Summary
Ce rapport décrit les protocoles pour caractériser les interactions entre les protéines de membrane externe bactérienne et la vitronectine régulateur de complément humain. Les protocoles peuvent être utilisés pour étudier les réactions de la liaison et la fonction biologique de la vitronectine dans n’importe quelle espèce bactérienne.
Abstract
Bactéries utilisent le complément régulateurs comme un moyen d’échapper à la réponse immunitaire hôte. Nous décrivons ici les protocoles d’évaluation de l’acquisition de vitronectine de rôle aux fois surface de cellule bactérienne dans la résistance pour le système immunitaire. Expériences de cytométrie de flux identifié la vitronectine plasma humain comme ligand pour la protéine de membrane externe du récepteur bactérien H d’Haemophilus influenzae type f. Un dosage immuno-enzymatique a été utilisé pour caractériser les interactions protéine-protéine purifiée de la protéine recombinante H mettant aux prises la vitronectine et affinité a été évaluée en utilisant l’interférométrie bio-couche. L’importance biologique de la liaison de la vitronectine à H la protéine à la surface des cellules bactériennes à l’évasion de la réponse immunitaire hôte a été confirmée à l’aide d’un test de résistance de sérum avec sérum humain normal et appauvri la vitronectine. L’importance de la vitronectine dans l’adhérence bactérienne a été analysée à l’aide de lames de verre, avec ou sans revêtement de vitronectine, suivie par la coloration de Gram. Enfin, l’adhérence bactérienne aux monocouches de cellules épithéliales alvéolaires humains a été étudiée. Les protocoles décrits ici peuvent être facilement adaptés à l’étude de toutes les espèces bactériennes d’intérêt.
Introduction
La vitronectine (Vn) est une glycoprotéine humaine importante impliqués dans le maintien de l’homéostasie par l’intermédiaire de la régularisation du système fibrinolytique. VN fonctionne aussi comme un régulateur de complément en inhibant la voie du complément terminal au cours de la formation d’un complexe C5b6-7 et la polymérisation de C9. Plusieurs bactéries pathogènes ont démontré que recruter Vn à la surface cellulaire comme moyen de résistance complément dépôt1,2,3. En outre, Vn fonctionne comme une molécule « sandwich » entre bactéries et récepteurs des cellules épithéliales hôte, favorisant ainsi l’adhérence et l’internalisation des pathogènes2,4,5. Liaison du Vn à la surface de la cellule bactérienne est véhiculée par d’autres protéines actuellement non identifiés. Élucider pleinement le rôle fonctionnel de Vn-liaison à l’évasion de la réponse immunitaire de tuyau exigera donc identification de protéines Vn-recrutement.
La première étape dans l’identification des protéines liant Vn est pour tester si un agent pathogène d’intérêt peut lier purifiée Vn. cytométrie en flux est une méthode pratique et simple pour déterminer si Vn est lié aux cellules de l’agent pathogène. Dans cette étude, nous avons évalué la liaison du Vn à divers Haemophilus influenzae type f (Hif) isolats cliniques6. La méthode décrite ici est quantitative et peut être utilisée pour distinguer la capacité de liaison d’une grande variété de souches bactériennes. Dans une étude précédente, nous avons caractérisé protéine H (PH) de Hif comme un liant Vn protéine7. Par conséquent, dans la présente étude, le potentiel de liaison Vn de mutants de type sauvage (WT) Hif et Hif M10Δ del/h ont été comparées en utilisant les protocoles décrits.
Lorsqu’il est déterminé qu’un pathogène lie Vn, la deuxième étape est de caractériser la surface proteome afin d’identifier des protéines liant le Vn potentiels. Une variété d’approches peut être utilisée pour ce but8,9, mais ces méthodes ne sont pas décrits dans le présent rapport. La méthode plus appropriée pour l’examen des interactions protéine-protéine est d’inoculation exprimer certaines protéines de surface bactériennes chez e. coli et purification par chromatographie d’affinité. Ici, nous utilisons des PH et ses interactions moléculaires Vn pour illustrer la méthode. Interactions entre recombinant PH et Vn furent caractérisées par une enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)7 et une technique récemment développée d’exempte d’étiquette appelée bio-couche interférométrie (BLI)10,11. Alors que les tests ELISA peuvent servir à confirmer les interactions protéine-protéine, BLI fournit des données détaillées sur les paramètres cinétiques des interactions.
