Summary
이 보고서는 특성화 세균성 외부 막 단백질 및 인간 보완 레 귤 레이 터 vitronectin 사이 상호 작용에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 바인딩 반응 어떤 세균성 종에 vitronectin의 생물 학적 기능을 공부 하 고 사용할 수 있습니다.
Abstract
박테리아는 호스트 면역 반응을 회피의 수단으로 보완 레 귤 레이 터를 사용 합니다. 여기, 우리는 호스트 면역 시스템에 저항에 세균성 세포 표면 놀이에 역할 vitronectin 인수를 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 교류 cytometry 실험 Haemophilus 함께 유형 f의 세균성 수용 체 외부 막 단백질 H에 대 한 리간드로 인간의 플라즈마 vitronectin를 확인. 순화 된 재조합 단백질 H와 vitronectin, 간의 단백질-단백질 상호 작용 하는 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 고용 되었다 하 고 바이오-레이어 간섭계를 사용 하 여 평가 했다 선호도 바인딩. 호스트 면역 반응의 회피에 세균성 세포 표면에 단백질 H vitronectin의 바인딩의 생물학 중요성 정상 및 vitronectin 고갈 인간의 혈 청 혈 청 저항 분석 결과 사용 하 여 확인 되었다. 세균성 부착에서 vitronectin의 중요성 vitronectin 코팅, 그램 얼룩 뒤 없이 유리 슬라이드를 사용 하 여 분석 했다. 마지막으로, 세균성 접착 인간 폐 포 상피 세포 monolayers 조사 했다. 여기에 설명 된 프로토콜 관심의 어떤 세균성 종의 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.
Introduction
Vitronectin (Vn)는 중요 한 인간의 당단백질 fibrinolytic 시스템의 규제를 통해 항상성 유지에 관여 이다. Vn 또한 보완 레 귤 레이 터로 C5b6-7 복잡 한 형성과 C9 중 합 하는 동안 터미널 보충 통로 억제 함으로써 작용 한다. 여러 가지 세균성 병원 체 저항 보완 증 착1,2,3의 수단으로 세포 표면에 Vn을 모집 하기 위해 표시 되었습니다. 또한, Vn 박테리아 및 호스트 상피 세포 수용 체, 그로 인하여 추진 준수 및 병원 체2,,45의 국제화 사이 "샌드위치" 분자 기능을 합니다. 바인딩 Vn의 세균성 세포 표면에는 현재 정체 불명된 다른 단백질에 의해 중재 됩니다. Vn-에서 바인딩 회피 호스 면역 반응의 기능적인 역할을 완전히 elucidating 따라서 Vn 모집 단백질의 식별을 요구할 것 이다.
Vn-바인딩 단백질을 확인 하는 초기 단계는 관심의 병원 체는 순화 Vn. 교류 cytometry 바인딩할 수 있는지 여부를 테스트 Vn 병원 체 세포에 바인딩되어 있는지 여부를 확인 하는 편리 하 고 간단한 방법입니다. 이 연구에서 우리는 다양 한 Haemophilus 함께 유형 f (Hif) 임상 격리6Vn의 바인딩을 평가. 여기에 설명 된 방법은 양적 이며 다양 한 세균성 긴장의 바인딩 용량을 구분 하는 데 사용할 수 있습니다. 이전 연구에서 우리는 Vn-바인딩 단백질7단백질 H (전화), Hif의 특징. 따라서, 현재 연구에서 야생-타입 (WT) Hif 및 Hif M10Δlph 돌연변이의 Vn 바인딩 잠재력 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 비교 했다.
병원 체 Vn 바인딩합니다 확인은, 두 번째 단계는 표면 프로테옴 잠재적인 Vn-바인딩 단백질 식별 특성. 다양 한 접근법이 목적8,9를 사용할 수 있습니다 그러나 이러한 방법론은이 보고서에서 설명 하지 않습니다. 단백질 단백질 상호 작용을 조사 하기 위한 가장 적합 한 방법은 recombinantly 대장균 에서 선택한 세균성 표면 단백질을 표현 하 고 친화성 크로마토그래피에 의해 정화 하입니다. 여기, 우리 사용 PH Vn와 분자의 상호 작용 방법을 설명 합니다. 재조합 PH와 Vn 간의 상호 작용은 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)7 과 바이오-레이어 간섭계 (BLI)10,11이라는 최근에 개발 된 레이블 없는 기술을 사용 하 여 특징 이었다. 반면 ELISAs 단백질 단백질 상호 작용을 확인 하는 데 사용 될 수, 씨는 상호 작용의 운동 매개 변수에 대 한 자세한 데이터를 제공 합니다.
세균성 부착에서 Vn의 기능적 역할을 연구 하기 두 개의 서로 다른 분석을 활용할 수 있습니다. 여기에 설명 된 첫 번째 분석 결과 두 번째 시험 검사 상피 세포의 표면에 부착 하는 반면 Vn 코팅 유리 표면에 세균성 부착의 직접 측정은. 첫 번째 분석 결과 대 한 유리 슬라이드 했다 Vn, 코팅 그리고 WT 또는 돌연변이 Hif 긴장의 바인딩 그램 얼룩 그리고 현미경 검사 법에 의해 평가 되었다. 이 기술은 쉽게 박테리아가 Vn12바인딩할 능력에 따라 구분 합니다. 포유류 세포에 세균성 접착의 유형 II 치조 상피 세포; 단층에 교양된 박테리아를 추가 하 여 다음 분석 세균성 부착 했다 식민지 형성의 수를 계산 하 여 평가 단위 (CFUs). 준수 하 고 내 면 박테리아는 Vn4,13의 유무에서 고유 수 있습니다.
