Summary
Questo rapporto descrive protocolli per caratterizzare le interazioni tra proteine della membrana esterna batterica e la vitronectina regolatore complemento umano. I protocolli possono essere utilizzati per studiare le reazioni di associazione e la funzione biologica di vitronectin in qualsiasi specie batteriche.
Abstract
I batteri utilizzare regolatori di complemento come mezzo per eludere la risposta immunitaria. Qui, descriviamo protocolli per valutare l'acquisizione di vitronectin ruolo presso i giochi di superficie delle cellule batteriche nella resistenza al sistema immunitario dell'ospite. Esperimenti di citometria a flusso identificato vitronectina plasmatica umana come un legante per la proteina della membrana esterna batterica del recettore H di Hemophilus influenzae tipo f. Un'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente è stata impiegata per caratterizzare le interazioni proteina-proteina tra proteina ricombinante purificata H e vitronectina e affinità di legame è stata valutata mediante interferometria bio-strato. L'importanza biologica del legame di vitronectin alla proteina H alla superficie delle cellule batteriche di evasione della risposta immunitaria ospite è stata confermata usando un'analisi di resistenza di siero con siero umano normale e vitronectina-vuotati. L'importanza di vitronectin in aderenza batterica è stata analizzata utilizzando lastre di vetro con e senza rivestimento vitronectina, seguita dalla macchiatura di grammo. Infine, è stata studiata l'adesione batterica di monostrati di cellule epiteliali alveolari umane. I protocolli descritti qui possono essere facilmente adattati per lo studio di qualsiasi specie batteriche di interesse.
Introduction
Vitronectina (Vn) è una glicoproteina umana importante coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi via il regolamento del sistema fibrinolitico. VN funziona anche come un regolatore di complemento inibendo la via di complemento terminale durante la formazione del complesso C5b6-7 e polimerizzazione C9. Parecchi agenti patogeni batterici sono stati indicati per reclutare Vn alla superficie delle cellule come mezzo di resistenza complemento deposizione1,2,3. Inoltre, Vn funziona come una molecola di "sandwich" tra batteri e recettori delle cellule epiteliali di host, quindi promuovere l'aderenza e interiorizzazione dei patogeni2,4,5. Associazione di Vn alla superficie delle cellule batteriche è mediata da altre proteine attualmente non identificati. Completamente delucidare il ruolo funzionale di Vn-associazione di evasione della risposta immunitaria tubo richiederà pertanto l'identificazione di proteine Vn-recruiting.
Il primo passo nell'identificazione di proteine che legano il Vn è per verificare se un agente patogeno di interesse possibile associare purificata Vn. flusso cytometry è un metodo pratico e semplice per determinare se Vn è associato a patogeni e cellule. In questo studio, abbiamo valutato l'associazione di Vn da vari Haemophilus influenzae tipo f (Hif) isolati clinici6. Il metodo qui descritto è quantitativo e può essere utilizzato per distinguere la capacità di legame di una grande varietà di ceppi batterici. In uno studio precedente, abbiamo caratterizzato la proteina H (PH) di Hif come Vn-legante della proteina7. Di conseguenza, nello studio presente, il potenziale di Vn-associazione dei mutanti di wild type (WT) Hif e Hif M10Δlph sono stati confrontati usando i protocolli descritti.
Una volta che è stato stabilito che un agente patogeno lega Vn, il secondo passo è di caratterizzare il proteoma di superficie al fine di identificare potenziali proteine che legano il Vn. Una varietà di approcci può essere utilizzata per questo scopo8,9, ma queste metodologie non sono descritti in questo rapporto. Il metodo più adatto per l'esame di interazioni proteina-proteina è recombinantly esprimere proteine di superficie batteriche selezionate in e. coli e purificare dalla cromatografia di affinità. Qui, usiamo il PH e la sua interazione molecolare con Vn per illustrare il metodo. Interazioni tra ricombinante PH e Vn sono state caratterizzate utilizzando un enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) l'analisi7 e una tecnica sviluppata di recente privo di etichetta, conosciuta come bio-strato interferometria (BLI)10,11. Mentre Elisa può essere utilizzata per confermare le interazioni proteina-proteina, BLI fornisce dati dettagliati per quanto riguarda i parametri cinetici delle interazioni.
Per studiare il ruolo funzionale di Vn in aderenza batterica, possono essere utilizzati due diversi saggi. Il primo test qui descritto è la misura diretta di aderenza batterica sulle superfici di vetro rivestite con Vn, mentre il secondo saggio esamina l'aderenza alla superficie delle cellule epiteliali. Per il primo test, lastre di vetro sono stati rivestiti con Vn, e l'associazione di WT o ceppi mutanti di Hif è stata valutata da microscopia e colorazione di Gram. Questa tecnica si distingue facilmente batteri basati sulla capacità di associare Vn12. Adesione batterica alle cellule dei mammiferi è stato quindi analizzato aggiungendo batteri coltivati su un monostrato di cellule epiteliali alveolari di II tipo; allegato batterica è stata valutata contando il numero di formazione di colonie (CFUs) unità. Aderito e interiorizzati batteri possono essere distinti in presenza o assenza di Vn4,13.
