Summary
Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.
Abstract
Naast hun essentiële rol bij het genereren van ATP, mitochondriën ook als lokale calcium (Ca2 +) buffers strak reguleren de intracellulaire Ca2 + -concentratie. Om dit te doen, mitochondriën gebruik maken van de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (ΔΨ m) naar sekwestreren Ca 2+. De instroom van Ca 2+ in de mitochondriën stimuleert drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus, het verhogen van elektronen overdracht via de oxidatieve fosforylering (OXPHOS) complexen. Deze stimulatie stelt ΔΨ m, die tijdelijk wordt opgenomen als positieve calciumionen steekt de binnenste mitochondriale membraan in de mitochondriale matrix.
We beschrijven hier een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met behulp van confocale microscopie. Doordringbaar door de cellen, mitochondriale Ca2 + kanworden gemeten met de fluorescerende Ca2 + indicator Fluo-4, AM, met bepaling van de ΔΨ m met de fluorescente kleurstof tetramethylrhodamine, methylester, perchloraat (TMRM). Het voordeel van dit systeem is dat er zeer weinig spectrale overlap tussen de fluorescerende kleurstoffen, waardoor accurate meting van mitochondriale Ca2 + en m gelijktijdig ΔΨ. Met de opeenvolgende toevoeging van Ca2 + aliquots, mitochondrial Ca2 + opname kan worden gevolgd, en de concentratie waarbij Ca2 + induceert mitochondriale permeabiliteit transitie en het verlies van ΔΨ m bepaald.
Introduction
Mitochondriën spelen een belangrijke rol in het reguleren van intracellulaire Ca2 + -concentratie door als lokale Ca2 + buffers 1. Ca 2+ komt in de mitochondriën via het Ca 2+ uniporter, een proces gedreven door de elektrochemische gradiënt die over het mitochondriale binnenste membraan (ΔΨ m) 2 bestaat. Eenmaal in de mitochondriale matrix, kunnen Ca2 + oxidatieve fosforylatie activeren door het stimuleren drie snelheidsbeperkende dehydrogenases van de citroenzuurcyclus 3. Deze stimulatie stelt ΔΨ m, die tijdelijk wordt opgenomen als positieve calciumionen steekt de binnenste mitochondriale membraan in de mitochondriale matrix. Als de Ca2 + -concentratie in de mitochondriën erg hoog wordt, kan mitochondriale permeabiliteitsovergang worden gestart, waardoor de dissipatie van ΔΨ m, de cessation van oxidatieve fosforylering en de inductie van celdood signaalroutes 4.
De belangrijke rol die de mitochondriën spelen in de ruimtelijke buffering van cellulaire calcium maakt de nauwkeurige monitoring van mitochondriale calcium kritisch. Verschillende methoden zijn vastgesteld mitochondriale calcium, waaronder het gebruik van rhodamine gebaseerde kleurstoffen controleren. Een dergelijke kleurstof, Rhod-2, AM, is zeer effectief in verdeling naar de mitochondriën mitochondriale Ca2 + niveaus 5 meten 6. Wel moet erop worden gebruikt als een kleurstof ophopen in andere organellen, zoals liposomen of blijven in de cel cytosol. Niettemin kan stroomafwaarts analyses worden gebruikt om deze signalen te onderscheiden van die van de mitochondriën 7.
Een andere techniek om mitochondriale calcium monitoren gebruikt fluorescente reporter constructen 8 up>. Het voordeel van deze genetisch gecodeerde probes is dat ze specifiek naar de mitochondriën kan worden gericht door endogene N-eindstandige peptiden, bijvoorbeeld de N-terminale targeting signaal menselijke COX subeenheid VIII. Dit systeem is gebruikt om een mitochondriaal aequorine gerichte probe die uiterst nuttig voor het onderzoeken van mitochondriale calcium signaling 9 is gebleken genereren. Het belangrijkste nadeel van deze genetisch gecodeerde probes is dat ze moeten in de cellen door tijdelijke expressie worden ingevoerd (die niet haalbaar is voor bepaalde celtypes en kunnen variabele resultaten) of door stabiele expressiesystemen (die tijdrovend).
