Research Council (gewähren Nummer K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), der Krebs-Stiftung an der Universität Krankenhaus in Malmö, die Physiographische Gesellschaft (Forssman Stiftung) und Skåne County Council Research and Development Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
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