Il ruolo di acquisizione Vn in resistenza batterica del siero è stato valutato usando un'analisi di uccisione del siero (cioè, l'attività battericida del siero). Per valutare l'importanza di Vn acquisizione nella resistenza del siero, l'attività battericida del siero Vn-vuotati (VDS) è stata confrontata con quella di siero umano normale (NHS). Il metodo utilizzato prontamente distingue Vn-associazione contro batteri vincolanti basati sulla resistenza del siero. Abbiamo usato questo metodo per studiare il ruolo di Vn nella resistenza del siero di diversi batteri patogeni4,12.
Sono stati segnalati numerosi metodi per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Qui, descriviamo una serie di protocolli che possono essere facilmente adattate per lo studio di qualsiasi agente patogeno al fine di valutare il ruolo di Vn nella patogenesi. Abbiamo testato questi protocolli usando vari agenti patogeni, e Hif è stato scelto come esempio per questo report.
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Protocol
1. analisi di Vn come ligando della proteina della superficie batterica
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Rilevamento di Vn-associazione sulla superficie batterica mediante citometria a flusso
Nota: In citometria a flusso, abbiamo usato side scatter e forward scatter a cancello eventi positivi. Per esaminare le interazioni con Vn, gli isolati clinici di Hif (n = 10)7 sono stati selezionati insieme a e. coli BL21 (DE3) come controllo negativo (Figura 1A).- Hif cultura clinica isola nel mezzo di infusione (BHI) cervello-cuore completato con 10 µ g/mL NAD ed Emina a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min. Utilizzare il mezzo di Luria-Bertani alla cultura Escherichia coli14. Raccolta di Hif al Mid-registro fase (OD600 = 0,3)15e risospendere i batteri in tampone fosfato salino (PBS), pH 7,2, contenente 1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) (tampone bloccante; PBS-BSA). Regolare le sospensioni a 109 CFU/mL.
- Trasferire le aliquote che contiene 5 x 106 CFU per provette di turno-fondo polistirene 5 mL (12 x 75 mm2) e aggiungere 1 mL di tampone bloccante. Centrifugare la sospensione a 3.500 × g a temperatura ambiente (TA)16 per 5 min per pellet i batteri, quindi aspirare accuratamente per rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet.
- Risospendere il pellet batterico con 50 μL di tampone bloccante contenente 250 nM Vn e incubare i campioni per 1 h a RT senza agitare. Dopo l'incubazione, pellet i batteri mediante centrifugazione a 3.500 x g per 5 minuti, quindi lavare il pellet tre volte con PBS e passaggi di centrifugazione simili.
- Per il pellet batterico, aggiungere 50 μL di Vn gli anticorpi policlonali di pecore primario anti-umano (Pass) alla diluizione di 1: 100 in PBS-BSA. Incubare la sospensione per 1 h a RT, quindi lavare i batteri tre volte con PBS per rimuovere gli anticorpi non legati (come descritto al punto 1.1.3).
- Successivamente, aggiungere 50 μL di PBS-BSA contenente isotiocianato di fluoresceina (FITC)-coniugato asino delle anti-pecore pAbs (diluizione 1: 100) e incubare a temperatura ambiente per 1 h al buio.
- Preparare un controllo vuoto incubando i batteri con blocco buffer solo e rubriche personali senza Vn.
- Lavare i batteri tre volte con 1 mL di tampone bloccante e pellet la sospensione mediante centrifugazione, come descritto nella sezione 1.1.2. Infine, risospendere il pellet batterico con 300 µ l di PBS e analizzare di flusso cytometry7.
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Analisi di ELISA dell'interazione tra PH ricombinante e Vn
Nota: I controlli devono essere inclusi per escludere il legame non specifico. Proteina umana di fattore H (FH) o C4b-binding (C4BP) vengono utilizzati come controlli positivi e negativi, rispettivamente.- Diluire ciascuna delle proteine umane (Vn, FH e C4BP) separatamente a 50 nM in Tris-HCl, pH 9.0 (tampone di rivestimento). Pipettare 100 µ l di soluzione proteica in ciascun pozzetto della micropiastra Polysorp. Chiudere le piastre con il coperchio e conservare a 4 ° C durante la notte (16h) per facilitare l'immobilizzazione della proteina su pozzetti della piastra microtiter.