Om de hierboven geschetste problemen te omzeilen, hebben we een nieuw protocol ontwikkeld om mitochondriale Ca 2+ en ΔΨ m gelijktijdig meten. Dit protocol is gebaseerd op een eerder beschreven methode exogeen calcium bijdraagt aan gepermeabiliseerde cellens = "xref"> 10. Ons protocol heeft drie belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden: ten eerste maken we gebruik van Fluo-4, AM en TMRM om mitochondriale Ca 2+ en ΔΨ m, twee kleurstoffen die zeer verschillende spectrale eigenschappen volgen; ten tweede worden de cellen permeabel gemaakt zodat de Fluo-4 signaal alleen detecteert mitochondriale Ca2 + en Ca2 + niet gelokaliseerd op andere organellen en de cel cytosol; en ten derde, het gebruik van Fluo-4 mitochondriale Ca 2+ detecteren maakt een snelle en eenvoudige celkleuring, ontkennen elke cel transfectie of transformatie problemen die bestaan bij gebruik van genetisch gecodeerde probes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Cellen
- Kweek cellen op 10 cm celcultuurschalen of 75 cm2 kolven in kweekmedium [10 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 5% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1 x penicilline / streptomycine (P / S )] bij 37 ° C / 5% CO2.
- Om cellen te oogsten, verwijder media door aspiratie, daarna wassen met 5 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS). Verwijderen 1x PBS door afzuigen, voeg 1,5 ml 0,25% (w / v) Trypsine / 0,25% (w / v) ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende 2 min. Tik gerecht of de kolf voorzichtig om cellen te verwijderen, dan resuspendeer in 5 ml kweekmedium.
- Aantal cellen door toevoeging van 12 pi geresuspendeerde cellen op een hemocytometer.
- Plaat cellen in gerechten of chambered dekglaasjes voor confocale beeldvorming.
Opmerking: Deze zullen een geschikte kunststof of glazen bodem die is ontworpen voor gebruik met omgekeerde microscopen hebben. - Plaat cellen, zodat thbij ~ 80% confluentie bereikt op de dag van beeldvorming. Bijvoorbeeld ongeveer 2 x 10 4 143B osteosarcoom cellen kunnen worden uitgeplaat in een putje van een 8-well kamer dia één dag voor de beeldvorming.
- Incubeer cellen overnacht bij 37 ° C / 5% CO 2, zodat cellen te hechten en te herstellen.
2. Buffers voor TMRM en Fluo-4 Imaging
- Bereid Record Solution (RS) bevattende 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgSO4, 1,25 mM KH 2PO 4, 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl2 en 10 mM HEPES pH 7,35. Store RS in porties bij -20 ºC.
- Bereid Intracellulaire Medium (IM) bevattende 6 mM NaCl, 130 mM KCI, 7,8 mM MgCl2, 1 mM KH 2PO 4, 0,4 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM malaat, 2 mM glutamaat, 2 mM ADP en 20 mM HEPES pH 7,1. 200 mM voorraadoplossingen van malaat, glutamaat en ADP afzonderlijk worden bereid, in porties verdeeld en bewaard bij -20 ° C. deze stocks kan aan de IM worden toegevoegd vlak voor gebruik.
- Ca 2+ vrije Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) worden verkregen vooraf bereid uit commerciële leveranciers. Add ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N ', N'-tetraazijnzuur (EGTA) tot een eindconcentratie van 500 uM.
- Bereid een voorraadoplossing van 10 mM tetramethylrhodamine, methylester, perchloraat (TMRM) in 100% methanol. Vanuit deze voorraad, maak een werkvoorraad van 2 micrometer in gedestilleerd H 2 O.
- Bereid een voorraadoplossing van 10 mM verapamil in 100% ethanol.