Vn 수집 세균 혈 청 저항에서의 역할은 혈 청 죽이 분석 결과 (즉, 혈 청 살 균 활동)를 사용 하 여 평가 되었습니다. 혈 청 저항에서 Vn 수집의 중요성을 평가, Vn 고갈 혈 청 (VDS)의 살 균 활동 정상적인 인간 혈 청 (NHS)의 비교 되었다. 쉽게 사용 하는 방법은 혈 청 저항에 따라 구속력이 박테리아 대 Vn-바인딩을 구분 합니다. 우리는 여러 가지 세균성 병원 체4,12의 혈 청 저항에 Vn의 역할을 연구 하기이 방법을 사용.
수많은 방법 호스트 병원 체 상호 작용 연구 보고 되었습니다. 여기, 우리는 적용할 수 있습니다 쉽게 어떤 병원 체의 연구를 병에 Vn의 역할 평가 프로토콜의 집합을 설명 합니다. 우리는 다양 한 병원 체를 사용 하 여 이러한 프로토콜을 테스트 하 고 Hif이이 보고서에 대 한 예제로 선정 되었다.
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Protocol
1. 세균성 표면 단백질 Ligand로 Vn의 분석
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Vn-바인딩 cytometry 사용 하 여 세균성 표면에서의 검출
참고: cytometry, 우리 사용 측면 분산형 및 앞으로 분산형 게이트 긍정적인 이벤트를. Vn와 상호 작용을 검사, Hif 임상 격리 (n = 10)7 대장균 BL21 함께 선정 됐다 (DE3) 부정적인 컨트롤 (그림 1A).- 문화 Hif 임상 10 µ g/mL 나드와 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 hemin 보충 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 매체에서 분리 합니다. Luria Bertani 매체를 사용 하 여 대장균14문화. 중간 로그 단계에서 Hif를 수확 (OD600 = 0.3)15, resuspend 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), pH 7.2, 1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (차단 버퍼;를 포함 하는 박테리아와 PBS-BSA). 10 서 스 펜 션 조정9 CFU/mL.
- 5 x 106 CFU 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브 (12 x 75 m m2)에 포함 된 aliquots를 전송 하 고 블로킹 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 박테리아, 펠 렛을 5 분 동안 실내 온도 (RT)16 에서 3500 × g 에서 정지를 원심 다음 신중 하 게는 상쾌한은 펠 렛을 방해 하지 않고 제거 하려면 발음.
- 블로킹 버퍼를 포함 하는 250의 50 μ와 세균 펠 릿 resuspend nM Vn 동요 없이 RT에 1 시간에 대 한 샘플을 품 어 고. 부 화, 후 5 분, 3500 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 작은 다음 PBS와 비슷한 원심 분리 단계를 사용 하 여 시간 3 펠 릿을 세척 합니다.
- 세균성 펠 릿 기본 양 반 인간 Vn polyclonal 항 체 (Pab)의 50 μ PBS BSA에 1: 100 희석에 추가 합니다. RT에 1 시간에 대 한 정지를 품 어 다음 세 번 (단계 1.1.3에서에서와 같이) 언바운드 항 체를 제거 하는 PBS 가진 박테리아를 씻어.
- 다음, 추가 PBS BSA 포함 fluorescein isothiocyanate (FITC) 50 μ-당나귀 안티 양 Pab (1: 100 희석)를 활용 하 고 어둠 속에서 1 시간에 대 한 RT에서 품 어.
- 버퍼만 및 Pab Vn 없이 차단 된 박테리아를 배양 하 여 빈 컨트롤을 준비 합니다.
- 박테리아 차단 버퍼의 1 mL로 세 번 세척 하 고 1.1.2 섹션에 설명 된 대로 원심 분리, 여 현 탁 액을 펠 렛. 마지막으로, resuspend와 PBS의 300 µ L 세균성 펠 릿 및 흐름 cytometry7에서 분석.
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재조합 PH 및 Vn 사이 상호 작용의 ELISA 분석
참고: 컨트롤 일반적인 바인딩 제외를 포함 해야 합니다. 인간 요인 H (FH) 또는 C4b 묶는 단백질 (C4BP)는 각각 양수와 음수 컨트롤로 사용 됩니다.- 각 50 별도로 인간의 단백질 (Vn, FH, 및 C4BP)의 희석 Tris HCl, pH 9.0 (코팅 버퍼)에 nM. Polysorp 결정 플레이트의 각 음에 단백질 해결책의 100 µ L를 분배. 뚜껑 접시 닫고 결정 플레이트 웰 스에 4 ° C에서 하룻밤 (16h) 촉진 단백질의 동원 정지를 저장 합니다.
- 싱크대 위에 거꾸로 기울이기로 결정 접시에서 솔루션을 삭제 하 고 세 번와 300 µ L의 PBS/웰 스를 씻어. 1 h 2.5% (w/v) BSA (PBS-BSA)를 포함 하는 PBS와 RT에 대 한 코팅된 우물을 차단 합니다.