Afin d’étudier le rôle fonctionnel de Vn en adhérence bactérienne, deux dosages différents peuvent être utilisés. Le premier test décrit ici est une mesure directe de l’adhérence des bactéries sur des surfaces de verre enduit de Vn, tandis que le deuxième test examine l’adhérence à la surface des cellules épithéliales. Pour le premier test, lames de verre ont été revêtus de Vn, et la liaison du WT ou souches mutantes de Hif a été évaluée par microscopie et coloration de Gram. Cette technique permet de distinguer facilement bactéries basés sur la capacité de lier Vn12. Adhérence bactérienne aux cellules de mammifères a été analysée puis en ajoutant des bactéries cultivées sur une monocouche de cellules épithéliales alvéolaires de la type II ; attachement des bactéries a été évaluée en comptant le nombre de formatrices unités (UFC). Collés et intériorisées de bactéries peuvent être distinguées en présence ou en absence de Vn4,13.
Le rôle de l’acquisition de Vn en résistance au sérum bactérienne a été évalué par dosage sérique meurtre (c'est-à-dire, l’activité bactéricide de sérum). Afin d’évaluer l’importance de l’acquisition de Vn dans la résistance au sérum, l’activité bactéricide du sérum appauvris en Vn (VDS) a été comparée à celle du sérum humain normal (NHS). La méthode utilisée facilement distingue liant Vn contre bactéries non contraignant basés sur la résistance au sérum. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier le rôle de Vn dans la résistance au sérum de plusieurs bactéries pathogènes4,12.
De nombreuses méthodes ont été rapportés pour l’étude des interactions hôte-pathogène. Nous décrivons ici un ensemble de protocoles qui peuvent être facilement adaptés à l’étude de tout agent pathogène afin d’évaluer le rôle de Vn dans la pathogenèse. Nous avons testé ces protocoles à l’aide de différents agents pathogènes, et Hif a été choisi comme exemple pour ce rapport.
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Protocol
1. analyse des Vn comme Ligand protéine bactérienne de Surface
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Détection de Vn-fixation à la surface bactérienne à l’aide de cytométrie en flux
Remarque : En cytométrie en flux, nous avons utilisé diffusion latérale et forward scatter pour porte des événements positifs. Pour examiner les interactions avec les Vn, Hif clinique isole (n = 10)7 ont été sélectionnés ainsi qu’e. coli BL21 (DE3) comme témoin négatif (Figure 1A).- La culture Hif clinique isole dans le milieu de perfusion (BHI) de cerveau-cœur additionné de 10 µg/mL NAD et hémine à 37 ° C sous agitation à 200 tr/min. Utilisez Luria-Bertani moyenne pour la culture d’e. coli14. Récolter le Hif à phase logarithmique (OD600 = 0,3)15et remettre en suspension les bactéries présentes dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2, contenant 1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) (tampon de blocage ; PBS-BSA). Ajuster la suspension à 109 UFC/mL.
- Transférer les aliquotes contenant 5 x 106 UFC et les tubes 5 mL à fond rond en polystyrène (12 x 75 mm2) et ajouter 1 mL de tampon de blocage. Centrifuger la suspension à 3 500 × g à température ambiante (RT),16 , pendant 5 min pour les bactéries de granule, puis Aspirez soigneusement pour enlever le liquide surnageant sans déranger le culot.
- Remettre en suspension les pellets bactériennes avec 50 μL de tampon de blocage contenant 250 nM Vn et incuber les échantillons pendant 1 h à RT sans agiter. Après incubation, les bactéries de granule par centrifugation à 3 500 g pendant 5 min, puis laver les granules trois fois à l’aide de PBS et des étapes de centrifugation similaires.
- Au culot bactérien, ajouter 50 μL de moutons primaires anti-humain Vn des anticorps polyclonaux (ACP) à une dilution au 1/100 de PBS-BSA. Incuber la suspension pendant 1 h à RT, puis lavez les bactéries trois fois avec du PBS pour éliminer les anticorps non fixés (comme indiqué au point 1.1.3).
- Ensuite, ajouter 50 μL de PBS-BSA contenant l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-conjugué âne anti-moutons carnets d’adresses personnels (dilution 1 : 100) et incuber à RT dans l’obscurité pendant 1 heure.
- Préparer un contrôle à blanc en incubant des bactéries avec blocage tampon seulement et carnets d’adresses personnels sans Vn.
- Laver trois fois avec 1 mL de tampon de blocage, les bactéries et la suspension de granule par centrifugation, tel que décrit dans la section 1.1.2. Enfin, resuspendre le culot bactérien avec 300 µL de PBS et d’analyser par écoulement cytometry7.
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Analyse de l’interaction entre PH recombinante et Vn ELISA
Remarque : Les contrôles doivent être inclus pour exclure les liaisons non spécifiques. La protéine humaine facteur H (FH) ou C4b-liaison (C4BP) sont utilisés comme témoins positifs et négatifs, respectivement.- Diluer chacun des protéines humaines (Vn, FH et C4BP) séparément à 50 nM de Tris-HCl, pH 9,0 (tampon de revêtement). Déposer 100 µL de solution protéique dans chaque puits d’une microplaque Polysorp. Fermez les plaques avec le couvercle et stocker à 4 ° C durant la nuit (16 h) pour faciliter l’immobilisation des protéines sur les puits de plaque de microtitration.