- Maak een 1 mg / ml (w / v) voorraadoplossing van Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) in dimethylsulfoxide (DMSO).
LET OP: Fluo-4, AM is een calcium-indicator die vertoont verhoogde fluorescentie na binding Ca 2+. Fluo-4 is een analoog van fluo-3, met de twee chloorsubstituenten vervangen door fluoratomen. Dit resulteert in verhoogde fluorescentie excitatie bij 488 nm en fluorescentie hogere signaalniveaus. DeAM estergroep resulteert in een ongeladen Fluo-4 molecuul dat celmembranen kunnen doordringen. Eenmaal in de cel, wordt de AM ester gesplitst door niet-specifieke esterasen, resulterend in een geladen vorm van Fluo-4, dat wordt gevangen in de cel. - Bereid een voorraadoplossing van 1 mM p-carbonyl cyanide trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) in 100% ethanol.
- Bereid een voorraadoplossing van 25 mg / ml (w / v) digitonine in gedestilleerd H2O
- Bereid een voorraadoplossing van 100 uM thapsigargin in DMSO.
- Bereid een voorraadoplossing van 40 mM calciumchloride (CaCl2) in gedestilleerd H2O
3. kleuring van cellen met TMRM en Fluo-4, AM
- Bereid RS kleuroplossing met 20 nM TMRM, 5 ug / ml (w / v) Fluo-4, AM en 0,005% surfactant zoals Pluronic F-127 in RS.
Let op: dit is een niet-ionische oppervlakteactieve polyol dat het oplossen van Fluo-4, AM vergemakkelijkt. Opmerking: 10 uM verapamil kunnen ook worden toegevoegd aan inhibit TMRM uitvoer over de plasmamembraan multidrug transporter als het wordt uitgedrukt in het celtype geanalyseerd. - Verwijder kweekmedium uit cellen met een pipet en wassen met 100 ul 1x PBS.
- Verwijderen 1x PBS pipet en incubeer cellen in 250 ul RS kleuroplossing gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: Als het Fluo-4, AM komt in de cel, wordt de AM-ester gesplitst door cellulaire esterasen. Incuberen bij kamertemperatuur remt esterase activiteit, waardoor Fluo-4 AM naar de mitochondriën binnengaan. - Verwijder RS kleuroplossing met een pipet en was cellen in 100 ul Ca 2+ vrije HBSS om overtollig Fluo-4, AM en TMRM verwijderen.
- Bereid IM imaging oplossing met 25 ug / ml (w / v) digitonine, 200 nM en 1 uM TMRM thapsigargin in IM.
Opmerking: De concentratie van digitonine moet mogelijk worden aangepast dat permeabilisatie van het mitochondriale binnenmembraan kan worden ver- kregen. Dit kan empirisch worden bepaald door het bepalen van de intensiteitTMRM van het signaal bij verschillende concentraties digitonine. - Verwijder de Ca2 + vrije HBSS pipet en voeg 300 ul IM imaging oplossing voor de cellen. Laat cellen equilibreren bij kamertemperatuur gedurende 10 min. De cellen zijn nu klaar voor beeldvorming met CaCl2 toevoegingen.
4. Cell Imaging
- Plaats de schotel of chambered dekglaasje met cellen in IM imaging oplossing op een omgekeerde laser scanning confocale microscoop.
- Gebruik instelling op de microscoop lasers voor de excitatie en emissie spectra van TMRM en Fluo-4. Gebruik bijvoorbeeld 543 nm He-Ne en 473 nm argon laser lijnen respectievelijk prikkelen TMRM en Fluo-4. Gebruik een lage laservermogen van ongeveer 5% aan een foto-schade aan de cellen te minimaliseren.
- Stel microscoop om afbeeldingen te scannen elke 25 sec. Scan cellen voor 10 min naar basislijn metingen vast te stellen voor de TMRM en Fluo-4 signalen.
