Summary
ويصف هذا التقرير بروتوكولات لوصف التفاعلات بين البروتينات الغشاء الخارجي البكتيرية وفيترونيكتين منظم لتكملة البشرية. يمكن استخدام البروتوكولات لدراسة ردود فعل ملزم والوظيفة البيولوجية فيترونيكتين في أي من الأنواع البكتيرية.
Abstract
استخدام البكتيريا المنظمين تكملة كوسيلة للتهرب من الاستجابة المناعية المضيف. هنا، نحن وصف بروتوكولات لتقييم اكتساب دور فيترونيكتين في اللعب سطح الخلية البكتيرية في مقاومة المضيف الجهاز المناعي. التدفق الخلوي تجارب اعتبرت فيترونيكتين البلازما البشرية يجند للبروتين الغشاء الخارجي مستقبلات البكتيرية ح من النزلية من نوع f. كان يعمل مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم لتوصيف البروتين-بروتين التفاعلات بين البروتين المنقي المؤتلف ح وفيترونيكتين، وملزمة تقارب تم تقييم استخدام قياس التداخل بيو-طبقة. وأكد الأهمية البيولوجية لربط فيترونيكتين للبروتين ح على سطح الخلية البكتيرية في تهرب الاستجابة المناعية المضيف باستخدام مقايسة مقاومة مصل مع مصل الدم البشري الطبيعي والمنضب فيترونيكتين. وقد تم تحليل أهمية فيترونيكتين في التقيد البكتيرية باستخدام الشرائح الزجاجية مع أو بدون طلاء فيترونيكتين، متبوعاً بصبغة غرام. وأخيراً، كان التحقيق التصاق البكتيريا إلى مونولاييرس الخلايا الظهارية السنخية البشرية. البروتوكولات المذكورة هنا يمكن تكييفها بسهولة لدراسة أي الأنواع البكتيرية من الفائدة.
Introduction
فيترونيكتين (Vn) بروتين سكري بشرية هامة مشاركة في الحفاظ على التوازن عن طريق تنظيم النظام فيبرينوليتيك. Vn يعمل أيضا كمنظم تكملة عن طريق تثبيط في مسار تكملة المحطة الطرفية أثناء تكوين مجمع C5b6-7 والبلمره C9. أظهرت العديد من مسببات الأمراض البكتيرية لتجنيد Vn إلى سطح الخلية كوسيلة لتكملة مقاومة ترسب1،2،3. وبالإضافة إلى ذلك، يعمل Vn كجزيء "ساندويتش" بين البكتيريا والمضيف مستقبلات الخلايا الظهارية، وبالتالي تعزيز الالتزام واستيعاب العوامل الممرضة2،،من45. هو وساطة ملزمة Vn إلى سطح الخلية البكتيرية من البروتينات الأخرى مجهولة حاليا. توضيح دور وظيفي Vn-ملزمة في تهرب الاستجابة المناعية خرطوم الكامل سيتطلب تحديد البروتينات تجنيد Vn.
الخطوة الأولى في تحديد البروتينات Vn-ملزم اختبار ما إذا كان رض فائدة يمكن ربط المنقي Vn. التدفق الخلوي وسيلة مريحة وبسيطة لتحديد ما إذا كان Vn منضماً إلى خلايا الكائنات الممرضة. في هذه الدراسة، قمنا بتقييم ربط Vn إلى مختلف النزلية من نوع f (منطقياً) يعزل السريرية6. الأسلوب الموصوفة هنا هو الكمية، ويمكن استخدامها للتمييز بين القدرة الملزمة لمجموعة متنوعة من السلالات البكتيرية. في دراسة سابقة، ونحن تتميز البروتين ح (PH) منطقياً ك بروتين ملزمة Vn7. ولذلك، في هذه الدراسة، كانت مقارنة إمكانات Vn-الربط البرية من نوع (WT) منطقياً و M10Δ سكانية طفراتlph استخدام البروتوكولات وصف.
بمجرد ما تقرر أن يربط ممرض Vn، والخطوة الثانية لتوصيف البروتين السطحي بغية تحديد المحتملة Vn-ملزم البروتينات. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من النهج لهذا الغرض8،9، ولكن لم يرد وصف هذه المنهجيات في هذا التقرير. هو الأسلوب الأكثر ملاءمة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين للتعبير عن البروتينات السطحية البكتيرية المحدد في كولاي ريكومبينانتلي وتنقية بالتقارب اللوني. هنا، نحن نستخدم درجة الحموضة وتفاعله الجزيئية مع Vn لتوضيح الأسلوب. التفاعلات بين المؤتلف الأس الهيدروجيني و Vn اتسمت باستخدام المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا)7 ووضعت مؤخرا خالية من تسمية تقنية تعرف باسم بيو-طبقة قياس التداخل (BLI)10،11. بينما يمكن استخدام الساس لتأكيد تفاعلات البروتين البروتين، BLI يوفر بيانات مفصلة فيما يتعلق بمعايير التفاعلات الحركية.