- Jeter la solution de la plaque de microtitrage à l’inclinaison de tête en bas au-dessus de l’évier et laver les puits trois fois avec 300 µL de PBS/puits. Bloquer la microplaque pendant 1 h à RT avec du PBS contenant 2,5 % (p/v) BSA (PBS-BSA).
- Après avoir retiré la solution de saturation, laver les puits trois fois avec 300 µL de PBS contenant 0,05 % (v/v) de Tween 20 (PBST) / puits. Ajouter 100 µL de 50 recombinant nM-le tag son PH de chaque échantillon bien et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Dans les puits de contrôle, ajouter 100 µL de PBS-BSA.
Remarque : Le gène lph PH de Hif a été amplifié par PCR et cloné dans le vecteur d’expression pET26b qui ajoute un 6 × His-tag à l’extrémité C-terminale de la protéine exprimée. Le vecteur recombinant a été transformé en e. coli BL21 (DE3) pour l’expression. Ni-NTA résine a été utilisée pour purifier la protéine recombinante15. - Jeter la solution protéique et supprimer des éléments non fixés par laver les puits trois fois avec 300 µL de PBST / puits. Ajouter 100 µL de la peroxydase de raifort contenant PBS-BSA (PR)-conjugué anti-ses carnets d’adresses personnels (01:10, 000 dilution) et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Préparer solution 20 mM A en dissolvant tétraméthylbenzidine dans une solution de méthanol acétone et 45 % à 5 %. Pour préparer la solution B, dissoudre à 19,2 g d’acide citrique dans 1 000 mL H2O, ajuster le pH à 4,25 en ajoutant KOH, puis ajoutez 230 µL de 30 % H2O2. Stocker les deux solutions dans l’obscurité à température ambiante. Juste avant l’utilisation, mélanger 500 µL de solution B avec 9,5 mL de solution A pour préparer le réactif de détection ELISA.
- Laver les puits trois fois avec 300 µL de PBST / puits et détecter les complexes antigène-anticorps en ajoutant 100 µL de réactif de détection ELISA à chaque puits.
- Ajouter 50 µL de 1 M H2SO4/well pour arrêter la réaction. Mesurer la densité optique des puits à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
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Étude de la cinétique de l’interaction des recombinants PH et Vn utilisant BLI
- Immobiliser Vn humaine sur les capteurs amine-réactive à l’aide de l’amine couplage méthode, selon lignes directrices11 les directives du fabricant.
- À l’aide de PBS, en série diluer le ligand (recombinant PH) de 0 à 4 µM et transférer les solutions qui en résulte dans une microplaque 96 puits noir, fond plat. Exécutez l’expérience à 30 ° C à l’aide d’un instrument BLI17.
- Charger le dossier de données dans le logiciel d’analyse de données BLI. Sélectionnez l’option « sélection du capteur » . Puis, sélectionnez « référence bien » (capteur de Vn-enduit dans du PBS) pour la soustraction.
- Sélectionnez « Aligner l’axe des ordonnées à base » et « interstep correction et aligner à association ». Appuyez sur « données de processus » qui seront ouvrira automatiquement l’onglet analyse.
- Dans l’onglet analyse, sélectionnez l’option « association et dissociation » sous ajustement de courbe. Sélectionnez le modèle "1:1 liaison et ajustement global". Appuyez sur « ajuster la courbe » et l’exportation montage données17.
2. caractérisation du rôle de Vn en adhérence bactérienne
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Étude de l’adhérence des bactéries aux surfaces de verre enduit de Vn
- Préparer une solution de 2 µg/mL de Vn en PBS et ajouter 10 µL de cette solution sur un microscope de verre glissent comme une goutte. Permettre à la baisse à sécher sur la lame pendant 30 min à RT. manteau une diapositive avec l’albumine sérique humaine (Ash) comme témoin négatif.
- Laver les lames de verre enduit de protéine trois fois en plongeant les diapositives pendant deux secondes dans un bécher contenant PBS pour enlever l’excès de protéines non couché. Ajouter 20 mL de culture fraîche de Hif (décrite à l’étape 1.1.1) dans une boîte de petri stérile en plastique et de submerger le Vn- / lames de verre enduit HSA dans le milieu de culture. Incuber les boîtes à 37 ° C pendant 1 h avec agitation à 20 tr/min.