- Scartare la soluzione dalla piastra di microtitolo inclinando a testa in giù sopra il lavandino e lavare i pozzetti tre volte con 300 µ l di PBS/pozzetto. Bloccare i pozzetti per 1 h a RT con PBS contenente 2,5% (p/v) BSA (PBS-BSA).
- Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, lavare i pozzetti tre volte con 300 µ l di PBS contenente 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST) per pozzetto. Aggiungere 100 µ l di 50 ricombinante nM PH His-tag per ogni campione ed incubare per 1 h a TA. Nei pozzetti di controllo, aggiungere solo 100 µ l di PBS-BSA.
Nota: Il gene lph codifica PH da Hif è stato amplificato dalla PCR e clonato nel vettore di espressione pET26b che aggiunge un 6 × His-tag al C-terminale della proteina espressa. Il vettore ricombinante è stato trasformato in e. coli BL21 (DE3) per l'espressione. NI-NTA resina è stata usata per purificare la proteina ricombinante15. - Scartare la soluzione della proteina e rimuovere le proteine non associate lavando i pozzetti tre volte con 300 µ l di PBST. Aggiungere 100 µ l di perossidasi di PBS-BSA contenente rafano (HRP)-coniugato anti-sua pAbs (01:10, 000 diluizione) e incubare per 1 h a TA.
- Preparare soluzione 20 mM A sciogliendo tetrametilbenzidina in una soluzione di 5% di acetone e 45% di metanolo. Per preparare la soluzione B, sciogliere 19,2 g di acido citrico in 1.000 mL di H2O, regolare il pH a 4,25 aggiungendo KOH, quindi aggiungere 230 µ l di 30% H2O2. Conservare entrambe le soluzioni al buio a TA. Appena prima dell'uso, mescolare 500 µ l di soluzione B con 9,5 mL di soluzione A per preparare il reagente di rivelazione di ELISA.
- Lavare i pozzetti tre volte con 300 µ l di PBST e rilevare i complessi antigene-anticorpo aggiungendo 100 µ l di reagente di rivelazione di ELISA ad ogni pozzetto.
- Aggiungere 50 µ l di 1 M H2così4/well per arrestare la reazione. Misurare la densità ottica dei pozzetti a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
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Studio della cinetica di interazione di ricombinante PH e Vn utilizzando BLI
- Immobilizzare Vn umano sui sensori ammina-reattivo utilizzando l'ammina accoppiamento metodo, secondo linee guida11 del produttore.
- Con PBS, in serie diluire il ligando (ricombinante PH) da 0 a 4 µM e trasferire le soluzioni risultante per micropiastra 96 pozzetti neri, fondo piatto. Eseguire l'esperimento a 30 ° C, utilizzando un BLI strumento17.
- Caricare la cartella di dati del software di analisi dati BLI. Selezionare l'opzione 'selezione sensore' . Quindi, seleziona 'riferimento ben' (rivestite con Vn sensore in PBS) per sottrazione.
- Selezionare 'allineamento asse y alla linea di base' e selezionare 'interstep correzione e allineare all'associazione'. Premere 'processo dati' che automaticamente si aprirà la scheda di analisi.
- Nella scheda analisi, selezionare l'opzione 'associazione e dissociazione' in curva. Selezionare il modello di ' associazione 1:1 e raccordo globale '. Premere 'forma curva' e l'esportazione di montaggio dati17.
2. caratterizzazione del ruolo di Vn in aderenza batterica
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Studio di aderenza batterica alle superfici di vetro rivestite con Vn
- Preparare una soluzione di 2 µ g/mL di Vn in tampone PBS e dispensare 10 µ l di questa soluzione su un microscopio di vetro scorrevole come una sola goccia. Consentire la discesa ad asciugare il vetrino per 30 min a RT. cappotto una diapositiva con albumina sierica umana (HSA) come controllo negativo.
- Lavare tre volte le diapositive di vetro rivestite con proteina immergendo i vetrini per due secondi in un becher contenente PBS per rimuovere l'eccesso di proteine non patinata. Aggiungere 20 mL di coltura fresca di Hif (descritto al punto 1.1.1) in una capsula Petri in plastica sterile e immergere il Vn- / slides vetro rivestite con HSA nel terreno di coltura. Incubare i piatti a 37 ° C per 1 h con agitazione a 20 giri/min.
Nota: Hif M10 e Hif M10Δlph erano coltivate in terreno BHI liquido o su piastre di agar cioccolato. Il mezzo per il mutante lph è stato completato con 10 µ g/mL kanamicina15. - Dopo l'incubazione, rimuovere eventuali batteri non associati immergendo i vetrini tre volte in un becher pieno di PBS. Visualizzare i batteri di colorazione di Gram, come descritto.