لدراسة دور وظيفي Vn في الانضمام البكتيرية، يمكن الاستفادة من فحوصات مختلفة اثنين. الفحص الأولى الموصوفة هنا هو القياس المباشر للبكتيريا التمسك الأسطح الزجاجية المغلفة Vn، حين المقايسة الثانية يدرس الانضمام إلى سطح الخلايا الظهارية. للفحص الأولى، كانت مغلفة بالشرائح الزجاجية مع Vn، وتم تقييم الربط WT أو متحولة منطقياً سلالات غرام-وصمة عار والفحص المجهري. ويميز هذا الأسلوب سهولة البكتيريا على أساس القدرة ربط Vn12. وقد تم تحليل التصاق البكتيريا لخلايا الثدييات ثم بإضافة البكتيريا المستزرعة على أحادي الطبقة من نوع الخلايا الظهارية السنخية الثاني؛ تم تقييم مرفق البكتيرية بإحصاء عدد تشكيل مستعمرة وحدات (كفوس). يمكن تمييزها في وجود أو عدم وجود4،Vn13البكتيريا المدخلة والتقيد بها.
تم تقييم دور اكتساب Vn في المقاومة البكتيرية المصل باستخدام مقايسة قتل مصل (أي، نشاط جراثيم المصل). لتقييم أهمية اكتساب Vn في المقاومة المصل، نشاط جراثيم المنضب Vn المصل (VDS) كان بالمقارنة بالمصل الإنسان العادي (NHS). الطريقة المستخدمة بسهولة يميز Vn-ملزم مقابل البكتيريا غير ملزمة استناداً إلى المقاومة المصل. لقد استخدمت هذه الطريقة لدراسة دور Vn في المقاومة المصل لعدة مسببات الأمراض البكتيرية4،12.
وأبلغ أساليب عديدة لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض. وهنا يصف لنا مجموعة من البروتوكولات التي يمكن تكييفها بسهولة لدراسة أي مسببات المرض بغية تقييم دور Vn في الآلية المرضية. وقمنا باختبار هذه البروتوكولات باستخدام مسببات الأمراض المختلفة، واختير منطقياً كمثال لهذا التقرير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تحليل Vn كما يجند بروتين سطحي البكتيري
-
كشف ملزم Vn في السطح البكتيرية باستخدام التدفق الخلوي
ملاحظة: في التدفق الخلوي، كنا الجانب مبعثر ومبعثر الأمام بوابة الأحداث الإيجابية. يعزل منطقياً السريرية لدراسة التفاعلات مع Vn، (n = 10) وقد تم اختيار7 جنبا إلى جنب مع BL21 كولاي (DE3) كعنصر تحكم سلبية (الشكل 1أ).- ثقافة سكانية السريرية يعزل في المخ-القلب ضخ (بهي) المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكروغرام/مل ند وهيمن على 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة. استخدام لوريا بيرتاني المتوسطة للثقافة كولاي14. حصاد منطقياً في سجل منتصف المرحلة (OD600 = 0.3)15، وريسوسبيند البكتيريا في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، الرقم الهيدروجيني 7.2، يحتوي على 1% (w/v) ألبومين المصل البقري (BSA) (حظر المخزن المؤقت؛ ببسبسا). ضبط التعليق إلى 109 زيمبابوي/مل.
- نقل مختبرين يحتوي على 5 × 106 زيمبابوي إلى 5 مل أنابيب مستديرة القاع البوليستيرين (12 × 75 مم2) وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت لحظر. الطرد المركزي بتعليق في 3,500 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT)16 لمدة 5 دقائق بيليه البكتيريا، ثم نضح بعناية لإزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه.
- ريسوسبيند الكريات البكتيرية مع 50 ميكروليتر من حظر مخزن يحتوي على 250 نانومتر Vn واحتضان العينات ح 1 في RT دون المصافحة. وبعد الحضانة، بيليه البكتيريا بالطرد المركزي في س 3,500 ز لمدة 5 دقائق، ثم تغسل الكريات ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني والطرد المركزي خطوات مماثلة.
- لبيليه البكتيرية، إضافة 50 ميكروليتر من الأغنام الابتدائي الإنسان المضادة Vn [بولكلونل] أجسام (pAbs) في تمييع 1: 100 في برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة. احتضان التعليق ح 1 في الرايت، ثم يغسل البكتيريا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة غير منضم (كما هو موضح في الخطوة 1-1-3).
- بعد ذلك إضافة 50 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة الذي يتضمن fluorescein isothiocyanate (فيتك)-مترافق حمار الغنم المضادة pAbs (تخفيف 1: 100)، واحتضان في RT ح 1 في الظلام.
- إعداد عنصر تحكم فارغ بحضانة البكتيريا مع حجب المخزن المؤقت فقط و pAbs دون Vn.
- يغسل البكتيريا ثلاث مرات مع 1 مل من المخزن المؤقت لحظر وبيليه التعليق بالطرد المركزي، كما هو موضح في القسم 1.1.2. وأخيراً، ريسوسبيند بيليه البكتيرية مع 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وتحليلها بالتدفق الخلوي7.
-
أليسا تحليل التفاعل بين درجة الحموضة المؤتلف و Vn
ملاحظة: عناصر تحكم تحتاج إلى إدراجها باستبعاد ملزمة غير محدد. الإنسان عامل ح (FH) أو C4b ملزمة البروتين (C4BP) تستخدم كعناصر إيجابية وسلبية، على التوالي.- تمييع كل من البروتينات البشرية (Vn و FH و C4BP) بشكل منفصل إلى 50 نانومتر في تريس-HCl، pH 9.0 (طلاء المخزن المؤقت). الاستغناء عن 100 ميليلتر من حل البروتين في كل من لوحة ميكروتيتير بوليسورب جيدا. إغلاق اللوحات مع الغطاء وتخزينها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (ح 16) لتسهيل التثبيت البروتين على الآبار لوحة ميكروتيتير.