- 차단 솔루션을 제거한 후 씻어 0.05% (v/v) 트윈 20 (PBST) 잘 당 포함 된 PBS의 300 µ L로 세 번 웰 스. 각 샘플에 산도 그 태그 잘 하 고 실시간에서 1 시간에 대 한 품 어 50 nM 재조합의 100 µ L를 추가 컨트롤 스에서 PBS BSA의만 100 µ L를 추가 합니다.
참고: 인코딩 Hif에서 PH lph 유전자 PCR에 의해 증폭 되었고 표현한 단백질의 C-말단에 6 × 그 태그를 추가 하는 pET26b 식 벡터에 복제. 재조합 벡터 표현에 대 한 대장균 BL21(DE3)로 변모 했다. Ni NTA 수 지는 재조합 단백질15정화 사용 되었다. - 단백질 해결책을 무시 하 고 우물 잘 당 PBST의 300 µ L로 세 번 세척 하 여 바인딩되지 않은 단백질을 제거 합니다. PBS-BSA 포함 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)의 100 µ L를 추가-반 그의 Pab (1시 10분, 000 희석)를 활용 하 고 실시간에 1 시간에 대 한 품 어
- 5% 아세톤 및 45% 메탄올 솔루션에서 tetramethylbenzidine을 용 해 하 여 20 m m 솔루션을 준비 합니다. 솔루션 B를 준비 하려면 19.2 g H2O의 1000 mL에 구 연산 분해 하 다음 코를 추가 하 여 4.25에 pH를 조정 30% H2O2의 230 µ L를 추가 합니다. 실시간에서 어둠 속에서 두 솔루션을 저장 그냥 사용 하기 전에 솔루션 ELISA 검출 시 약을 준비 하는 A의 9.5 mL 500 µ L 솔루션 B의 혼합.
- 세 번 잘 당 PBST의 300 µ L로 우물을 세척 하 고 100 µ L ELISA 검출 시 약의 각 음을 추가 하 여 항 원-항 체 복합물을 검출.
- 그래서 1 M H2의 50 µ L를 추가 반응을 중지 하4/well. 450에 우물의 광학 밀도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.
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재조합 PH 및 씨를 사용 하 여 Vn의 상호 작용 활동의 연구
- 제조업체의 지침11에 따라 연결 방법, 아민을 사용 하 여 아민 반응 센서에 인간의 Vn을 무력화.
- PBS를 사용 하 여 직렬 4 µ m 0에서 ligand (재조합 PH)을 희석 하 고 96 잘 블랙, 플랫 바닥 결정 플레이트에 결과 솔루션을 전송. 17씨 악기 사용 하 여 30 ° C에서 실험을 실행 합니다.
- BLI 데이터 분석 소프트웨어에서 데이터 폴더를 로드 합니다. '센서 선택' 옵션을 선택 합니다. 그럼, 선택 ' 잘 ' (PBS의 Vn 코팅 센서)에 대 한 참조 빼기.
- '기준선 y 축 정렬' 고 '보정 interstep 및 협회에 맞춤'을 선택 합니다. 눌러서 '프로세스 데이터' 분석 탭에서 자동으로 열립니다.
- 분석 탭에서 커브 피팅 아래 '협회와 분리' 옵션을 선택 합니다. 모델 선택 ' 1:1 바인딩 및 글로벌 피팅 '. ' 곡선 ' 하 고 피팅 데이터17내보내기를 누릅니다.
2. 세균성 부착에서 Vn의 역할의 특성
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Vn 코팅 유리 표면에 세균성 부착의 연구
- Vn에 PBS와 피펫으로 10 µ L 유리 현미경에이 솔루션의 한 방울으로 슬라이드의 2 µ g/mL 솔루션을 준비 합니다. 부정적인 통제로 인간 혈 청 알 부 민 (HSA)와 슬라이드 실시간 코트에서 30 분 동안 슬라이드에 건조 드롭을 수 있습니다.
- 단백질 코팅 유리 슬라이드 세 번 초과 uncoated 단백질을 제거 하는 PBS를 포함 하는 비 커에 2 초 동안 슬라이드를 담거 서 세척. 메 마른 플라스틱 페 트리 접시에 20 mL 신선한 Hif 문화 (1.1.1 단계에서 설명)를 추가 하 고 잠수함 Vn-문화 매체에서 HSA 코팅 유리 슬라이드 /. 20 rpm에서 떨고와 1 시간 동안 37 ° C에 요리를 품 어.
참고: Hif M10 및 Hif M10Δlph 성장 했다 초콜릿 한 천 배지 또는 BHI 액체 매체에서. Lph 돌연변이 대 한 매체는 10 µ g/mL 대15로 보충 되었다. - 부 화, 후 PBS로 채워진 비 커에 세 번 슬라이드를 잠수 하 여 바인딩되지 않은 모든 박테리아를 제거 합니다. 설명 된 대로 그램 얼룩에 의해 박테리아를 시각화 합니다.
- 그것을 기울이기 고 휴지에 가장자리를 감동 하 여 각 슬라이드에서 초과 PBS를 제거 합니다. 실시간, 3-5 분에 대 한 슬라이드를 건조 하 고 불꽃을 통해 각 슬라이드 세 번 전달 하 여 준수 박테리아를 고치십시오.
- 얼룩 쟁반에 두 손가락으로 가장자리에서 슬라이드를 누른 다음 3-4 방울 (200-300 µ L) 2.3% 크리스탈 바이올렛 솔루션을 추가. 대기 60 s, 다음 슬라이드 탭의 부드러운 스트림 아래 물 3-4 s에 대 한 세척.