- Rimuovere l'eccesso di PBS da ogni diapositiva di inclinarla e toccando il bordo sulla carta velina. Asciugare i vetrini per 3-5 min a RT e difficoltà batteri aderiti passando ogni diapositiva tre volte sopra una fiamma.
- Tenendo il vetrino per le estremità con due dita su un vassoio di colorazione, quindi aggiungere 3-4 gocce (200 – 300 µ l) di soluzione viola di cristallo del 2,3%. Attendere 60 s, quindi lavare i vetrini sotto una leggera corrente di rubinetto acqua per 3 – 4 s.
- Aggiungere 3-4 gocce di 0,33% soluzione di iodio sulle diapositive. Attendere 1 minuto, quindi sciacquare il vetrino sotto un leggero getto d'acqua del rubinetto. Asciugare accuratamente le diapositive di carta assorbente.
- Aggiungere 3-4 gocce di soluzione decolorante contenente alcool isopropilico al 75% e 25% acetone nella diapositiva. Dopo 5 – 10 s, lavare il vetrino sotto un leggero getto d'acqua del rubinetto.
- Aggiungere 3-4 gocce (200 – 300 µ l) di soluzione di base carbolfuchsin. Attendere 1 minuto, quindi risciacquare le diapositive sotto un leggero getto d'acqua del rubinetto. Asciugare le diapositive utilizzando la carta assorbente.
- Visualizzare i batteri sotto un microscopio chiaro, selezionando un obiettivo a immersione in olio a 100 X ingrandimento18. Confrontare l'aderenza di Hif WT e mutanti batteri sulle superfici di vetro rivestito di Vn e HSA.
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Studio di aderenza Vn-dipendente dei batteri alle cellule epiteliali
Nota: Questa analisi efficiente aderenza è stata usata in nostri precedenti studi4,7.- Cellule A549 di cultura (cellule epiteliali alveolari di tipo II) in un matraccio di cultura del tessuto 75 cm2 con F12 supplementato con 10% di siero fetale di vitello (vol/vol) (FCS) (sostanza completa) e 5 µ g/mL Gentamicina. Incubare la beuta in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C per 3 giorni fino al 80% confluenti (confluency può essere stimato mediante visualizzazione copertura superficiale da parte delle cellule usando microscopio invertito). I quattro passaggi seguenti descrivono come preparare le cellule epiteliali per il dosaggio19,20.
- Lavare il monostrato cellulare nel pallone due volte con 20 mL di PBS di agitando delicatamente. Per staccare le cellule dalla superficie del pallone, aggiungere 2 mL di soluzione di enzima di distacco delle cellule e incubare la beuta per 5 min a 37 ° C. Tocca il pallone con il palmo della mano per staccare tutte le celle dalla superficie plastica. Pipettare su e giù un paio di volte per disperdere i ciuffi delle cellule.
- Aggiungere 18 mL di terreno completo F12 il matraccio e trasferire la sospensione cellulare intero in una provetta sterile da Falcon 50 mL. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 200 x g a RT e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno completo F12.
- Rimuovere 10 µ l di sospensione cellulare e metterlo in una provetta Eppendorf, quindi aggiungere 90 µ l di soluzione di blu di Trypan. Caricare il campione in un emocitometro (profondità 0,1 mm) dopo aver posizionato il vetrino coprioggetti.
- Contare tutte le cellule vitali nelle aree A, B, C e D (ogni campo è costituito da 16 quadrati e ogni piazza ha una superficie di 0,0025 mm2), quindi calcolare il numero medio di cellule ([A + B + C + D] / 4). Calcolare il numero di cellule per millilitro usando la seguente equazione:
Vitali cellule/mL = media delle celle totali × 104 × diluizione fattore20.
Nota: Qui, il fattore di diluizione è 10. - Diluire la sospensione cellulare a 5.0 x 103 cellule/mL utilizzando media completa contenente gentamicina 5 µ g/mL. Dispensare 500 µ l di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO2 fino a quando le cellule sono 90% confluenti.
- Prima dell'infezione batterica, rimuovere il supporto dai pozzetti e aggiungere mezzo F12 (senza FCS), quindi incubare per una notte a 37 ° C.
- Lavare il monostrato cellulare tre volte con 500 µ l di PBS a RT. Posizionare la piastra sul ghiaccio e aggiungere 100 µ l di pre-refrigerati F12 mezzo, contenente 10 µ g/mL di piastra Vn. Incubare a 4 ° C per 1 h. Per pozzetti di controllo, aggiungere solo F12 medio.