NB: De Fluo-4 signaal kan zwak of niet detecteerbaar bij rustende calcium concent zijnrantsoenen. - Voeg 3 ul van 40 mM CaCl 2 voorraadoplossing direct naar cellen in 300 ul IM weergaveoplossing (een 1: 100 verdunning) en meng voorzichtig met een pipet. Pauzeer de afbeelding scannen, terwijl het toevoegen en mengen van de CaCl2 indien nodig.
OPMERKING: De laatste vrije Ca2 + ionconcentratie [Ca 2,] in de IM beeldvormingsoplossing kan worden berekend met behulp van software zoals Maxchelator WEBMAXC Extended ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) of Chelator 11. Een gedetailleerde beschrijving van hoe de laatste vrije Ca 2+ ion concentratie te berekenen [Ca 2+] is beschreven in hoofdstuk 6 hieronder. - Doorgaan image scanning ongeveer 4 min, herhaal dan CaCl2 toevoegingen om de 4 min, totdat het gewenste TMRM of Fluo-4 signalen worden bereikt, meestal rond de 8 tot 10 toevoegingen.
- Met behulp van een pipet, voeg een 1: 100 verdunning van 1 mM FCCP (final concentration van 10 uM) direct naar cellen ΔΨ m verdrijven. Afbeeldingscellen nog eens 5 min. Het experiment is nu voltooid.
5. Image Analysis
- Zodra beeldvorming is voltooid, bepaalt de intensiteit van Fluo-4 en TMRM signalen via beeldanalyse software, bijvoorbeeld ImageJ software met de Bio-indelingen plugin (download 'bioformats_package.jar vanaf http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / en opslaan in de "C: Program Files ImageJ plugins 'folder).
- Open de imaging-bestand (bijvoorbeeld een .oif-bestand) in ImageJ. Klik op selectie gereedschap en selecteer een regio van belang (ROI) dat mitochondriën bevat. Gebruik de eerste TMRM signaal naar de ROI te selecteren.
- Open 'Analyze> Extra> ROI Manager', klikt u op 'Toevoegen' om de geselecteerde ROI voor verschillende meetwaardes bevatten. Meerdere ROI's kunnen worden geselecteerd op een enkel beeld voor de meting. Herhaal de vorige stappen totdat alle ROIdit is toegevoegd aan de ROI Manager.
- Klik op 'Meer> Multi Measure', zorg ervoor dat de 'Meet alle segmenten' is geselecteerd en dat 'One Row Per Slice' is uitgeschakeld, klikt u vervolgens op 'OK' om een tabel van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de TMRM en Fluo-4 signalen te verkrijgen voor elk ROI op elk tijdstip.
- Gebruik gegevens uit alle ROI op de gemiddelde intensiteiten en de standaardafwijking voor TMRM en Fluo-4 signalen berekenen.
6. Berekening van de laatste vrije Ca 2+ Ion Concentratie [Ca 2+]
- Het vrije Ca2 + ionconcentratie [Ca 2,] in de IM beeldvormingsoplossing kunnen worden bepaald met behulp van software zoals Maxchelator WEBMAXC Extended ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) of Chelator 11. Stel bijvoorbeeld de variabelen in WEBMAXC UITGEBREID als volgt: Temperatuur = 24 ° C, pH = 7.1, ionensterkte = 0,162, EGTA = 0,002 M, 0,01 M = HEDTA, Ca2 + = 0,0004 M en Mg2 + = 0,0078 M. Dit leidt tot een laatste vrije Ca2 + ionconcentratie [Ca 2,] van 62 nM . Merk op dat deze programma geen rekening kan houden met iedere variabele, zoals reagens zuiverheid, nauwkeurigheid van de metingen en de pH-bepaling. De meest nauwkeurige methode voor het bepalen van de vrije Ca2 + -concentratie is een gekalibreerde Ca2 + elektrode gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben dit protocol gebruikt om de gevolgen van een MT-ND5 mutatie op het vermogen van mitochondriën 143B verhogingen buffer calcium 12 onderzocht. In het hier getoonde voorbeeld, werden controle 143B cellen opgeladen met TMRM en Fluo-4, AM voor permeabilisatie met digitonine. Na 5 min imaging, acht achtereenvolgende toevoegingen van een 1: 100 verdunning werden van 40 mM CaCl2 exogeen gemaakt met de laatste vrije Ca2 + ionconcentratie [Ca 2+] berekend.