NOTE : Hif M10 et Hif M10Δl/h ont été cultivées dans un milieu BHI liquide ou sur plaques de gélose chocolat. Le support pour le mutant l/h a été complété par 10 µg/mL kanamycine15. - Après l’incubation, retirer toutes les bactéries non liés en immergeant les lames trois fois dans un bécher rempli avec du PBS. Visualiser les bactéries par la coloration de Gram, tel que décrit.
- Enlever excès PBS de chaque diapositive en inclinant et en touchant le bord sur papier de soie. Sécher les diapositives pour les 3-5 min à ta et fixer les bactéries collés en passant chaque diapositive trois fois au-dessus d’une flamme.
- Maintenez la diapositive par les bords avec deux doigts sur un plateau de coloration, puis ajouter 3 à 4 gouttes (200 à 300 µL) de solution de violet de gentiane 2,3 %. Attendre 60 s, puis lavez les diapositives sous un léger courant de robinet d’eau pendant 3-4 s.
- Ajouter 3-4 gouttes de solution d’iode de 0,33 % sur les diapositives. Attendre 1 min, puis rincer la lame sous un léger courant d’eau du robinet. Séchez soigneusement les lames de papier buvard.
- Ajouter 3 à 4 gouttes de solution de décoloration contenant de l’alcool isopropylique 75 % et 25 % acétone sur le toboggan. Après 5 à 10 s, laver la lame sous un léger courant d’eau du robinet.
- Ajouter 3 à 4 gouttes (200 à 300 µL) de solution de base carbolfuchsin. Attendre 1 min, puis rincer les lames sous un léger courant d’eau du robinet. Sécher les lames à l’aide de papier buvard.
- Visualiser les bactéries sous un microscope photonique, en sélectionnant une lentille d’objectif-immersion dans l’huile à 100 X de grossissement18. Comparer l’adhérence des Hif WT et bactéries mutantes sur les surfaces vitrées Vn - et HSA-enduit.
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Étude de l’adhésion de Vn-dépendante des bactéries aux cellules épithéliales
Remarque : Ce test d’adhérence efficace a été utilisé dans nos études précédentes4,7.- Cellules A549 culture (cellules épithéliales alvéolaires de type II) dans une fiole de vitroplants de 75 cm2 avec F12 milieu additionné de 10 % de sérum de veau foetal (vol/vol) (FCS) (milieu complet) et de 5 µg/mL gentamicine. Incuber le flacon dans un incubateur avec 5 % de CO2 à 37 ° C pendant 3 jours jusqu'à 80 % anastomosé (confluence peut être estimée en visualisant la surface couverte par les cellules à l’aide de microscope inversé). Les quatre étapes suivantes décrivent comment préparer les cellules épithéliales pour le dosage19,20.
- Laver la monocouche de cellules dans le ballon deux fois avec 20 mL de PBS en agitant doucement. Pour détacher les cellules de la surface du flacon, ajouter 2 mL de solution d’enzyme cellulaire détachement et incuber le ballon pendant 5 min à 37 ° C. Taper le ballon avec votre paume pour détacher toutes les cellules de la surface en plastique. Pipette de haut en bas plusieurs fois à disperser des amas de cellules.
- Ajouter 18 mL de milieu complet F12 dans le ballon et la suspension de toute cellule de transfert dans un tube stérile de Falcon de 50 mL. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 x g à RT et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu complet F12.
- Enlever 10 µL de la suspension cellulaire et placez-le dans un tube Eppendorf, puis ajoutez 90 µL de solution de bleu de Trypan. Charger l’échantillon dans un hémocytomètre (profondeur de 0,1 mm) après avoir placé la lamelle.
- Compter toutes les cellules viables dans les zones A, B, C et D (chaque champ se compose de 16 carrés, et chaque carré a une superficie de 0,0025 mm2), puis calculer le nombre moyen de cellules ([A + B + C + D] / 4). Calculer le nombre de cellules par millilitre selon l’équation suivante :
Cellules viables/mL = moyenne des cellules comte × 104 × dilution facteur20.
NOTE : Ici, le facteur de dilution est de 10. - Diluer la suspension cellulaire à 5,0 x 103 cellules/mL à l’aide complète moyenne gentamicine contenant de 5 µg/mL. Pipeter 500 μl de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Incuber les plaques à 37 ° C en 5 % CO2 jusqu'à ce que les cellules soient 90 % anastomosé.
- Avant l’infection bactérienne, retirer le support des puits et ajoutez F12 moyen (sans FCS), puis incuber une nuit à 37 ° C.
- Laver la monocouche cellulaire trois fois avec 500 µL de PBS à RT. Place la plaque sur la glace et ajouter 100 µL de préalablement réfrigérées F12 milieu contenant 10 µg/mL de Vn. Incuber plaque à 4 ° C pendant 1 h. Pour les puits de contrôle, ajoutez seulement F12 moyen.