- Dopo l'incubazione, scartare la soluzione pipettando e lavare lo strato delle cellule due volte con 1 mL di PBS a RT. Risospendere una cultura di recente sviluppata Hif M10 (punto 1.1.1) nel mezzo di F12 (2 × 108 CFU/mL). Aggiungere 100 µ l della sospensione batterica in ciascun pozzetto e incubare la piastra per 2 ore a 37 ° C.
Nota: Ciascun pozzetto contiene circa 2 x 105 A549 cellule. Per l'infezione, 2 x 107 CFU batterica sono stati aggiunti, corrispondente ad una molteplicità di infezione di 100. - Rimuovere il mezzo di pipettaggio e lavare le cellule epiteliali A549 tre volte con PBS. Aggiungere 50 µ l/pozzetto di soluzione di distacco delle cellule e incubare la piastra per 5 min a 37 ° C.
- Successivamente, aggiungere 50 µ l di terreno completo F12 per pozzetto per fermare la reazione enzimatica. Trasferire le cellule epiteliali (≈ 100 μL [cioè, l'intero volume]) da ciascun pozzetto in una provetta di vetro da 6 mL contenente quattro perle di vetro. Lisare le cellule a RT nel Vortex per 2 min.
- Diluire 10 µ l della cella lysata 100 volte aggiungendo 10 µ l di lisato di 990 µ l di terreno di F12. Piastra 10 µ l del campione diluito su una piastra di agar cioccolato.
- Incubare la piastra di agar cioccolato a 37 ° C durante la notte, poi contare le colonie. Ogni Colonia rappresenta un CFU.
- Cellule A549 di cultura (cellule epiteliali alveolari di tipo II) in un matraccio di cultura del tessuto 75 cm2 con F12 supplementato con 10% di siero fetale di vitello (vol/vol) (FCS) (sostanza completa) e 5 µ g/mL Gentamicina. Incubare la beuta in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C per 3 giorni fino al 80% confluenti (confluency può essere stimato mediante visualizzazione copertura superficiale da parte delle cellule usando microscopio invertito). I quattro passaggi seguenti descrivono come preparare le cellule epiteliali per il dosaggio19,20.
3. analisi della resistenza Vn-dipendente per l'attività battericida del siero umano
- NHS di acquisto da una fonte commerciale. Preparare VDS come descritto in precedenza12. Ricostituire il VDS con 180 nM Vn che equivale a Vn presente nel NHS.
- Preparate del siero inattivato per calore (HIS) scaldando NHS a 56 ° C per 30 min al fine di inattivare proteine del complemento.
Nota: La concentrazione ottimale del siero (5%) e il tempo di incubazione (15 min) per il dosaggio descritto nei passaggi 3.3 – 3.7 sono stati determinati empiricamente per Hif15; questi parametri potrebbero variare per altri batteri patogeni. - Cultura di batteri (in questo caso, Hif M10 e il mutante Hif M10Δlph) alla fase di Mid-registro (OD600 = 0,3). A pellet batteri mediante centrifugazione a 3.500 x g per 10 min.
- Risospendere il pellet batterico con 1 volume di gelatina destrosio glucosio contenente tampone (DGVB ++; pH 7.3) Veronal del 2,5% (p/v), 2 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2e 0.1% (wt/vol) gelatina.
- Aggiungere 1,5 x 103 CFU di batteri a 100 µ l di DGVB ++ contenente 5% di siero (NHS, suo, VDS, o VDS + 180 nM Vn). Incubare il campione a 37 ° C per 15 minuti con agitazione a 300 giri/min.
- Rimuovere un aliquota 10 µ l dalla miscela di reazione a 0 min (esempio di T0 ) e 15 min (esempio dit T) e piastra su agar cioccolato. Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte.
- Dopo incubazione, contare le colonie che appaiono sulla piastra. Calcolare la percentuale di batteri uccisi12 utilizzando la seguente equazione: (CFU a Tt) / (CFU T0) × 100.
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Representative Results
VN-si legano alla superficie dei batteri è stato determinato tramite flusso cytometry. Tutti Hif isolati clinici testati in questo studio ha reclutato Vn alla superficie delle cellule. Alcuna interazione di Vn con superficie delle cellule è stata osservata per il ceppo di controllo negativo Escherichia coli (Figura 1A). Come illustrato nella Figura 1B, PH è una proteina legante il Vn principale sulla superficie delle cellule di Hif. Associazione di Vn dal ceppo WT Hif M10 ha causato uno spostamento nella popolazione, mentre Hif M10Δlph non ha fatto associare Vn ed è sembrato simile al controllo.