- 슬라이드에 0.33% 요오드 솔루션의 3-4 방울을 추가 합니다. 1 분을 기다려 다음 수돗물의 부드러운 스트림 아래 슬라이드를 씻어. 조심 스럽게 압 지에 의해 슬라이드 건조.
- 75%가 소 프로필 알코올 및 25% 아세톤 슬라이드에 포함 된 탈색 솔루션의 3-4 방울을 추가 합니다. 5-10 s 후 수돗물의 부드러운 스트림 아래 슬라이드를 씻어.
- 기본 carbolfuchsin 솔루션의 3-4 방울 (200-300 µ L)를 추가 합니다. 1 분을 기다려 다음 수돗물의 부드러운 스트림 아래 슬라이드를 씻어. 압 지를 사용 하 여 슬라이드를 건조.
- 시각화 선택 확대18X 100에는 기름 침수 렌즈 가벼운 현미경 박테리아. Hif WT 및 Vn HSA 코팅 유리 표면에 돌연변이 박테리아의 부착을 비교 합니다.
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상피 세포에 박테리아의 Vn 종속 부착의 연구
참고:이 효율적인 준수 분석 결과 우리의 이전 연구4,7에 사용 되었다.- 문화 A549 세포 (유형 II 치조 상피 세포) 10% (vol/vol) 태아 종 아리 혈 청 (FCS) (완전 한 매체) 및 5 µ g/mL gentamicin 보충 F12 매체와 75 cm2 조직 배양 플라스 크에. 80% 합칠 때까지 3 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 플라스 크를 품 어 (confluency 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 셀에 의해 표면 범위를 시각화 하 여 예상할 수 있는). 다음 4 단계 분석 결과19,20대 한 상피 세포를 준비 하는 방법을 설명 합니다.
- 부드러운 소용돌이 의해 20 mL의 PBS로 두번 플라스 크에 세포 단층을 씻어. 플라스 크 표면에서 세포를 분리, 세포 분리 효소 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 플라스 크를 품 어 모든 플라스틱 표면에서 세포를 분리 하려면 손바닥으로 플라스 크를 누릅니다. 몇 번 위아래로 플라스틱 셀 덩어리를 분산.
- F12 완전 한 매체의 18 mL 플라스 크에 추가 하 고 전체 세포 현 탁 액 50 mL 메 마른 팔 콘 튜브를 전송. RT에서 200 x g 에 5 분 동안 세포 현 탁 액을 원심 및 삭제는 상쾌한. F12 완전 한 매체의 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
- 10 µ L 세포 현 탁 액의 제거 및 Eppendorf 관에 다음 Trypan 블루 솔루션의 90 µ L를 추가 합니다. hemocytometer 샘플 로드 (깊이 0.1 m m)는 coverslip 배치 후.
- 지역 A, B, C 및 D에에서 모든 가능한 셀 (16 사각형 이루어져 각 필드 및 각 광장 0.0025 m m2의 면적을가지고), 다음 셀의 평균 수를 계산 ([A + B + C + D] / 4). 다음 수식을 사용 하 여 밀리 리터 당 세포의 수를 계산.
실행 가능한 셀/mL = 평균 세포 수 × 104 × 희석 요인20.
참고: 여기, 희석 요인은 10 이다. - 103 셀/mL 사용 하 여 완전 한 중간 포함 5 µ g/mL gentamicin x 5.0에 세포 현 탁 액을 희석. 24 잘 셀 문화 접시의 각 음에 세포 현 탁 액의 500 μ를 분배. 셀 90% 합칠 때까지 5% CO2 에서 37 ° C에서 접시를 품 어.
- 세균 감염, 이전 우물에서 매체를 제거 (FCS), 없이 F12 매체 추가 그리고 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 실시간 장소 얼음 판에서 세 번 PBS의 500 µ L로 세포 단층을 세척 하 고 1 시간에 4 ° C에서 v n. 품 판의 10 µ g/mL를 포함 하는 미리 냉장된 F12 매체의 100 µ L를 추가. 제어 우물만 F12 매체를 추가 합니다.
- 부 화, 후 pipetting으로 솔루션을 삭제 하 고 갓 재배 Hif M10 문화 실시간 Resuspend에 1 mL의 PBS로 두 번 셀 레이어를 세척 (단계 1.1.1) F12 매체 (2 × 108 CFU/mL). 각 잘에이 세균 현 탁 액의 100 µ L을 추가 하 고 2 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
참고: 각 잘 약 2 × 105 A549 세포를 포함합니다. 감염, 세균성 CFU 추가 된 2 x 107 을 위한 100의 감염의 다양성에 대응 합니다. - Pipetting으로 매체를 제거 하 고 세 번 PBS 가진 A549 상피 세포를 씻어. 세포 분리 솔루션의 50 µ L/잘 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 접시를 품 어
- 다음, 효소 반응을 중지를 잘 당 F12 완료 중간의 50 µ L를 추가 합니다. 각 우물에서 포함 된 4 개의 유리 구슬 6 mL 유리 관 상피 세포 (≈100 μ [즉, 전체 볼륨])를 전송. 2 분 동안 vortexing에 의해 RT에서 셀 lyse
- 10 µ L 세포 lysate의 약 희석 10 µ L lysate의 F12 매체의 990 µ L을 추가 하 여. 초콜릿 한 천 배지로 희석된 샘플의 10 µ L 플레이트.