- Après incubation, jeter la solution de pipetage et laver deux fois avec 1 mL de PBS, la couche de cellules à remettre en suspension les RT. une culture de fraîchement cultivés Hif M10 (étape 1.1.1) dans un milieu F12 (2 × 108 UFC/mL). Ajouter 100 µL de la suspension bactérienne dans chaque puits et incuber la plaque pendant 2 h à 37 ° C.
Remarque : Chacun bien contient environ 2 x 105 A549 cellules. Pour l’infection, 2 x 107 UFC bactérienne ont été ajoutés, correspondant à une multiplicité d’infection de 100. - Enlever le support de pipetage et laver les cellules épithéliales A549 trois fois avec du PBS. Ajouter 50 µL/puits de la solution de détachement cellulaire et incuber la plaque pendant 5 min à 37 ° C.
- Ensuite, ajouter 50 µL de milieu complet F12 / puits de bloquer la réaction enzymatique. Transférer les cellules épithéliales (≈100 μL [c'est-à-dire, la totalité du volume]) de chaque puits dans un tube de verre de 6 mL contenant quatre perles de verre. Lyse des cellules à RT au Vortex pendant 2 min.
- Diluer 10 µL du lysat cellulaire 100 fois en ajoutant 10 µL de lysat de 990 µL de milieu F12. Plaque de 10 µL de l’échantillon dilué sur une gélose chocolat.
- Incubez la gélose chocolat à 37 ° C durant la nuit, puis compter les colonies. Chaque colonie représente un UFC.
- Cellules A549 culture (cellules épithéliales alvéolaires de type II) dans une fiole de vitroplants de 75 cm2 avec F12 milieu additionné de 10 % de sérum de veau foetal (vol/vol) (FCS) (milieu complet) et de 5 µg/mL gentamicine. Incuber le flacon dans un incubateur avec 5 % de CO2 à 37 ° C pendant 3 jours jusqu'à 80 % anastomosé (confluence peut être estimée en visualisant la surface couverte par les cellules à l’aide de microscope inversé). Les quatre étapes suivantes décrivent comment préparer les cellules épithéliales pour le dosage19,20.
3. analyse de la résistance de Vn-dépendante de l’activité bactéricide du sérum humain
- Achat NHS provenant d’une source commerciale. Préparer VDS comme décrit précédemment12. Reconstituer le VDS avec 180 nM Vn qui équivaut à Vn présent dans le NHS.
- Préparer sérum inactivés par la chaleur (HIS) par NHS de chauffage à 56 ° C pendant 30 min afin d’inactiver les protéines du complément.
Remarque : La concentration optimale de sérum (5 %) et temps d’incubation (15 min) pour l’essai décrit aux points 3.3 à 3,7 ont été déterminées empiriquement pour Hif15; ces paramètres peuvent varier pour les autres bactéries pathogènes. - La culture de bactéries (dans ce cas, Hif M10 et le mutant Hif M10Δl/h) à la phase logarithmique (OD600 = 0,3). Bactéries de granule par centrifugation à 3 500 x g pendant 10 min.
- Resuspendre le culot bactérien et 1 volume de dextrose, gélatine Veronal tampon (DGVB++; pH 7,3) contenant 2,5 % (p/v) de glucose 2 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2et 0,1 % (wt/vol) de gélatine.
- Ajouter 1,5 x 103 UFC de bactéries à 100 µL de DGVB++ contenant 5 % de sérum (NHS, sien, VDS, ou VDS + 180 nM Vn). Incuber l’échantillon à 37 ° C pendant 15 min avec la secousse à 300 tr/min.
- Supprimer une aliquote de 10 µL du mélange réactionnel à 0 min (échantillon de0 T) et 15 min (échantillon det T) et plaque sur gélose chocolat. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
- Après incubation, compter les colonies apparaissant sur la plaque. Calculer le pourcentage de bactéries tuées12 selon l’équation suivante : (UFC à T,t) / (UFC à T0) × 100.
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Representative Results
VN-fixation à la surface des bactéries a été déterminée par cytométrie en flux. Hif tous les isolats cliniques testés dans cette étude a recruté Vn à la surface des cellules. Aucune interaction de Vn avec la surface cellulaire a été observée pour la souche de contrôle négatif d’e. coli (Figure 1A). Comme illustré à la Figure 1B, le PH est une protéine liant Vn majeure sur la surface des cellules de Hif. Liaison de Vn de la souche WT Hif M10 a causé un changement dans la population, alors que Hif M10Δl/h ne se lient pas Vn et semblent similaires au contrôle.