Na elke toevoeging CaCl2, de TMRM signaal af naarmate de instroom van Ca2 + ionen in de mitochondria verdwijnt het mitochondriale membraanpotentiaal ΔΨ m (figuur 1). ΔΨ m herstelt daarna als ademhaling verhoogd tot ΔΨ m handhaven. Dit gebeurt viermaal per CaCl
De mitochondriale calciumconcentratie (Fluo-4 signaal) begint toe te nemen na de tweede CaCl2 toevoeging bij de vrije [Ca 2,] in de media 0,32 pM (Figuur 2) bereikt. Elke volgende CaCl2 Bovendien veroorzaakte een geleidelijke verhoging van de mitochondriale calcium.
Beelden van de gelijktijdige metingen van ΔΨ m (TMRM, rood signaal) en mitochondriale calcium (Fluo-4, groen signal) getoond (figuur 3).
Figuur 1: Meting van mitochondriale ΔΨ m in digitonine gepermeabiliseerde 143B cellen met behulp van TMRM. 143B cellen werden voorgeladen met Fluo-4, AM en TMRM voordat permeabilisatie met digitonine. Een 1: 100 verdunning van 40 mM CaCl2 exogeen is in opeenvolgende porties toegevoegd. De laatste vrije [Ca 2+] in de media is geïndiceerd voor elke toevoeging (*). FCCP werd tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM toegevoegd na ongeveer 40 min. ΔΨ m rood wordt weergegeven, weergegeven door de relatieve intensiteit (RI) van de TMRM signaal. Gegevens zijn gemiddelde ± sd n = 3. Figuur is aangepast met toestemming van referentie 12. Klik hier om een grotere versio bekijkenn van deze figuur.
Figuur 2: Meting van mitochondriale calcium in digitonine gepermeabiliseerde 143B cellen met behulp van Fluo-4, AM. 143B cellen werden voorgeladen met Fluo-4, AM en TMRM voordat permeabilisatie met digitonine. Een 1: 100 verdunning van 40 mM CaCl2 exogeen is in opeenvolgende porties toegevoegd. De laatste vrije [Ca 2+] in de media is geïndiceerd voor elke toevoeging (*). FCCP werd tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM toegevoegd na ongeveer 40 min. Mitochondriale calcium groen wordt weergegeven, weergegeven door de relatieve intensiteit (RI) van de Fluo-4 signaal. Gegevens zijn gemiddelde ± sd n = 3. Figuur is aangepast met toestemming van referentie 12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en ΔΨ m in digitonine gepermeabiliseerde 143B cellen met behulp van Fluo-4, AM en TMRM. 143B cellen werden voorgeladen met Fluo-4, AM en TMRM voordat permeabilisatie met digitonine. Een 1: 100 verdunning van 40 mM CaCl2 exogeen is in opeenvolgende porties toegevoegd. De laatste vrije [Ca 2+] in de media is geïndiceerd voor elke toevoeging. Vertegenwoordiger confocale beelden die de gelijktijdige kleuring van ΔΨ m (TMRM, rood) en mitochondriale calcium (Fluo-4, groen). Merk op dat de Fluo-4 signaal moeilijk te detecteren in de rustende calciumconcentratie van 0,062 uM. Witte schaal bars = 10 pm. Cijfer is aangepast met toestemming van referentie 12.Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Calcium speelt een cruciale rol in vele celprocessen, waaronder spiercontractie, neuronale signalering en celproliferatie 13. Toename in cel calciumconcentraties worden vaak geassocieerd met energievraag, met calcium rechtstreeks kan stimuleren mitochondriale oxidatieve fosforylering ATP generatie 3 verhogen. Het is daarom van essentieel belang dat we de mogelijkheid hebben om effectief toezicht mitochondriale calcium accumulatie en om te kunnen vergelijken hoe deze functie wordt beïnvloed door zowel genetische factoren en farmacologische middelen.