- 하룻밤, 초콜릿 한 천 배지에서 37 ° C를 품 어 다음 식민지를 계산 합니다. 각 식민지는 하나 CFU를 나타냅니다.
- 문화 A549 세포 (유형 II 치조 상피 세포) 10% (vol/vol) 태아 종 아리 혈 청 (FCS) (완전 한 매체) 및 5 µ g/mL gentamicin 보충 F12 매체와 75 cm2 조직 배양 플라스 크에. 80% 합칠 때까지 3 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 플라스 크를 품 어 (confluency 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 셀에 의해 표면 범위를 시각화 하 여 예상할 수 있는). 다음 4 단계 분석 결과19,20대 한 상피 세포를 준비 하는 방법을 설명 합니다.
3. Vn 종속 저항 인간 혈 청의 살 균 활동을 분석
- 상업적인 소스에서 구매 NHS입니다. 앞에서 설명한12VDS를 준비 합니다. 180 VDS 보충 nM Vn 해당 Vn 보 건국에 존재 하는.
- 보충 단백질을 비활성화 하기 위해 30 분 동안 56 ° C에서 NHS를가 열 하 여 열 비활성화 혈 청 (HIS)를 준비 합니다.
참고: 최적의 혈 청 농도 (5%)와 단계 3.3-3.7에서에서 설명한 분석 결과 대 한 보육 시간 (15 분)는 Hif15에 대 한 경험적으로 결정 했다;이 매개 변수는 다른 세균성 병원 체에 대 한 다 수 있습니다. - 중간 로그 단계로 (이 경우, Hif M10 돌연변이 Hif M10Δlph에) 박테리아 문화 (OD600 0.3 =). 10 분 동안 3500 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 작은.
- 우선 당 젤라틴 Veronal 버퍼 (DGVB ++, pH 7.3) 포함 2.5% (w/v) 포도 당, 2 mM MgCl2, 0.15 m m CaCl2및 0.1% (wt/vol) 젤라틴의 1 볼륨 세균 펠 릿 resuspend
- 1.5 x 10을 추가3 5% 혈 청을 포함 하는 DGVB ++ 의 100 µ L 박테리아의 CFU (보 건국, 그, VDS 또는 VDS + 180 nM Vn). 300 rpm에서 떨고와 15 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
- 0 분 (T0 샘플) 및 15 분 (Tt 샘플)와 초콜릿 한 천에 접시에 반응 혼합물에서 10 µ L aliquot를 제거 합니다. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
- 부 화, 후 접시에 식민지를 계산 합니다. 박테리아의 비율 살해12 다음 수식을 사용 하 여 계산: (TtCFU) / (T0에서 CFU) × 100.
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Representative Results
박테리아의 표면에 Vn 바인딩 cytometry에 의해 결정 되었다. 이 연구에서 임상 격리 된 테스트 모든 Hif 셀 표면에 Vn을 채용. 세포 표면에 Vn의 상호 작용은 대장균 부정적인 제어 스트레인 (그림 1A)에 대 한 관찰 되었다. 그림 1B와 같이 PH Hif 세포의 표면에 주요 Vn-바인딩 단백질 이다. WT Hif 긴장에 의해 Vn의 바인딩 M10 발생 변화는 인구에서 Hif M10Δlph Vn 바인딩되지 않은 고는 컨트롤과 유사 하 게 나타났다.
PH와 Vn 간의 단백질-단백질 상호 작용은 ELISA와 씨에 의해 견적 되었다. 재조합 PH 인간의 요소 H, Vn, 및 C4BP 바인딩할 허용 되었다 ELISA 격판덮개에 결정의 우물에 (부정적인 제어) 코팅. 바운드 PH를 사용 하 여 추정 되었다는 반대로 그의 Pab. 결과 명확 하 게 PH와 Vn 요인 H, C4BP에 비해 사이 중요 한 상호 작용을 표시 (그림 2A). PH와 Vn 간의 상호 작용은 씨를 사용 하 여 실시간으로에서 견적 되었다. 그림 2 B PH 센서 Vn 코팅 표면에 대 한 바인딩 응답 곡선을 보여 줍니다. 선호도 바인딩 (이 경우, Kd = 2.2 µ M) 정상 바인딩 활동에 데이터를 피팅 하 여 추정 되었다.
박테리아 세포 표면 (Hif M10Δlph) 전시에 PH의 표현 부족 감소 WT 셀 (그림 3A)에 비해 Vn 코팅 유리 표면에 부착. 또한, 상피 세포의 표면에 Vn의 존재는 크게 Hif (그림 3B)의 준수를 향상. 이러한 결과 표시 PH-Vn 상호 작용 세균 부착에 크게 기여.
Vn은 잘 알려진 보수 억제제 이다. 보완 억제 활동을 추정, 혈 청 중재 살인 존재에 시험 되었다 그리고 M10Δlph 돌연변이 세포 보다 더 높은 혈 청 저항을 전시 하는 WT Hif v n. 셀의 부재. 아니 박테리아의 존재에그의 (그림 4)사망 했다. 흥미롭게도, WT Hif 전시 VDS, 감소 된 생존 그리고 Vn의 보급 증가 세균 생존. 그러나, 그것은 세포 표면 (그림 4B) Vn 모집 하지 때문에 Hif M10Δlph 스트레인 Vn 고갈에 응답 하지 않았습니다. 이러한 결과 Vn 보완-중재 살인 (그림 4A-B)에서 박테리아를 보호 하는 중요 한 호스트 요소는 명확 하 게 보여 줍니다.