- تجاهل الحل من لوحة ميكروتيتير عن إمالة رأسا على عقب عبر الحوض وغسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني/جيدا. كتلة الآبار المغلفة ح 1 في الرايت مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 2.5% (w/v) جيش صرب البوسنة (برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة).
- بعد إزالة الحل حظر، غسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% (v/v) 20 توين (ببست) كل بئر. إضافة 100 ميليلتر من 50 نانومتر المؤتلف PH له معلم لكل عينة جيدا واحتضانها ح 1 في الرايت في مراقبة الآبار، إضافة فقط 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة.
ملاحظة: الجين lph ترميز درجة الحموضة من منطقياً تضخيمه عن طريق PCR والمستنسخة في ناقل التعبير pET26b أن يضيف صاحب 6 ×-علامة في ج-محطة البروتين المعرب عنها. تم تحويل ناقلات المؤتلف كولاي BL21(DE3) للتعبير. وكان استخدام الراتنج ني-الإدارة الوطنية للسياحة لتنقية البروتين المؤتلف15. - تجاهل حل البروتين وإزالة البروتينات غير منضم بغسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميليلتر من ببست كل بئر. إضافة 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-جيش صرب البوسنة التي تحتوي على الفجل البيروكسيديز (HRP)-مترافق pAbs المضادة صاحب (01:10، وتمييع 000) واحتضانها ح 1 في الرايت
- إعداد حل 20 مم أ بحل تيتراميثيلبينزيديني في حل ميثانول الأسيتون و 45% 5%. لإعداد حل ب، حل ز 19.2 حمض الستريك في 1,000 مل ح2س، ضبط درجة الحموضة إلى 4.25 بإضافة كوه، ثم أضف ميليلتر 230 من 30 ٪ ح2س2. تخزين كل الحلول في الظلام في الرايت قبل الاستخدام، يخلط 500 ميليلتر من حل ب 9.5 مل من محلول لتحضير الكاشف الكشف عن أليسا.
- غسل الآبار ثلاث مرات مع 300 ميليلتر من ببست كل بئر والكشف عن مركبات ضد مستضد بإضافة 100 ميليلتر من أليسا الكشف عن الكاشف لكل بئر.
- إضافة 50 ميليلتر من م 1 ح2حتى4/well لوقف رد الفعل. قياس الكثافة الضوئية للآبار في 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
-
دراسة حركية التفاعل المؤتلف درجة الحموضة واستخدام BLI Vn
- شل Vn البشرية على أجهزة استشعار أمين المتفاعلة باستخدام أمين اقتران الأسلوب، طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة11.
- باستخدام برنامج تلفزيوني، متسلسل تمييع يجند (المؤتلف PH) من 0 إلى 4 ميكرومتر ونقل الحلول الناتجة إلى لوحة microtiter الأسود 96، حسنا، مسطحة القاع. تشغيل التجربة عند 30 درجة مئوية باستخدام أداة BLI17.
- تحميل مجلد البيانات في برنامج تحليل البيانات BLI. حدد الخيار 'أجهزة الاستشعار اختيار' . ثم، حدد 'مرجع جيدا' (استشعار المغلفة Vn في برنامج تلفزيوني) للطرح.
- حدد 'محاذاة المحور y لخط الأساس' وحدد 'إينتيرستيب التصحيح ومحاذاة لرابطة'. اضغط على الزر 'بيانات عملية' الذي سيتم تلقائياً فتح علامة التبويب التحليل.
- في علامة التبويب تحليل، حدد الخيار 'الرابطة وتفكك' تحت المنحنى المناسب. حدد النموذج 'ملزمة 1:1، وتركيب العالمية'. اضغط 'صالح منحنى' وتصدير البيانات17من المناسب.
2-وصف دور Vn في الانضمام البكتيرية
-
دراسة البكتيريا التمسك بالأسطح الزجاجية المغلفة Vn
- تعد حلاً 2 ميكروغرام/مل من Vn في برنامج تلفزيوني وبيبيت 10 ميليلتر لهذا الحل على مجهر زجاج الشريحة كقطرة واحدة. السماح بانخفاض الجافة على الشريحة لمدة 30 دقيقة في معطف الرايت شريحة مع ألبومين المصل البشري (HSA) كعنصر سلبي.
- يغسل الشرائح الزجاجية مغلفة بروتين ثلاث مرات بغمس الشرائح لمدة ثانيتين في كوب يحتوي على برنامج تلفزيوني لإزالة الزائدة من البروتين غير المصقول. إضافة 20 مل ثقافة سكانية جديدة (كما هو موضح في الخطوة 1.1.1) في طبق بتري بلاستيكية معقمة وتغرق Vn-/الشرائح المغلفة يمتلكهما الزجاج في الأجلين المتوسط والثقافة. احتضان الأطباق في 37 درجة مئوية ح 1 مع الهز 20 لفة في الدقيقة.
ملاحظة: M10 منطقياً و M10Δ سكانيةlph كانت تزرع في السائل بهي المتوسطة أو على ألواح الشوكولاته أجار. وقد استكمل المتوسطة للمسخ lph مع 10 ميكروغرام/مل كاناميسين15. - بعد الحضانة، إزالة أي بكتيريا غير منضم بغمر الشرائح ثلاث مرات في كوب مليء ببرنامج تلفزيوني. تصور البكتيريا بصبغة غرام، كما هو موضح.
- إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة من كل شريحة بإمالة عليه ولمس الحافة على المناديل الورقية. أيردري الشرائح لمدة 3-5 دقيقة في RT، وإصلاح البكتيريا التقيد بها بتمرير ثلاث مرات كل شريحة على لهب.
- أمسك الشريحة من الحواف مع اثنين من أصابعه على صينية المصبوغة، ثم إضافة 3-4 قطرات (200-300 ميليلتر) الحل البنفسجي كريستال 2.3%. انتظر 60 ثانية، ثم يغسل الشرائح ضمن تيار لطيف للاستفادة من المياه ل s 3 – 4.
- إضافة 3-4 قطرات محلول اليود 0.33% على الشرائح. انتظر 1 دقيقة، ثم شطف الشريحة ضمن تيار لطيف من ماء الصنبور. الجاف بعناية للشرائح بورق نشاف.
- إضافة 3-4 قطرات محلول ديكولوريزينج يحتوي على 75% كحول الأيزوبروبيل والاسيتون 25% على الشريحة. بعد 5 – 10 ق، تغسل الشريحة ضمن تيار لطيف من ماء الصنبور.
- إضافة 3-4 قطرات (200-300 ميليلتر) لحل كاربولفوتشسين الأساسية. انتظر 1 دقيقة، ثم شطف الشرائح ضمن تيار لطيف من ماء الصنبور. جاف الشرائح باستخدام ورق نشاف.
- تصور البكتيريا تحت مجهر خفيفة، اختيار عدسة هدف نفط-غمر في 100 × التكبير18. قارن بين التزام WT منطقياً والبكتيريا المسخ على الأسطح الزجاجية المغلفة Vn ومنتجاتها.
-
دراسة الانضمام Vn-تعتمد على البكتيريا للخلايا الظهارية
ملاحظة: استخدم هذا الفحص الالتزام الفعال في لدينا4،الدراسات السابقة7.- الثقافة خلايا A549 (النوع الثاني السنخية الخلايا الظهارية) في قارورة زراعة الأنسجة 75 سم2 مع F12 المتوسطة وتستكمل مع 5 ميكروغرام/مل الجنتاميسين و 10% مصل العجل الجنين (المجلد/المجلد) (FCS) (متوسطة كاملا). احتضان قارورة في حاضنة مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام حتى روافد 80% (يمكن تقدير كونفلوينسي بتصور التغطية السطحية من الخلايا باستخدام المجهر المقلوب). تصف الخطوات الأربعة التالية كيفية إعداد الخلايا الظهارية ل المقايسة19،20.
- أغسل المونولاير الخلية في قارورة مرتين مع 20 مل من برنامج تلفزيوني بدوامات لطيف. لفصل الخلايا من سطح قارورة، إضافة 2 مل من الخلية المفرزة الإنزيم الحل واحتضان قارورة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. استغلال قارورة بيدك لفصل كافة الخلايا من سطح البلاستيك. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً عدة مرات لتفريق كتل الخلية.
- إضافة مل 18 متوسطة كاملة F12 قارورة ونقل تعليق الخلية بأكملها إلى أنبوب فالكون 50 مل عقيمة. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 200 س ز على RT وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل متوسطة كاملة F12.
- إزالة 10 ميليلتر من تعليق خلية ووضعه في أنبوب ايبندورف، ثم أضف ميليلتر 90 من حل تريبان الأزرق. تحميل العينة في هيموسيتوميتير (عمق 0.1 ملم) بعد وضع ساترة.
- حساب كافة الخلايا قادرة على البقاء في المناطق أ، ب، ج ود (كل حقل يتكون من 16 المربعات، وكل مربع وتبلغ مساحتها 0.0025 مم2)، ثم حساب متوسط عدد الخلايا ([ألف + باء + جيم + دال]/4). حساب عدد الخلايا في المليلتر باستخدام المعادلة التالية:
خلايا قابلة للحياة/مل = عد خلية متوسط × 10 ×4 إضعاف عامل20.
ملاحظة: هنا، هو عامل تخفيف 10. - تمييع تعليق خلية إلى 5.0 × 103 خلايا/مل استخدام الجنتاميسين 5 ميكروغرام/ملليلتر تحتوي على المتوسط كاملة. الاستغناء عن 500 ميكروليتر من تعليق خلية في كل من لوحة الثقافة خلية 24-جيدا جيدا. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 حتى يتم روافد 90% من الخلايا.
- قبل العدوى البكتيرية، وإزالة المتوسطة من الآبار وإضافة المتوسطة F12 (دون FCS)، ثم احتضانها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- أغسل أحادي الخلية في الطبقة ثلاث مرات مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في مكان الرايت لوحة على الجليد وإضافة 100 ميليلتر من المتوسطة F12 مبردة مسبقاً التي تتضمن 10 ميكروغرام/مل من لوحة Vn. إينكوباتي في 4 درجات مئوية عن ح 1. لمراقبة الآبار، إضافة فقط F12 المتوسطة.