Kritische stappen in het protocol
Dit protocol beschrijft het vermogen om mitochondriën calcium accumulatie en ΔΨ m monitoren gelijktijdig met Fluo-4, AM en TMRM. Tijdens het kleurproces is het essentieel om de cellen bij kamertemperatuur geïncubeerd om de effectiviteit van Fluo-4 optimaliseren AM opsporen mitochondriaalcalcium. Incubatie bij kamertemperatuur vermindert de activiteit van cytosolische esterasen, zodat ongeladen Fluo-4 AM de membranen passeren en voer de mitochondriale matrix. Omgekeerd incubatie bij 37 ° C verbetert de esterase activiteit in de cytosol, het afsplitsen van de AM ester een geladen Fluo-4 kleurstof die niet in staat zou zijn de membranen effectief passeren verlaten.
Zodra cel kleuring is uitgevoerd, worden de cellen ondergedompeld in IM imaging-oplossing. Deze oplossing heeft een hogere TMRM concentratie aangeeft dan de eerste RS kleuroplossing. Nu de cellen gepermeabiliseerd, de TMRM niet meer in evenwicht door het plasmamembraan. Daarom wordt de TMRM concentratie die in het IM imaging oplossing van het juiste evenwicht in het mitochondriale binnenmembraan bereiken. Het is ook kritisch in dit stadium thapsigargin in de IM imaging oplossing omvatten. Thapsigargin blokkeert het endoplasmatisch reticulum (ER) Ca 2+ ATPase, ervoor te zorgen dat de Fluo-4 signaal niet detecteert ER calcium.
Wijzigingen en het oplossen van problemen
Sommige celtypen kunnen de multidrug resistentie transporter (ook bekend als MDR1 en P-glycoproteïne) op hun plasmamembranen drukken. Dit eiwit is bekend fluorescente indicatoren, waaronder AM esterderivaten exporteren uit het cytosol van de cel 14. Als de vervoerder wordt uitgedrukt, zowel Fluo-4, AM en TMRM kunnen worden uitgevoerd uit de cel cytosol, wat resulteert in sub-optimale kleuring. Daartoe blokkeren, kan Verapamil worden toegevoegd aan de RS kleuroplossing aan de multidrug resistentie transporter blokkeren, remmen Fluo-4, AM en TMRM uitvoer tijdens het kleurproces.
Doordringbaar door de cellen te analyseren, Fluo-4, AM worden gebruikt om mitochondriale Ca2 + detecteren, zonder concurrerende signalen van andere organellen of cytosol. We routinematig gebruik van de niet-ionische detergent digitonine voor permeabilisatie in een concentratie van 25 ug / ml. Deze concentratie moet worden aangepast dat solubilisatie van de membranen niet optreedt. Dit kan empirisch worden bepaald door het bepalen van de intensiteit van de TMRM signaal bij verschillende concentraties digitonine. Als de concentratie van digitonine te hoog is, zal de mitochondriale membraan gedeeltelijk oplosbaar is, waardoor de TMRM signaal.