Interactions de protéine-protéine entre PH et Vn ont été estimées par ELISA et BLI. PH recombinante a été autorisé à lier avec le facteur humain H, Vn et C4BP (témoin négatif) adsorbé sur les puits d’une microplaque plaques ELISA. Lié PH a été estimée en utilisant un anti-son carnets d’adresses personnels. Les résultats indiquent clairement une interaction significative entre le PH et Vn et facteur H, comparativement à C4BP (Figure 2A). Interaction entre le PH et Vn ont été estimées en temps réel à l’aide de BLI. Figure 2 B montre les courbes de réponse de liaison de PH pour la surface du capteur Vn-enduit. Affinité (dans ce cas, Kd = 2,2 µM) a été estimée en ajustant les données de cinétique de liaison stationnaire.
Manque d’expression du PH sur la surface de la cellule (Hif M10Δl/h) présentée les bactéries réduit adhérence sur des surfaces de verre enduit de Vn en comparaison avec les cellules WT (Figure 3A). En outre, la présence de Vn à la surface des cellules épithéliales favorise sensiblement l’adhérence des Hif (Figure 3B). Ces résultats indiquent que l’interaction PH-Vn grandement contribué à adhérence bactérienne.
VN est un inhibiteur bien connu de complément. Pour estimer l’activité de l’inhibiteur de complément, induite par le sérum de meurtre a été étudiée en présence et absence de WT Hif Vn. cellules exposées résistance au sérum plus élevée que les cellules mutantes de M10Δl/h . Pas de bactéries ont été tués en présence de son (Figure 4A). Fait intéressant, WT Hif présentaient une survie réduite dans VDS et reconstitution du Vn augmente la survie bactérienne. Toutefois, la souche delph Hif M10Δ n’a pas répondu à Vn déplétion parce qu’il ne pouvait pas recruter Vn à la surface de la cellule (Figure 4B). Ces résultats démontrent clairement que Vn est un facteur important hôte qui protège des bactéries de massacre médiée par le complément (Figure 4A-B).
Figure 1 : Haemophilus influenzae sérotype f lie Vn via pH exprimée à la surface. (A) écoulement cytometry résultats montrant la liaison du Vn aux cellules des isolats cliniques de Hif. Chaque isolat clinique (5 x 106 UFC) est incubée avec 250 nM homme Vn. brochée ligand a été détectée à l’aide d’un mouton anti-Vn pAbs et anticorps secondaires de anti-mouton âne conjugué FITC. Escherichia coli BL21 (DE3) a été inclus comme témoin négatif. Les données sont présentées comme l’intensité de fluorescence moyenne des analyses en triple dans trois expériences distinctes et les barres d’erreur représentent SD. (B) écoulement cytometry histogrammes montrant la liaison du Vn à la surface du WT Hif M10 et PH-suppression Hif M10Δ LPH mutant. Des données représentatives de l’un des trois expériences distinctes sont indiquées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : PH recombinant lie à Vn. (A), ELISA résultats démontrant la liaison du PH recombinante à Vn, FH et C4BP. FH a été utilisé comme témoin positif, alors que C4BP était utilisée comme contrôle négatif. Pour analyser les interactions protéine-protéine, Vn, FH et C4BP ont été revêtus en quantités équimolaires (50 nM) les concentrations sur les puits de microplaques. Ensuite, 50 recombinant nM PH-His6x a été ajouté. Lié PH a été détectée à l’aide un HRP conjugué anti-His pAbs. Données présentées sont les moyens d’analyses en triple de trois expériences indépendantes et barres d’erreur indiquent SD. ***, P0,001. (B) BLIanalysis de la liaison de PH à Vn : Vn Recombinant a été immobilisé sur les capteurs de AR2G et la cinétique de la liaison du PH (0,25-4 µM) à Vn ont été enregistrés à l’aide de l’instrument BLI. La constante d’affinité équilibre a été calculée à l’aide de signaux obtenus pour chaque concentration à l’équilibre, et les données ont été ajustées selon l’état d’équilibre cinétique. L’expérience a été répétée trois fois, et un groupe représentatif de données s’affiche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Interaction entre le PH et Vn améliore l’adhérence des bactéries aux surfaces vitrées et les cellules épithéliales. (A) images microscopiques lumière montrant l’adhésion de Hif aux lames de verre enduit de Vn. Les bactéries ont été visualisées par coloration de Gram. Des images représentatives