- بعد الحضانة، تجاهل الحل بواسطة بيبيتينج ويغسل طبقة الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني في "الرايت ريسوسبيند" ثقافة نمت حديثا منطقياً M10 (الخطوة 1.1.1) في المتوسط F12 (2 × 108 زيمبابوي/mL). إضافة 100 ميليلتر من هذا التعليق البكتيرية لكل بئر واحتضان لوحة ح 2 في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: كل جيد يحتوي على حوالي 2 × 105 A549 الخلايا. للإصابة، 2 × 107 وأضيفت زيمبابوي البكتيرية، المقابلة لعدد وافر عدوى 100. - إزالة المتوسطة عن طريق بيبيتينج وغسل الخلايا الظهارية A549 ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 50 ميليلتر/جيدا من الخلية المفرزة الحل واحتضان لوحة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- بعد ذلك إضافة 50 ميليلتر من F12 المتوسطة كاملة كل بئر لوقف رد الفعل الأنزيمي. نقل الخلايا الظهارية (إيتش وان زيرو زيرو ميكروليتر [أي، وحدة التخزين بالكامل]) من كل بئر لأنبوب زجاج 6 مل تحتوي على أربع حبات الزجاج. الخلايا في RT قبل فورتيكسينج لمدة 2 دقيقة.
- تمييع 10 ميليلتر من الخلية ليستي معززات بإضافة 10 ميليلتر من ليستي إلى 990 ميليلتر من المتوسطة F12. لوحة 10 ميليلتر من العينة المخففة على طبق أجار شوكولاتة.
- احتضان لوحة أجار الشوكولاته على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ثم عد المستعمرات. ويمثل كل مستعمرة واحدة من زيمبابوي.
- الثقافة خلايا A549 (النوع الثاني السنخية الخلايا الظهارية) في قارورة زراعة الأنسجة 75 سم2 مع F12 المتوسطة وتستكمل مع 5 ميكروغرام/مل الجنتاميسين و 10% مصل العجل الجنين (المجلد/المجلد) (FCS) (متوسطة كاملا). احتضان قارورة في حاضنة مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام حتى روافد 80% (يمكن تقدير كونفلوينسي بتصور التغطية السطحية من الخلايا باستخدام المجهر المقلوب). تصف الخطوات الأربعة التالية كيفية إعداد الخلايا الظهارية ل المقايسة19،20.
3-تحليل المقاومة Vn-تعتمد على نشاط جراثيم من مصل الدم البشري
- دائرة الصحة الوطنية الشراء من مصدر تجاري. إعداد VDS كما هو موضح سابقا12. تجديد VDS مع 180 نانومتر Vn يساوي Vn موجودة في دائرة الصحة الوطنية.
- إعداد مصل إبطال الحرارة (له) بتدفئة المستشفيات العامة في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة من أجل إلغاء تنشيط البروتينات تكملة.
ملاحظة: تم تحديد تركيز المصل الأمثل (5 في المائة) ووقت الحضانة (15 دقيقة) للتحليل هو موضح في الخطوات 3.3-3.7 تجريبيا منطقياً15؛ ويمكن أن تختلف هذه المعلمات لمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. - الثقافة البكتيريا (في هذه الحالة، M10 منطقياً و المسخ M10Δ سكانيةlph) لسجل منتصف المرحلة (OD600 = 0.3). بيليه البكتيريا بالطرد المركزي في س 3,500 ز لمدة 10 دقائق.
- ريسوسبيند بيليه البكتيرية مع حجم 1 سكر العنب الجيلاتين فيرنال المخزن المؤقت (دجفب++؛ ودرجة الحموضة 7.3) تحتوي على 2.5% (w/v) الجلوكوز، 2 مم مجكل2، كاكل 0.15 مم2والجيلاتين 0.1% (wt/المجلد).
- إضافة 1.5 × 103 زيمبابوي بكتيريا إلى 100 ميليلتر من دجفب++ التي تحتوي على المصل 5% (دائرة الصحة الوطنية، وله، VDS, أو VDS + 180 نانومتر Vn). احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الهز 300 لفة في الدقيقة.
- إزالة من 10 ميليلتر الكوة من الخليط رد فعل في 0 دقيقة (0 ر عينة) ومدة 15 دقيقة (تيتي عينة) ولوحة على أجار الشوكولاته. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- بعد الحضانة، عد المستعمرات التي تظهر في اللوحة. حساب النسبة المئوية للبكتيريا قتلت12 باستخدام المعادلة التالية: (زيمبابوي في تيتي)/(زيمبابوي في ر0) × 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vn-ملزمة على سطح البكتيريا تحددها التدفق الخلوي. توظيف جميع منطقياً يعزل السريرية اختبارها في هذه الدراسة Vn إلى سطح الخلية. وقد لوحظ لا تفاعل Vn مع سطح الخلية لسلالة كولاي المراقبة السلبية (الشكل 1أ). كما هو مبين في الشكل 1ب، الأس الهيدروجيني بروتين ملزمة Vn رئيسية على سطح الخلايا منطقياً. ملزمة من Vn بالسلالة منطقياً WT M10 تسبب في حدوث تحول في السكان، بينما M10Δ سكانيةlph غير ملزم Vn، وتبدو مشابهة لعنصر التحكم.
وقدرت تفاعلات البروتين البروتين بين الرقم الهيدروجيني و Vn أليسا و BLI. الرقم الهيدروجيني المؤتلف سمح بربط مع العامل البشري ح، Vn، و C4BP المغلفة (مراقبة سلبية) على آبار microtiter لوحات أليسا. ملزمة وقدرت الأس الهيدروجيني باستخدام pAbs المضادة صاحب. النتائج بوضوح إلى تفاعل كبير بين الرقم الهيدروجيني و Vn وعامل ح، بالمقارنة مع C4BP (الشكل 2أ). وقدرت التفاعل بين الرقم الهيدروجيني و Vn في الوقت الحقيقي باستخدام BLI. الشكل 2 ب يظهر الرقم الهيدروجيني منحنيات الاستجابة الملزمة للسطح استشعار المغلفة Vn. ملزمة تقارب (في هذه الحالة، دينار كويتي = 2، 2 ميكرومتر) قدرت باحتواء البيانات إلى حركية ملزمة في حالة مستقرة.