Interazioni proteina-proteina tra PH e Vn sono stati stimati da ELISA e BLI. PH ricombinante è stato permesso di associare con fattore umano H, Vn e C4BP (controllo negativo) coattato pozzetti di micropiastra piastre ELISA. Associato PH è stata stimata utilizzando un pAbs anti-sua. I risultati hanno indicato chiaramente un'interazione significativa fra PH e Vn e fattore H, rispetto al C4BP (Figura 2A). Interazione tra PH e Vn sono stati stimati in tempo reale utilizzando BLI. Figura 2 B Mostra le curve di risposta di associazione di PH per la superficie del sensore rivestite con Vn. Affinità di legame (in questo caso, Kd = 2,2 µM) è stata stimata inserendo i dati di cinetica di legame allo steady-state.
I batteri carente espressione del PH sulla superficie delle cellule (Hif M10Δlph) ha esibita ridotta aderenza alle superfici di vetro rivestite con Vn rispetto alle cellule WT (Figura 3A). Inoltre, la presenza di Vn sulla superficie delle cellule epiteliali ha migliorato significativamente l'aderenza di Hif (Figura 3B). Questi risultati hanno indicato che l'interazione di PH-Vn hanno contribuito significativamente alla aderenza batterica.
VN è un inibitore di complemento ben noto. Per stimare l'attività d'inibizione di complemento, l'uccisione del siero è stato esaminato in presenza ed assenza di cellule di Vn. WT Hif hanno esibito più alta resistenza di siero che M10Δlph cellule mutanti. Nessun batteri sono stati uccisi in presenza di suo (Figura 4A). Interessante, WT Hif ha esibito ridotta sopravvivenza in VDS ed il rifornimento di Vn ha aumentato la sopravvivenza batterica. Tuttavia, il ceppo dilph Hif M10Δ non ha risposto alla deplezione di Vn perché non poteva assumere Vn alla superficie delle cellule (Figura 4B). Questi risultati dimostrano chiaramente che Vn è un fattore importante ospite che protegge i batteri dall'uccisione di complemento-mediata (Figura 4A-B).
Figura 1 : Haemophilus influenzae sierotipo f associa Vn via Tel superficie-espresso (A) flusso cytometry risultati di Vn che lega alle cellule degli isolati clinici di Hif. Ogni isolato clinico (5 x 106 CFU) è stato incubato con 250 nM umani Vn. Bound ligando è stato rilevato usando una pecora anti-Vn pAbs e anticorpi secondari di asino FITC Coniugato anti-pecore. Escherichia coli BL21 (DE3) era inclusa come controllo negativo. I dati sono presentati come l'intensità media di fluorescenza da triplice copia analisi in tre esperimenti separati e barre di errore rappresentano gli istogrammi di citometria a flusso SD. (B) dimostrando di Vn si legano alla superficie di WT Hif M10 e PH-omissione Hif M10Δ LPH mutante. Vengono visualizzati dati rappresentativi da uno dei tre esperimenti separati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : PH ricombinante si lega a Vn. (A), ELISA risultati dimostrando l'associazione di PH ricombinante a Vn, FH e C4BP. FH è stata utilizzata come controllo positivo, mentre C4BP è stato usato come controllo negativo. Per analizzare le interazioni proteina-proteina, Vn, FH e C4BP erano rivestite in equimolare (50 nM) concentrazioni su pozzetti di piastre di microtitolazione. Avanti, 50 ricombinante nM PH-His6x è stato aggiunto. Associato PH è stato rilevato utilizzando un HRP-coniugato anti-sua pAbs. I dati indicati sono i mezzi di analisi triplicate da tre esperimenti indipendenti e barre di errore indicano SD. * * *, P≤0.001. (B) BLIanalysis dell'associazione di PH a Vn: Vn ricombinante è stata immobilizzata su sensori AR2G e la cinetica di legame del PH (0,25-4 µM) a Vn sono stati registrati utilizzando lo strumento BLI. La costante di affinità di equilibrio è stata calcolata usando segnali ottenuti per ciascuna concentrazione all'equilibrio, e i dati sono stati montati secondo cinetica allo stato stazionario. L'esperimento fu ripetuto tre volte, e viene visualizzato un set di dati rappresentativi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Interazione tra PH e Vn migliora l'aderenza batterica alle superfici di vetro e cellule epiteliali. (A) luce microscopici immagini che mostrano l'aderenza di Hif a diapositive di vetro rivestite con Vn. I batteri sono stati visualizzati dalla macchiatura di grammo. Immagini rappresentative da uno dei tre esperimenti indipendenti sono mostrati. Questo pannello è stato precedentemente pubblicato nel Journal of Immunology7 ed è qui riprodotto con il permesso dal Associazione americana di immunologi. (B) l'aderenza di WT Hif M10 cellule alle cellule epiteliali A549 in presenza ed assenza di Vn, mezzi di analisi triplicate da tre esperimenti indipendenti vengono tracciati e barre di errore rappresentano SD. *, p ≤ 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Vn reclutati alla superficie delle cellule di Hif protegge i batteri dall'uccisione del siero-mediata. (A) WT Hif M10 e mutante Hif M10Δlph sono state incubate per 15 min in 5% NHS o il suo. (B) resistenza di Hif M10 e Hif M10Δlph a battericida degli effetti nel 5% VDS e VDS completati con 250 nM purificato Vn. dati rappresentano mezzi di analisi triplicate da tre esperimenti indipendenti e barre di errore indicano SD. * * *, p ≤0.001; NS, non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Batteri patogeni reclutano Vn alla superficie delle cellule e utilizzano questo regolatore di complemento per impedire la deposizione di fattori del complemento e completamento del complesso membrana attacco2. VN funziona anche come una molecola di ponte tra proteine di superficie batteriche e host recettori di superficie, consentendo in tal modo gli agenti patogeni di aderire alla superficie delle cellule epiteliali e successivamente mediare interiorizzazione. In questo studio, descriviamo i protocolli che possono essere utilizzati per stimare i) associazione di Vn alla superficie delle cellule batteriche, interazioni proteina-proteina ii) e costanti di affinità, e iii) il ruolo funzionale di Vn nel fornire resistenza del siero e la valorizzazione del aderenza alla superficie della cellula ospite.