de l’un des trois expériences indépendantes sont indiqués. Ce panneau a été précédemment publié dans le Journal of Immunology7 et est reproduit ici avec la permission de l’Association américaine des immunologistes. (B) l’adhésion de WT Hif M10 cellules A549 les cellules épithéliales en présence et en absence de Vn, moyens d’analyses en triple de trois expériences indépendantes sont tracées et barres d’erreur représentent SD. *, p ≤ 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Vn recruté à la surface des cellules Hif protège les bactéries de meurtre induite par le sérum. (A) WT Hif M10 et mutant Hif M10Δl/h ont été incubées pendant 15 min dans le NHS de 5 % ou de son. (B) la résistance de l’Hif M10 et Hif M10Δl/h à bactéricide effets chez 5 % VDS et VDS additionnés de 250 nM purifiée Vn. données représentent des moyens d’analyses en triple de trois expériences indépendantes, et des barres d’erreur indiquent SD. ***, p 0,001 ; NS, non significatif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Bactéries pathogènes recrutent Vn à la surface des cellules et d’utilisent ce régulateur de complément pour éviter les dépôts de facteurs du complément et l’achèvement du complexe membranaire attaque2. VN fonctionne aussi comme une molécule de pont entre les protéines de surface bactériennes et de récepteurs de surface cellulaire hôte, permettant ainsi des agents pathogènes d’adhérer à la surface des cellules épithéliales et par la suite servir de médiateur internalisation. Dans cette étude, les auteurs décrivent des protocoles qui peuvent servir à estimer i) liaison du Vn à la surface des cellules bactériennes, les interactions de protéine-protéine ii) et les constantes d’affinité et iii) le rôle fonctionnel de Vn en fournissant la résistance au sérum et l’amélioration des adhérence à la surface des cellules hôtes.
Cytométrie en flux est une technique quantitative communément utilisée pour vérifier que les bactéries lient Vn. Toutefois, la concentration de Vn doit être optimisée, que la capacité de fixation du Vn (et différents récepteurs) peuvent dépendre de l’espèce bactérienne. Dans l’essai décrit ici, 1 à 100 µg/mL de Vn ont servi à estimer les paramètres de saturation et de liaison linéaire. Comparaison entre les modes de liaison de WT Hif, Hif M10Δlph mutant et cellules d’Escherichia coli contrôle négatif a montré une nette différence à une concentration de Vn de 20 µg/mL (250 nM). Par conséquent, cette concentration a été utilisée dans toutes les expériences de cytométrie de flux. L’utilisation de Vn à des concentrations supérieures au point de saturation pourrait produire des signaux de faux-positifs. Dilution des anticorps primaires et secondaires doit également être optimisée séparément pour chaque pathogène. La dilution maximale d’anticorps montrant un bon signal doit être choisie. Dans cette étude, nous avons utilisé des 2,5 % BSA comme agent de blocage. Toutefois, la BSA n’est pas un réactif de blocage universel convenant à tous les agents pathogènes. Dans les cas où BSA ne bloque pas les interactions anticorps non spécifique, les autres réactifs de blocage peuvent être utilisés, comme la gélatine de poisson. Liaison du Vn à la surface des cellules de la bactérie pathogène est souvent véhiculée par plusieurs récepteurs21,22. Certains récepteurs ont Vn-affinité élevée, tandis que d’autres peuvent présenter un faible affinité de liaison. Ainsi, suppression d’un seul gène codant pour une protéine de surface ne peut pas entraîner une diminution des interactions Vn mesurée par cytométrie. Comme alternative à la cytométrie en flux, la liaison aux protéines à la surface de la cellule bactérienne peut être examinée à l’aide d’un test d’immunofluorescence (IFA) ou la microscopie électronique à transmission (TEM). Bien que le photoblanchiment des anticorps conjugués fluororeagent peut s’avérer problématique en cytométrie en flux et en IFAs, TEM implique préparation lourde, avec risque important d’introduire des objets23,24. Analyse en cytométrie en flux est en effet préférable d’IFA et TEM en raison des protocoles de préparation témoin plus simples et la possibilité de tester de nombreux échantillons dans un court laps de temps.