خفض البكتيريا التي تفتقر إلى التعبير عن درجة الحموضة على سطح الخلية (M10Δ سكانيةlph) عرضت الانضمام إلى الواجهات الزجاجية Vn المغلفة بالمقارنة بوزن الخلايا (الشكل 3أ). وباﻹضافة إلى ذلك، عزز وجود Vn على سطح الخلايا الظهارية كثيرا انضمام منطقياً (الشكل 3ب). هذه النتائج أشارت إلى أن التفاعل PH-Vn ساهم انضمام البكتيرية.
Vn مثبط تكملة معروفة جيدا. لتقدير النشاط التي تحول دون تكملة، فحص مصل الدم بوساطة قتل في الوجود وأظهرت عدم وجود خلايا WT منطقياً Vn. المقاومة المصل أعلى من خلايا متحولةlph M10Δ. وقتل البكتيريا لا حضور له (الشكل 4أ). من المثير للاهتمام، منطقياً WT أظهرت انخفاض البقاء في VDS، وتجديد Vn زيادة بقاء البكتيرية. ومع ذلك، لم تستجب سلالةlph M10Δ سكانية إلى نضوب Vn لأنه لا يمكن تجنيد Vn على سطح الخلية (الشكل 4ب). هذه النتائج تبين بوضوح أن Vn هو عامل مضيف هامة التي تحمي البكتيريا من قتل مكملاً بوساطة (الشكل 4أ-ب).
الشكل 1 : النزلية و النمط المصلي المسيطر يربط Vn عبر السطح-وأعرب الأستاذ (أ) التدفق الخلوي يؤدي عرض ملزم Vn إلى خلايا يعزل السريرية منطقياً. وكان المحتضنة كل عزل السريرية (5 × 106 زيمبابوي) مع 250 نانومتر الإنسان يجند Vn-منضم تم الكشف عن استخدام pAbs المضادة-Vn الأغنام ودونكي مترافق FITC الأغنام المضادة الأجسام المضادة الثانوية. الإشريكيّة القولونية BL21 (DE3) قد أدرج كعنصر سلبي. وترد البيانات حسب شدة الأسفار يعني من تحليلات ثلاث في ثلاث تجارب منفصلة، وأشرطة الخطأ تمثل تدفق (ب) التنمية المستدامة. الخلوي رسوم بيانية تبين ملزمة Vn إلى سطح M10 WT منطقياً وحذف الرقم الهيدروجيني منطقياً M10Δ lph المسخ. وترد بيانات تمثيلية من واحدة من ثلاث تجارب منفصلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : ربط الأس الهيدروجيني المؤتلف Vn- (أ) أليسا النتائج مما يدل على ربط الأس الهيدروجيني المؤتلف Vn و FH و C4BP. FH كعنصر إيجابي، بينما تم استخدام C4BP كعنصر سلبي. لتحليل تفاعلات البروتين البروتين، كانت مغلفة Vn و FH C4BP في اكويمولار (50 نانومتر) تركيزات على الآبار من لوحات ميكروتيتير. التالي، 50 نانومتر المؤتلف، تمت إضافة الرقم الهيدروجيني--His6x. ملزمة PH تم الكشف عن استخدام برنامج الصحة الإنجابية-مترافق pAbs المضادة له. البيانات المعروضة هي الوسيلة لتحليلات ثلاث من ثلاث تجارب مستقلة، وأشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة. * * *، ≤0.001 ف. (ب) بلياناليسيس لربط الأس الهيدروجيني إلى Vn: Vn المؤتلف كانت معطلة على أجهزة استشعار AR2G، وحركية ملزمة للأس الهيدروجيني (0.25-4 ميكرومتر) إلى Vn تم تسجيلها باستخدام أداة BLI. ثابت التوازن تقارب حسبت باستخدام الإشارات التي تم الحصول عليها لكل تركيز في التوازن، وتم تركيب البيانات وفقا لحركية الحالة المستقرة. وتكررت هذه التجربة ثلاث مرات، ويظهر dataset ممثل واحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : ويعزز التفاعل بين الرقم الهيدروجيني و Vn البكتيرية التمسك الأسطح الزجاجية والخلايا الظهارية. (أ) الخفيفة الصور المجهرية عرض انضمام منطقياً إلى الشرائح الزجاجية المغلفة Vn. كانت تصور البكتيريا بصبغة غرام. تظهر الصور التمثيلية من واحدة من ثلاث تجارب مستقلة. وقد سبق نشرها في مجلة علم المناعة7 هذا الفريق ويرد هنا بإذن من "الرابطة الأمريكية للمناعة". (ب) انضمام WT منطقياً M10 خلايا A549 الخلايا الظهارية في وجود وغياب Vn ويتم رسم وسائل تحليل ثلاث من التجارب المستقلة ثلاثة أشرطة الخطأ تمثل التنمية المستدامة. *، ≤0.05 ف . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : Vn المعينين على سطح الخلية منطقياً يحمي البكتيريا من قتل بوساطة المصل. (أ) WT M10 منطقياً والمسخ M10Δ سكانية كانت المحتضنةlph لمدة 15 دقيقة في دائرة الصحة الوطنية 5% أو له. آثار المقاومة (ب) من M10 منطقياً و M10Δ سكانيةlph لجراثيم في 5% VDS و VDS تستكمل مع 250 نانومتر تنقية Vn. البيانات تمثل وسائل تحليل ثلاث من ثلاث تجارب مستقلة، وأشرطة الخطأ تشير إلى التنمية المستدامة. * * *، ف ≤0.001؛ NS، ليس كبيرا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعيين Vn إلى سطح الخلية مسببات الأمراض البكتيرية والاستفادة من هذا منظم مكملاً لمنع ترسب عوامل مكملة والانتهاء من غشاء معقدة هجوم2. Vn يعمل أيضا كجزيء جسر بين البروتينات السطحية البكتيرية ومستقبلات سطح الخلية المضيفة، مما مكن مسببات الأمراض التمسك بسطح الخلايا الظهارية والتوسط فيما بعد استيعاب. في هذه الدراسة، يمكننا وصف البروتوكولات التي يمكن استخدامها لتقدير ط) ملزمة Vn على سطح الخلايا البكتيرية، وتفاعلات البروتين البروتين الثاني) وثوابت تقارب، وثالثاً) دور وظيفي من Vn في توفير مصل المقاومة وتعزيز الانضمام إلى سطح الخلايا المضيفة.