그림 1 : Haemophilus 함께 serotype f 바인딩합니다 표면 표현 박사 통해 Vn (A) 교류 cytometry 결과 Hif 임상 격리의 셀에 Vn의 바인딩 표시. 각 임상 분리 (5 x 106 CFU) 250 nM 인간 v n. 바인딩 ligand 양 안티-Vn Pab FITC 활용 당나귀 안티 양 2 차 항 체를 사용 하 여 검색 된 알을 품는. 대장균 BL21 (DE3) 부정적인 제어로 포함 되었다. 3 별도 실험, 및 오차 막대 triplicate 분석에서 평균 형광 강도 대표 sd. (B) 흐름 cytometry 히스토그램 WT Hif M10 및 PH 삭제 Hif M10Δ의 표면에 Vn의 바인딩을 보여 주는 데이터 제공 됩니다. lph 의 돌연변이 3 별도 실험 중 하나에서 대표적인 데이터 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 재조합 PH Vn에 바인딩합니다. (A) ELISA 결과 시연 Vn, FH, 및 C4BP 재조합 PH의 바인딩. FH C4BP 부정적인 제어로 사용 된 반면 긍정적인 제어로 사용 되었다. 단백질 단백질 상호 작용 분석, Vn, FH, 그리고 C4BP에서 아데닌 코팅 했다 (50 nM) 결정 접시의 우물에 농도. 다음, 50 nM 재조합 PH His6x 추가 되었습니다. 바운드 PH를 사용 하 여 HRP 활용 반 그의 Pab 감지 되었습니다. 표시 된 데이터는 3 개의 독립적인 실험에서 triplicate 분석의 의미 및 오차 막대 표시 sd. * * *, P≤0.001. Vn에 PH 바인딩 (B) BLIanalysis: 재조합 Vn는 AR2G 센서와 PH의 바인딩 활동에 움직일 수 (0.25-4 µ M) Vn에 라스 악기를 사용 하 여 기록 했다. 평형 선호도 상수 각 농도 평형에 대해 신호를 사용 하 여 계산 하며 데이터 안정-상태 활동에 따라 했다. 실험 3 번을 반복 했다 고 한 대표 집합 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : PH와 Vn 간의 상호 작용 강화 유리 표면 상피 세포 세균 준수. (A) Vn 코팅 유리 슬라이드 Hif의 준수를 보여주는 가벼운 현미경 이미지. 박테리아 시각화 했다 그램 얼룩에 의해. 3 개의 독립적인 실험 중 하나에서 대표 이미지 표시 됩니다. 이 패널은 면역학 저널7 에서 이전에 게시 하 고 여기 Immunologists의 미국 협회에서 허가로 재현. WT Hif m 10의 (B) 준수 존재와 부재의 Vn A549 상피 세포에 세포, 3 개의 독립적인 실험에서 triplicate 분석의 의미, 플롯 및 오차 막대를 나타내는 sd. *, p 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 혈 청 중재 살인에서 박테리아를 보호 하는 Hif 세포 표면에 보충 Vn. (A) WT Hif M10 그리고 돌연변이 Hif M10Δlph 5% 보 건국 또는 그의 15 분 동안 incubated 했다. VDS와 VDS triplicate 분석 3 개의 독립적인 실험에서 250 nM 정화 Vn. 데이터 대표 수단으로 보완 5%에서 Hif M10 (B) 저항 및 Hif M10Δlph 를 살 균 효과 및 오차 막대 sd. * * *, p ≤0.001; NS, 중요 하지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
세균성 병원 체 세포 표면에 Vn 모집를 보완 요인의 증 착 및 막 공격 복잡 한2의 완료를 방지 하기 위해이 보완 레 귤 레이 터. Vn 또한 기능 다리 분자 세균 표면 단백질 사이의 호스트 세포 표면 수용 체, 상피 세포의 표면에 고착 하 고 이후 국제화 중재 하 병원 체를 활성화 합니다. 이 연구에서 혈 청 저항 및의 향상을 제공에 i) 바인딩 Vn의 세균성 세포, ii) 단백질 단백질 상호 작용 및 선호도 상수의 표면 및 iii) Vn의 기능적 역할을 추정 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜 설명 호스트 세포의 표면에의 준수