Interactions de protéine-protéine dans un système acellulaire ont été analysées par ELISA (Figure 2A) et BLI (Figure 2B). Dans ces deux techniques, parmi les partenaires de liaison a été immobilisé, un biocapteur (pour BLI) ou une plaque de microtitration (ELISA). L’avantage de BLI et ELISA, c’est qu’ils permettent l’analyse des interactions protéine-protéine à l’état natif, empêchant des interactions en dehors du site de liaison active. L’utilité de BLI, cependant, peut être limitée selon la technique utilisée pour l’immobilisation. L’amine procédure utilisée ici au hasard de couplage forme une liaison amide entre n’importe quel groupe amine surface exposée de la protéine et la surface du biocapteur. Cela se traduit par la liaison de molécules de protéine sur la surface du capteur dans différentes orientations. Cela peut entraîner des liaison hétérogène qui ne correspondent pas un modèle cinétique de liaison 1:1. Ce problème potentiel peut être résolu en sélectionnant capteurs de biotine et en ajoutant une balise de streptavidine dans la protéine recombinante à être immobilisé. La fiabilité de BLI est similaire à celle de résonance plasmonique de surface (SPR). L’association et la dissociation de molécules peuvent être mesurés en temps réel en utilisant une technique. Toutefois, le dispositif BLI n’utilise pas de microfluidique et est donc facile à entretenir. En outre, 96 interactions peuvent être testées simultanément dans BLI, alors que seulement quatre échantillons à la fois peuvent être testés à l’aide de la SPR. Il y a une autre étape critique dans BLI qui doit être optimisé. Si les capteurs sont réutilisés, conditions de régénération doivent aussi être optimisées, car qui peut varier pour chaque complexe de protéine-protéine. Dans cette étude, l’acide éthylènediaminetétraacétique 10 mM a été jugé apte pour la régénération du capteur.
Le rôle de Vn en adhérence bactérienne a été testé directement à l’aide de surfaces de verre recouvertes de Vn. Cette approche peut être utilisée pour analyser la liaison de toute bactérie pathogène, y compris les bactéries Gram-négatives tant - positives. Il s’agit d’une technique semi-quantitative qui fournit une évaluation rapide de la capacité d’un pathogène pour la liaison à Vn. Pour obtenir des résultats raisonnables, Vn revêtement doit être optimisé. Dans l’essai décrit ici, revêtement avec Vn à 1, 2 et 5 µg/mL a été examiné, et 2 µg/mL s’est avéré pour être la concentration plus appropriée pour les expériences menées dans cette étude (Figure 3A). Vn excès enduit sur la surface pourrait créer une couche épaisse qui pourrait être facilement dépouillée au cours de l’échantillon de fixation et coloration. En outre, la culture bactérienne ne devrait pas avoir grands amas de cellules ; Cela peut être évité au vortex de la culture avant d’ajouter une partie aliquote de la glisse.
Adhérence des bactéries à la surface des cellules épithéliales a été étudiée à l’aide d’une technique de comptage des plaque (Figure 3A). Ce dosage aussi doit être soigneusement optimisé pour permettre l’observation du rôle de Vn en adhérence bactérienne. VN a différents accepteurs pour les bactéries (à l’extrémité C-terminale) surface intégrines (sur le site de liaison N-terminal RGD) de la cellule. Liaison de Vn aux intégrines induit la signalisation et l’absorption de l’intégrine-Vn complexe1. Si de tels complexes sont internalisées sans bactéries, les résultats seront difficiles à interpréter. Par conséquent, Vn doit être ajouté à la monocouche de cellules épithéliales à 4 ° C. Une fois que Vn a saturé des intégrines à la surface des cellules épithéliales, Vn excès doit être lavé, comme Vn libre peut bloquer bactérienne liaison d’intégrine Vn-dépendante. Dans ce test, nous avons estimé total bactérien compte associé aux cellules épithéliales (c'est-à-direl’affichage composé attaché à la surface et intériorisé les bactéries). Ce dosage peut être étendu pour faire la distinction entre populations bactériennes intracellulaires et externes par le traitement par gentamicine4.
L’analyse de sérum bactéricide utilisé dans le protocole décrit ici a été partiellement modifié la procédure précédemment publiée12,22. Dans l’essai décrit ici, 1,5 x 10que 3 UFC de Hif sont incubées avec le NHS de 5 % pendant 15 min, 5 min de plus longtemps que dans le test décrit précédemment (Figure 4A). La différence entre Hif WT et le mutant isogénique dépourvue de PH était plus évidente à 15 min à 10 min. Par conséquent, nous avons choisi la période d’incubation de 15 min pour cette expérience particulière. Les effets bactéricides du sérum dépendent de la concentration sérique, le temps d’incubation et le nombre de bactéries. Tous les agents pathogènes présentent une capacité remarquable pour éviter l’activité bactéricide du sérum ; certains agents pathogènes peuvent être complètement résistants au sérum, tandis que d’autres peuvent être modérément résistantes ou sensibles. La concentration sérique doit donc être optimisée pour chaque pathogène spécifique examiné. Néanmoins, le sérum tuant essai décrit ici est limité à l’étude des bactéries à Gram négatif, étant donné que le sérum n’a aucun effet bactéricide significatif sur des cellules Gram positif1,5.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financiers.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation d’Anna et Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. et Edla Johansson Foundation, le Swedish Medical Research Council (accorder numéro K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fondation du Cancer à l’Université Hôpital de Malmö, la société physiographiques (de Forssman Fondation) et du Conseil de comté de Skåne Research and Development Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
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