التدفق الخلوي أسلوب كمي استخداماً للتحقق من أن البكتيريا ربط Vn. ومع ذلك، يجب أن الأمثل تركيز Vn، كالقدرة الملزمة Vn (ومستقبلات مختلفة) يمكن أن تختلف باختلاف أنواع الجراثيم. في مقايسة الموصوفة هنا، استخدمت 1-100 ميكروغرام/مل من Vn لتقدير الربط الخطي ومعلمات التشبع. مقارنة أنماط سكانية WT الملزم، والمسخlph M10Δ سكانية، ومراقبة سلبية كولاي الخلايا أظهرت فرقا واضحا في تركيز Vn من 20 ميكروغرام/مل (250 نيوتن متر). ولذلك، استخدمت هذا التركز في جميع تجارب قياس التدفق. يمكن أن يؤدي استخدام Vn في تركيزات أعلى نقطة التشبع إشارات إيجابية كاذبة. التخفيف من الأجسام المضادة الأولية والثانوية يجب أن يكون أيضا الأمثل بشكل منفصل لكل الكائنات الممرضة. وينبغي اختيار إضعاف الحد الأقصى من الأجسام المضادة التي تظهر إشارة جيدة. في هذه الدراسة، كنا جيش صرب البوسنة 2.5% كعامل حظر. ومع ذلك، جيش صرب البوسنة ليست كاشف حظر عالمي مناسبة لجميع مسببات الأمراض. في الحالات التي لا يمنع جيش صرب البوسنة تفاعلات جسم غير محدد، يمكن استخدام الكواشف حظر الأخرى، مثل الجيلاتين الأسماك. ربط Vn على سطح الخلايا البكتيرية الممرض غالباً ما توسط عدة مستقبلات21،22. وقد بعض مستقبلات عالية تقارب Vn-ملزمة، بينما البعض الآخر قد يحمل تقارب ملزمة منخفضة. وبالتالي، قد لا ينتج حذف مورثة واحد فقط ترميز بروتين سطحي انخفاضا في التفاعلات Vn يقيمها التدفق الخلوي. كبديل للتدفق الخلوي، يمكن دراسة ملزمة البروتين على سطح الخلية البكتيرية استخدام الفلورة المقايسة (إيفا) أو مجهر إلكتروني (TEM). على الرغم من أن فوتوبليتشينج من الأجسام المضادة مترافق فلوروريجينت يمكن أن يكون مشكلة في التدفق الخلوي وأكد، تيم ينطوي على إعداد نموذج مرهقة، مع احتمال كبير لعرض التحف23،24. تحليل التدفق الخلوي في الواقع أفضل إيفا وال سبب أبسط نموذج إعداد البروتوكولات وإمكانية اختبار عينات كثيرة في إطار زمني قصير.
تم تحليل تفاعلات البروتين البروتين في نظام خلية حرة بإليزا (الشكل 2ألف) و BLI (الشكل 2ب). في كل من هذه التقنيات، كان أحد الشركاء ملزمة المعطل تداولها، أما في بيوسينسور (ل BLI) أو لوحة ميكروتيتير (ELISA). ميزة BLI وإليزا أنها تتيح تحليل تفاعلات البروتين البروتين في دولته الأصلية، منع التفاعلات غير محدد خارج الموقع ملزم النشطة. فائدة BLI، ومع ذلك، يمكن أن تكون محدودة تبعاً لأسلوب التثبيت المستخدمة. أشكال أمين اقتران الإجراء المتبع هنا عشوائياً في سندات أميد بين أي مجموعة أمين سطح مكشوف من البروتين والسطح بيوسينسور. ينتج عن هذا التثبيت جزيئات البروتينية على سطح جهاز الاستشعار في التوجهات المختلفة. يمكن أن ينتج هذا الربط غير المتجانسة التي لا تناسب نموذج حركية ملزمة 1:1. يمكن حل هذه المشكلة المحتملة بتحديد أجهزة استشعار البيوتين وإضافة علامة ستريبتافيدين في البروتين المؤتلف تكون معطلة. موثوقية BLI شبيه بالرنين السطحية مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة). الرابطة وتفكك جزيئات يمكن أن يقاس في الوقت الحقيقي باستخدام أما الأسلوب. ومع ذلك، الجهاز BLI لا تستخدم ميكروفلويديكس، فمن السهل للحفاظ على. وباﻹضافة إلى ذلك، التفاعلات 96 يمكن اختبارها في وقت واحد في BLI، بينما يمكن اختبار عينات سوى أربعة في وقت واحد باستخدام موارد البرنامج الخاصة. هناك خطوة حاسمة أخرى في BLI التي يجب أن يكون الأمثل. إذا كان يتم إعادة استخدام أجهزة الاستشعار، شروط التجديد ينبغي أيضا أن يكون الأمثل، كما أنه قد تختلف لكل مجمع البروتين-بروتين. في هذه الدراسة، تم العثور على حمض الإيثيلين 10 ملم مناسبة لتجديد أجهزة الاستشعار.