Beperkingen van de techniek
Een van de belangrijkste voordelen van dit protocol is dat met Fluo-4, AM mitochondriale calcium detecteren TMRM kan worden gebruikt voor het gelijktijdig meten ΔΨ m, met verwaarloosbare spectrale overlap tussen de twee kleurstoffen. Om de specificiteit van Fluo-4 voor mitochondriële calcium verlenen de cellen onderzocht moeten worden gepermeabiliseerde de cytosolische Fluo-4 signaal te elimineren. Dit permeabilisatie is een beperking van deze techniek. Terwijl de IM imaging oplossing clodichtbevolkt overeenkomt met de ionensterkte van de cel cytosol, kan niet volledig al zijn bestanddelen repliceren. Dit kan het resultaat beïnvloeden als specifieke cytosolische onderdelen nodig in het experimentele systeem dat wordt onderzocht. Zoals de cellen gepermeabiliseerd, het protocol niet geschikt langer experimenten meer dan 1 uur zijn.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / alternatieve methoden
Verschillende fluorescente kleurstoffen zijn ontwikkeld voor de beoordeling mitochondriale calcium 8. Deze kleurstoffen zijn eenvoudig te gebruiken en kan nuttige gegevens in een korte tijd. Hoewel deze kleurstoffen voornamelijk ophopen in de mitochondria, wat kan ophopen in andere organellen, zoals liposomen of in de cel cytosol blijft. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat deze andere signalen niet het mitochondriale calcium signaal beïnvloeden.
In dit protocol, mitochondrial Ca2 + wordt gemeten in gepermeabiliseerde cellen in aanwezigheid van thapsigargine. Het voordeel van deze methode is dat de cytosolische en ER calciumsignalen geëlimineerd. Bovendien permeabilisatie maakt het gebruik van Fluo-4, AM mitochondriale Ca2 + detecteren. Fluo-4 AM heeft weinig spectrale overlap met TMRM, waardoor mitochondriale Ca2 + en ΔΨ m worden gemeten gelijktijdig met deze twee kleurstoffen.
Mitochondrial Ca2 + kan ook worden gemeten met behulp van genetisch gecodeerde fluorescente reporters 8. Deze reporters kan worden gericht naar de mitochondriën, waardoor specifieke mitochondriale Ca2 + signalen. Genetisch gecodeerde probes moeten worden ingebracht in de cellen bestudeerd, die in sommige gevallen veel tijd en moeite te nemen. Omgekeerd, ons protocol maakt gebruik van de kleurstoffen Fluo-4, AM en TMRM, waardoor een snelle en eenvoudige cel kleuring om mitochondriale Ca meten
Toekomstige toepassingen of aanwijzingen na het beheersen van deze techniek
Mitochondriën handeling lokale calcium buffers intracellulaire calciumconcentraties de energiebehoefte van de cel regelen. Wanneer dit proces wordt verstoord, kan overmatige mitochondriale calciumopname mitochondriale permeabiliteitsovergang induceert, en de ineenstorting van ΔΨ m en de afgifte van pro-apoptotische moleculen die celdood inductie 4 leiden.
We presenteren een snelle en straight-forward-protocol voor het onderzoek van mitochondriale calcium en haar relatie tot ΔΨ m en de inductie van mitochondriale permeabiliteit transitie. Dit kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe deze mitochondriale parameters beïnvloeden pathogenese in een breed spectrum van menselijke ziekten, zoals diabetes 15 en leeftijdsgebondenneurodegeneratie aandoeningen zoals Alzheimer en ziekte van Parkinson 16. Bovendien kan dit protocol gebruikt worden om te onderzoeken hoe mitochondriale calcium en ΔΨ m beïnvloed door genetische defecten of giftige stoffen, en ook hoe deze effecten kunnen worden gemoduleerd door therapieën of geneesmiddelen die de mitochondriën gericht. Dit soort toekomstige experimenten kunnen belangrijke nieuwe inzichten in de rol bepalen dat mitochondriale calcium speelt in zowel menselijke gezondheid en ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Dr Kirstin Elgass en Dr Sarah Creed uit Monash Micro Imaging voor technische bijstand, en de Wellcome Trust en de Medical Research Council UK voor financiële steun. MMcK wordt ondersteund de Australian Research Council Future Fellowship Scheme (FT120100459), de William Buckland Foundation, The Australian Mitochondrial Disease Foundation (AMDF), The Hudson Institute of Medical Research en Monash University. Dit werk werd ondersteund door de Victoriaanse regering operationele infrastructuur Regeling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
- Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
- Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
- Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
- McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
- Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
- Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).