Citometria a flusso è una tecnica quantitativa comunemente utilizzata per verificare che i batteri si legano Vn. Tuttavia, la concentrazione di Vn deve essere ottimizzata, in quanto la capacità di legare il Vn (e vari recettori) possono differire a seconda della specie batterica. Nel dosaggio descritto qui, 1 – 100 µ g/mL di Vn sono stati utilizzati per stimare i parametri di saturazione e di associazione lineare. Confronto tra i modelli di associazione di WT Hif, l'Hif M10Δlph mutante e controllo negativo Escherichia coli cellule hanno mostrato una chiara differenza ad una concentrazione di Vn di 20 µ g/mL (250 nM). Pertanto, questa concentrazione è stata utilizzata in tutti gli esperimenti di citometria a flusso. L'uso di Vn a concentrazioni di sopra del punto di saturazione potrebbe produrre falsi positivi segnali. Diluizione degli anticorpi primari e secondari dovrà anche essere ottimizzati separatamente per ogni agente patogeno. La diluizione massima di anticorpi mostrando un buon segnale dovrebbe essere scelto. In questo studio, abbiamo usato il 2,5% BSA come agente bloccante. Tuttavia, la BSA non è un reagente bloccante universale adatto per tutti gli agenti patogeni. Nei casi in cui BSA non blocca interazioni anticorpo non specifici, altri reagenti di blocchi possono essere utilizzati, come gelatina di pesce. Di Vn si legano alla superficie delle cellule del patogeno batterico è spesso mediata da molteplici recettori21,22. Alcuni recettori hanno alta affinità Vn-legante, mentre altri possono presentare bassa affinità di legame. Così, l'eliminazione di un solo gene che codifica per una proteina di superficie non potrebbe comportare una diminuzione in Vn interazioni valutate da citometria a flusso. Come alternativa al flusso cytometry, legame con le proteine sulla superficie delle cellule batteriche può essere esaminato mediante un test di immunofluorescenza (IFA) o microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Anche se photobleaching di anticorpi coniugati fluororeagent può essere problematico in citometria a flusso e IFAs, TEM comporta la preparazione del campione ingombrante, con notevole rischio di introdurre artefatti23,24. Analisi di citometria a flusso è infatti preferibile IFA e TEM a causa di semplici protocolli di preparazione del campione e la possibilità di testare molti campioni entro un breve lasso di tempo.
Interazioni proteina-proteina in un sistema libero di cella sono state analizzate da ELISA (Figura 2A) e BLI (Figura 2B). In entrambe le tecniche, uno dei partner associazione era immobilizzato, sia su un biosensore (per BLI) o micropiastra (ELISA). Il vantaggio di BLI ed ELISA è che essi consentono analisi delle interazioni proteina-proteina nel loro stato nativo, prevenire interazioni non specifici all'esterno del sito associazione attiva. L'utilità di BLI, tuttavia, può essere limitata a seconda della tecnica di immobilizzazione utilizzata. L'ammina accoppiamento procedura utilizzata qui casualmente forma un legame di ammide fra qualsiasi gruppo amminico di superficie esposta della proteina e la superficie del biosensore. In questo modo immobilizzazione delle molecole della proteina sulla superficie del sensore in vari orientamenti. Questo può comportare associazione eterogenei che non si adatta un modello di cinetica di associazione 1:1. Questo potenziale problema può essere risolto selezionando sensori di biotina e aggiunta di un tag di streptavidina nella proteina ricombinante di essere immobilizzato. L'affidabilità di BLI è simile a quella di risonanza plasmonica di superficie (SPR). L'associazione e la dissociazione delle molecole può essere misurati in tempo reale utilizzando una delle due tecniche. Tuttavia, il dispositivo BLI non utilizza microfluidica e quindi è facile da mantenere. Inoltre, 96 interazioni possono essere testate contemporaneamente in BLI, considerando che solo quattro campioni alla volta possono essere testati utilizzando SPR. C'è un altro passo fondamentale in BLI che deve essere ottimizzato. Se sensori vengono riutilizzati, condizioni di rigenerazione dovrebbero anche essere ottimizzate, che potrebbe variare per ogni complesso proteina-proteina. In questo studio, l'acido etilendiamminotetracetico 10 mM è stato trovato adatto per la rigenerazione del sensore.