تم اختبار دور Vn في الانضمام البكتيرية مباشرة باستخدام الواجهات الزجاجية المغلفة مع Vn. وهذا النهج يمكن أن تستخدم لتحليل ملزمة لأي مسببات الأمراض البكتيرية، بما في ذلك بكتيريا سلبية الغرام والإيجابية على السواء-. هذا هو أسلوب مسوحات يوفر التقييم السريع للقدرة الممرض للربط إلى Vn. للحصول على نتائج معقولة، يجب أن يكون الأمثل طلاء Vn. في مقايسة الموصوفة هنا، فحص طلاء مع Vn في 1 و 2 و 5 ميكروغرام/مل، ووجد أن تركيز الأكثر ملاءمة للتجارب التي أجريت في هذه الدراسة (الشكل 3أ) 2 ميكروغرام/مل. يمكن إنشاء Vn الزائدة المغلفة على السطح طبقة سميكة يمكن أن يكون خلع بسهولة خلال العينة لتحديد وتلطيخ. وعلاوة على ذلك، لا ينبغي أن يكون ثقافة البكتيرية كتل كبيرة من الخلايا؛ وهذا يمكن أن يكون تجنب الثقافة قبل إضافة قاسمة للشرائح بواسطة فورتيكسينج.
تم بحث انضمام البكتيرية على سطح الخلايا الظهارية استخدام تقنية لوحة عد (الشكل 3أ). هذا التحليل أيضا يجب أن يكون بعناية الأمثل لتمكين المراقبة دور Vn في الانضمام البكتيرية. Vn وقد ربط مختلف المواقع للبكتيريا (في ج-المحطة) وخلية مستقبلات إنتغرين السطحية (في موقع ربط إدارات الطرفي ن). ملزمة Vn إلى integrins الحث على الإشارات والإقبال على مجمع إنتغرين-Vn1. إذا كان يتم استيعاب هذه المجمعات دون البكتيريا، سيكون من الصعب على تفسير النتائج. ولذلك، يجب إضافة Vn المونولاير الخلايا الظهارية في 4 درجات مئوية. مرة واحدة وقد المشبعة Vn إنتغرين المستقبلات على سطح الخلايا الظهارية، يجب غسل Vn الزائدة، كما Vn الحرة يمكن حظر ملزم إنتغرين Vn-تعتمد على البكتيريا. في هذا التحليل، قدرنا بحساب مجموع البكتيرية المرتبطة بها مع الخلايا الظهارية (أيالقراءة يتألف على حد سواء المرفقة بالسطح واستيعاب البكتيريا). ويمكن تمديد هذا التحليل للتمييز بين السكان البكتيرية الخارجية وداخل الخلايا بالمعاملة مع الجنتاميسين4.
جزئيا تعديل المقايسة جراثيم المصل المستخدمة في البروتوكول الموصوفة هنا من12،الداخلي المنشورة سابقا22. في مقايسة وصفها هنا، 1.5 x 10 "كفوس سكانية"3 كانت المحتضنة مع دائرة الصحة الوطنية 5% لمدة 15 دقيقة، 5 دقيقة أطول في التحليل هو موضح سابقا (الشكل 4أ). وكان الفرق بين وزن منطقياً والمسخ اسوي خالية من الأس الهيدروجيني أكثر وضوحاً في 15 دقيقة من الساعة 10 دقيقة. ولذلك، علينا تحديد فترة الحضانة 15 دقيقة لهذه التجربة خاصة. تعتمد آثار جراثيم المصل على تركيز المصل، ووقت الحضانة، وعدد من البكتيريا. يحمل جميع مسببات الأمراض بقدرة ملحوظة على تجنب نشاط جراثيم من المصل؛ يمكن أن تكون بعض مسببات الأمراض مقاومة تماما لمصل الدم، في حين أن الآخرين يمكن أن تكون حساسة أو مقاومة معتدلة. ولذلك يجب أن يكون الأمثل تركيز المصل الممرض محددة كل درس. ومع ذلك، المصل مما أسفر عن مصرع المقايسة الموصوفة هنا يقتصر على دراسة البكتيريا سلبية الغرام، نظراً لمصل ليس له أي تأثير جراثيم كبيرة في الخلايا إيجابية1،5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
وكان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة أنا وبيرغر إدوين هيرتا لارس، O.E. ومؤسسة ادلا جوهانسون، "مجلس البحوث الطبية السويدية" (منح رقم K2015 57 س-03163-43-4، www.vr.se)، "مؤسسة مكافحة السرطان" في الجامعة مستشفى في مالمو الفيزيوغرافية المجتمع (فورسمان في المؤسسة)، ومجلس مقاطعة Skåne البحوث ومؤسسة التنمية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