Cytometry는 일반적으로 박테리아가 Vn 바인딩할 확인 하는 데 사용 하는 양적 기술입니다. 그러나, Vn 농도 Vn 바인딩 (용량과 다양 한 수용 체) 세균성 종에 따라 다를 수로, 낙관 되어야 한다. 여기서 설명 하는 분석 결과에 1-100 µ g/mL Vn의 선형 바인딩 및 채도 매개 변수 추정에 사용 되었다. WT Hif의 바인딩 패턴, Hif M10Δlph 돌연변이, 부정적인 컨트롤 대장균 세포의 비교 Vn 20 µ g/mL의 농도에 명확한 차이 보였다 (250 nM). 따라서,이 농도 모든 교류 cytometry 실험에 사용 되었다. 채도 포인트 이상의 농도에서 Vn 사용 하 여 긍정 신호를 생산할 수 있습니다. 1 차 및 이차 항 체의 희석 각 병원 체에 대 한 별도로 최적화 해야 합니다 또한. 좋은 신호를 표시 하는 항 체의 최대 희석 선택 되어야 한다. 이 연구에서 우리는 차단 에이전트로 2.5 %BSA 사용. 그러나, BSA 보편적인 차단 시 모든 병원 균에 적합 하지 않습니다. 경우 BSA 특이 항 체 상호 작용을 차단 하지 않습니다, 다른 차단 시 약 사용할 수 있습니다, 생선 젤라틴 등. 세균성 병원 체 세포의 표면에 Vn의 바인딩 종종 여러 수용 체21,22에 의해 중재 됩니다. 일부 수용 체 있다 높은 Vn 바인딩 선호도, 반면 다른 낮은 바인딩 선호도 전시할 수 있습니다. 따라서, 표면 단백질을 부호화 한 유전자의 삭제 하지 Vn 상호 작용 cytometry에 의해 평가에서 감소 될 수 있습니다. Cytometry 대신, 세균성 세포 표면에 단백질 바인딩 면역 형광 분석 결과 (IFA) 또는 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 검사 수 있습니다. Fluororeagent 활용 된 항 체의 photobleaching cytometry와 IFAs에 문제가 될 수 있습니다, 하지만 가장 성가신 샘플 준비를, 소개 하는 유물23,24의 실질적인 위험을 포함 한다. 흐름 cytometry 분석은 실제로 IFA 및 가장 간단 하 게 샘플 준비 프로토콜 및 짧은 시간 안에 많은 샘플 테스트의 가능성 보다.
ELISA (그림 2A)에 의해 셀 자유 체제에서 단백질 단백질 상호 작용 분석 했다 고 라스 (그림 2B). 모두에서 이러한 기술의 바인딩 파트너 중 하나 (씨)에 대 한 바이오 센서 또는 결정 플레이트 (ELISA)에 동원 되지 않았습니다. 라스와 ELISA의 장점은 단백질 단백질 상호 작용 그들의 네이티브 국가에서 방지 활성 바인딩 사이트 밖에 서 일반적인 상호 작용의 분석 수 있다는. 그러나 라스, 유틸리티, 동원 정지 기술 사용에 따라 제한 될 수 있습니다. 여기에 임의로 사용 하는 프로시저를 커플링 하는 아민 단백질의 표면에 노출 된 아민 그룹 그리고는 바이오 센서의 표면 사이 아 미드 유대를 형성 한다. 다양 한 방향에서 센서의 표면에 단백질 분자의 동원 정지 발생합니다. 이 1:1 바인딩 속도 론 모델을 적합 하지 않는 다른 유형의 바인딩을 발생할 수 있습니다. Biotin 센서를 선택 하 고 움직일 것을 재조합 형 단백질 streptavidin 태그를 추가 하 여이 문제를 해결할 수 있습니다. 라스의 안정성은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 비슷합니다. 협회와 분자의 분리는 어느 기술을 사용 하 여 실시간으로에서 측정할 수 있습니다. 그러나, BLI 장치 마이크로, 사용 하지 않는 이며 따라서 유지 하기 쉽다. 또한, 96 상호 작용 시험 될 수 있다 동시에 씨에 덜컥을 사용 하 여 한 번에만 4 개의 샘플을 테스트할 수 있습니다 반면 BLI 최적화 해야 하는 또 다른 중요 한 단계가입니다. 센서는 다시 사용 하는 경우 재생 조건 또한 최적화 되어야 합니다, 그 각 단백질 단백질 복합물을 위해 다를 수 있습니다. 이 연구에서 10 mM ethylenediaminetetraacetic 산 센서 재생에 적합 한 발견 됐다.
세균성 부착에서 Vn의 역할 Vn 코팅 유리 표면에 직접 사용 하 여 테스트를 했다. 이 방법은 어떤 세균성 병원 체에 대 한 바인딩 분석 하 채택 될 수 있다 그램 음성와-긍정적인 박테리아를 포함 하 여. 이것은 Vn에 바인딩하는 병원 체의 능력의 빠른 평가 제공 하는 semiquantitative 기술 이다. 합리적인 결과 얻으려면, Vn 코팅을 최적화 해야 합니다. 여기서 설명 하는 분석 결과에서 1, 2, 및 5 µ g/mL에서 Vn으로 코팅, 검사 그리고 2 µ g/mL이이 연구(그림 3)에서 실시 한 실험에 대 한 가장 적합 한 농도 이기 위하여 찾아냈다. 표면에 코팅 하는 초과 Vn 샘플 및 얼룩 동안 쉽게 박탈 될 수 있는 두꺼운 층을 만들 수 있습니다. 또한, 세균성 문화 하지 말았어야 셀;의 큰 덩어리 이 될 수 있다 vortexing 문화는 슬라이드에는 약 수를 추가 하기 전에 피해.