Il ruolo di Vn in aderenza batterica è stato testato direttamente utilizzando superfici di vetro rivestite con Vn. Questo approccio può essere impiegato per analizzare l'associazione per qualsiasi agente patogeno batterico, inclusi batteri sia Gram-negativi e - positivi. Si tratta di una tecnica semiquantitativa che fornisce rapida valutazione della capacità di un agente patogeno per l'associazione a Vn. Per ottenere risultati ragionevoli, Vn rivestimento deve essere ottimizzato. Nel saggio qui descritto, rivestimento con Vn a 1, 2 e 5 µ g/mL è stato esaminato e 2 µ g/mL è stato trovato per essere la concentrazione più adatta per gli esperimenti condotti in questo studio (Figura 3A). In eccesso Vn rivestito sulla superficie potrebbe creare uno spesso strato che potrebbe facilmente essere tolto durante il campione di fissaggio e colorazione. Inoltre, la coltura batterica non dovrebbe avere grandi ciuffi di cellule; Questo può essere evitato nel Vortex la cultura prima di aggiungere un'aliquota per le diapositive.
L'aderenza batterica sulla superficie delle cellule epiteliali è stato esaminato usando una tecnica di conteggio di piatto (Figura 3A). Anche questo dosaggio deve essere attentamente ottimizzato per consentire l'osservazione del ruolo di Vn in aderenza batterica. VN ha siti di legame differenti per i batteri (al C-terminale) e delle cellule recettori integrinici superficiale (presso il sito di legame RGD N-terminale). Il legame di Vn le integrine induce la segnalazione e l'assorbimento del complesso integrina-Vn1. Se tali complessi sono interiorizzati senza batteri, i risultati saranno difficili da interpretare. Di conseguenza, Vn deve aggiungersi il monostrato di cellule epiteliali a 4 ° C. Una volta Vn ha saturato i recettori integrinici alla superficie delle cellule epiteliali, Vn in eccesso deve essere lavato fuori, come Vn gratuito in grado di bloccare batterica associazione di integrina Vn-dipendente. In questa analisi, abbiamo stimato totale batterica conta associati con le cellule epiteliali (cioè, la lettura comprende sia collegata alla superficie e interiorizzato batteri). Questo test può essere esteso per distinguere tra popolazioni batteriche esterne e intracellulare dal trattamento con gentamicina4.
L'analisi battericida del siero utilizzato nel protocollo descritto qui è stata parzialmente modificata dalla procedura precedentemente pubblicati12,22. Nel dosaggio descritto qui, 1.5 x 10che 3 CFU di Hif sono state incubate con NHS di 5% per 15 min, 5 min più lungo nel dosaggio descritto in precedenza (Figura 4A). La differenza tra WT Hif e il mutante isogeniche privo di PH era più evidente a 15 min rispetto a 10 min. Pertanto, abbiamo selezionato il periodo di incubazione di 15 min per questo particolare esperimento. Gli effetti battericidi del siero dipendono la concentrazione nel siero, il tempo di incubazione e il numero di batteri. Tutti gli agenti patogeni presentano una notevole capacità per evitare l'attività battericida del siero; alcuni agenti patogeni possono essere completamente resistente al siero, mentre altri possono essere moderatamente resistente o sensibili. La concentrazione nel siero di conseguenza deve essere ottimizzata per ogni specifico patogeno esaminato. Tuttavia, il siero uccidendo dosaggio descritto qui è limitato allo studio dei batteri gram-negativi, dal momento che il siero non ha alcun significativo effetto battericida su cellule Gram-1,5.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dalla Fondazione di Anna ed Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. e fondamento di Edla Johansson, svedese Medical Research Council (concedere numero K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fondazione di cancro all'Università Ospedale a Malmö, della società fisiografica (di Forssman Foundation) e del Consiglio della Contea di Skåne Fondazione ricerca e sviluppo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
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