상피 세포의 표면에 세균성 부착 접시 카운트 기법은 (그림 3A)를 사용 하 여 시험 되었다. 이 분석 결과 또한 낙관 되어야 한다 신중 하 게 세균 부착에서 Vn의 역할의 관찰 수 있도록. Vn는 박테리아 (C-종점)에 대 한 다른 바인딩 사이트 (N 맨끝 RGD 바인딩 사이트)에서 표면 integrin 수용 체 세포. Integrins Vn의 바인딩 신호 및 integrin Vn 복잡 한1의 통풍 관을 유도합니다. 만약 이러한 단지는 박테리아 없이 내 면, 결과 해석 하기 어려운 것입니다. 따라서, Vn 4 ° c.에 상피 세포 단층에 추가 되어야 합니다. Vn는 상피 세포 표면에서 integrin 수용 체를 포화 하 고, 일단 무료 Vn 세균 Vn 종속 integrin 바인딩 차단 수 초과 Vn, 씻어 해야 합니다. 이 분석 결과에서 우리는 전체 세균 상피 세포와 관련 된 계산 추정 (즉, 구성 된 읽기 표면에 연결 된 및 박테리아 내 면). 이 분석 결과 gentamicin4치료에 의해 외부 및 세포내 세균성 인구 사이 구별을 확장할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜에 사용 되는 혈 청 살 균 분석 결과 이전에 게시 절차12,22에서 부분적으로 수정 되었습니다. 분석 결과에서 1.5 x 103 CFUs Hif 했다 15 분, 5 분 이상 앞에서 설명한 분석 결과(그림 4)에 대 한 보 건국 5%와 함께 알을 품을 여기, 설명 합니다. WT Hif와 산도 없는 isogenic 돌연변이 차이 보다 10 분에서 15 분 더 분명 했다. 따라서, 우리는이 특정 실험의 15 분 잠복기를 선택. 혈 청의 살 균 효과 혈 청 농도, 부 화, 그리고 박테리아의 수의 시간에 따라 달라 집니다. 모든 병원 체 전시; 혈 청의 살 균 활동을 피하에 대 한 주목할 만한 능력 다른 사람 적당히 저항 또는 민감한 될 수 있습니다 반면 일부 병원 체 혈 청을 완전히 방지 될 수 있습니다. 혈 청 농도 각 특정 병원 체 검사에 따라서 최적화 해야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 죽이 여기서 설명 하는 분석 결과 혈 청 혈 청 그람 양성 세포1,5에 아무 중요 한 살 균 효과가지고 있기 때문에 그람 음성 세균의 연구로 제한 됩니다.
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Disclosures
저자는 금융 충돌의 관심 있다.
Acknowledgments
이 작품 안 나 재단 에드윈 버거, Lars Hierta, O.E. 및 Edla 요한슨 재단, 스웨덴 의학 연구 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (부여 번호 K2015-57-03163-43-4, www.vr.se), 대학에서 암 재단 말 뫼, Physiographical 사회 (Forssman의 기초), 및 스 코 네 카운티 위원회의 연구 및 개발 재단에 병원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | dry block heating and cooling shaker |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm style |
| 5% CO2 supplied incubator | Thermo Scientific | BBD6220 | |
| 6 mL polystyrene round-bottom tube | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm style with cap |
| 24-well plates | BD Falcon | 08-772-1H | Cell culture grade |
| 30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Laboratory analysis grade |
| 75 cm2 tissue culture flask | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| 96 well black flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | Tissue culture treated µClear black plates |
| A549 Cell Line human | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Cell detachment enzyme (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-500ML | Cell Culture Grade |
| AR2G sensors | Pall Life Science | 18-5095 | Sensor to immobilized protein by amino coupling |
| Acetone | VWR | 97064-786 | Analysis grade |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Suitable for cell culture |
| Bibulous paper | VWR | 28511-007 | |
| Bio-layer interferometer | Pall Life Science | FB-50258 | Bilayer interferometry measuring equipment |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (C4b binding protein) | Complement Technology, Inc. | A109 | Bought as Frozen liquid form |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Carbol-fuchsin solution | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grade |
| Decolorizing solution | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli host (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Protein expression host |
| F12 medium | Sigma-Aldrich | D6421 | Cell Culture Grade |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 651154 | Cell analysis grade for research applications |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Suitable for cell culture |
| Normal human serum (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled human serum |
| FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies | AbD Serotec | STAR88F | Polyclonal |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Cell culture grade |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Suitable for cell culture |
| Hemocytometer | Marienfeld | 640210 | |
| HRP-conjugated anti-His tag antibodies | Abcam | ab1269 | Polyclonal |
| Human factor H | Complement Technology, Inc. | A137 | Bought as Frozen liquid form |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Frozen solution |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A1653-10G | lyophilized powder |
| Histidine affinity resin column (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Columns prepacked with Ni Sepharose |
| His-tagged PH | Recombinantly expressed and purified in our lab | ||
| Iodine solution | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Methanol | VWR | BDH1135-1LP | Analysis grade |
| Microscope | Olympus | IX73 | Inverted microscope |
| Microscope slides | Sigma-Aldrich | S8902 | plain, size 25 mm × 75 mm |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | DNA vector |
| Polysorb microtitre plates | Sigma-Aldrich | M9410 | For ELISA |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grade |
| Sheep anti-human Vn antibodies | AbD Serotec | AHP396 | Polyclonal |
| Shaker | Stuart Scientific | STR6 | Platform shaker |
| Tissue culture flask | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Thermomixer | Sigma-Aldrich | T3317 | Dry block heating and cooling shaker |
| Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | ELISA grade |
| Vitronectin (Vn) from human plasma | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | cell culture grade |
References
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
- Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
- Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
- Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
- Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
- Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
- Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
- Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
- Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4 (2005).
- Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
- Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
- Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
- Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
- Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).
