Summary

Protocollen voor het visualiseren steroidogenic organen en hun Interactive Organen met Immunokleuring in de fruitvlieg<em> Drosophila melanogaster</em

Published: April 14, 2017
doi:

Summary

We beschrijven een protocol voor dissectie, fixatie en immunokleuring van steroidogenic organen in Drosophila larven en volwassen vrouwtjes steroïde hormonen biosynthese en haar reguleringsmechanisme bestuderen. Naast steroïdogene organen visualiseren we de innervatie van steroidogenic organen en steroidogene doelcellen zoals kiemlijn stamcellen.

Abstract

In meercellige organismen, wordt een kleine groep cellen begiftigd met een gespecialiseerde functie in hun biogene activiteit induceren van een systemische reactie op groei en reproductie. In insecten, het larvale prothoracale klier (PG) en de volwassen vrouwelijke eierstok spelen een essentiële rol in de biosynthese van de belangrijkste steroïde hormonen genaamd ecdysteroïden. Deze ecdysteroidogenic organen geïnnerveerd door het zenuwstelsel, waar de timing van biosynthese wordt beïnvloed door omgevingsfactoren. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren ecdysteroidogenic organen en hun interactieve organen in larven en volwassenen van de fruitvlieg Drosophila melanogaster, die een geschikt model voor het bestuderen steroïde hormonen biosynthese en haar reguleringsmechanisme biedt. Bekwame dissectie laat ons toe om de posities van ecdysteroidogenic organen en hun interactieve organen, inclusief de hersenen, de ventrale zenuw koord, en andere weefsels te behouden. Immunokleuring met eenntibodies tegen ecdysteroidogenic enzymen, naast transgene fluorescentie eiwitten aangestuurd door weefselspecifieke promoters zijn beschikbaar voor ecdysteroidogenic cellen te merken. Bovendien is de innervatie van de ecdysteroidogenic organen kan ook worden gelabeld met specifieke antilichamen of een verzameling van GAL4 drivers in verschillende soorten neuronen. Daarom kan de ecdysteroidogenic organen en hun neuronale verbindingen tegelijkertijd worden gevisualiseerd door immunokleuring en transgene technieken. Tot slot beschrijven we hoe kiemlijn stamcellen, waarvan de proliferatie en onderhoud worden gecontroleerd door ecdysteroïden te visualiseren. Deze methode draagt ​​bij aan beter begrip van steroïde hormonen biosynthese en de neuronale reguleringsmechanisme.

Introduction

In meercellige organismen, is een groep cellen begiftigd met een gespecialiseerde functie in hun biogene activiteit die essentieel is voor het hele lichaam. Hun taken te vervullen, elk weefsel of orgaan tot expressie brengt een reeks van genen betrokken bij hun functies en communiceert met andere weefsels hun activiteiten in het kader van de ontwikkeling orkestreren. Om dergelijke gespecialiseerde celfuncties en inter-orgaan interacties te karakteriseren, moeten we een groep cellen specificeren bij andere typen cellen die in de meercellige architectuur intact.

Een voorbeeld van dergelijke speciale organen een steroïdogene orgaan, waar veel biosynthetische enzymen mediëren de omzetting stappen uit cholesterol actieve steroïde hormonen 1. De meeste van deze enzymen genen specifiek tot expressie in steroïdogene organen en de biosyntheseroute wordt strak gereguleerd door verschillende externe stimuli via humorale ingangen en neuronale ingangen. Een keergesynthetiseerd, steroïde hormonen worden uitgescheiden in de hemolymfe en zijn gericht op vele weefsels en organen voor het reguleren van de expressie van diverse genen 2. Derhalve is de werking van een steroïdhormoon induceert een systemische reactie op homeostase, groei en voortplanting te behouden.

De functies van steroïdhormoon biosynthese en pleiotrope werkingen van steroïde hormonen te onderzoeken, kan Drosophila melanogaster worden gebruikt als een geschikt modelsysteem. Tijdens de larvale stadia, het insect steroïdhormoon, ecdysteroid wordt gebiosynthetiseerd in een gespecialiseerde endocrien orgaan genoemd prothoracale gland (PG) 3. In de PG verschillende ecdysteroidogenic enzymen specifiek katalyseren de omzetting meerdere stappen van cholesterol tot ecdyson, welke controles rui en metamorfose op het juiste ontwikkelingsstadia 4. Daarom wordt een dynamische verandering in ecdysteroid titer geregelddoor velen signaalwegen in reactie op omgevingsfactoren. Aan de andere kant, in het volwassen stadium, ecdysteroid speelt een essentiële rol in de fysiologie, met inbegrip van reproductie, slaap, het geheugen en de levensduur 5, 6, 7, 8. Het is bekend dat ecdysteroid actief gebiosynthetiseerd in de eierstok, reguleren de progressie van oogenesis 6, 7, 8, 9, 10, 11. Onlangs hebben we gemeld dat het aantal kiemlijn stamcellen (GSC) wordt beïnvloed door ecdysteroid en geslacht peptide signalering in respons op stimuli paring 12.

Krachtige instrumenten van D. melanogaster genetica en celbiologie, waaronder goed geannoteerde genoominformatie, binaire genexpressiesystemen en transgene RNAi technieken hebben het mogelijk om genen te identificeren essentiële biosynthese ecdysteroid de PG en eierstok 13, 14, 15. Zodra de ecdysteroidogenic genen zijn geïdentificeerd, kunnen de transcriptionele regulatie van deze genen en het dynamische lokalisaties van genproducten in de biosyntheseroute 16 onderzocht. Daartoe kwantitatieve reverse transcriptie-PCR, RNA in situ hybridisatie en immunohistologische analyse worden uitgevoerd. De toepassing van deze technieken is voorzien van een uitdagende taak; de uitgebreide dissectie van de PG of de eierstok. Met name de PG van de fruitvlieg relatief kleiner is dan die van andere insecten (zoals de zijderups en klap vliegen), dus moet oefenen de vitale vaardigheid van fruitvlieg dissectie voor bemonstering. Bovendien zijn zowel ecdysteroidogenic organen ontvangen innervaties van het centrale zenuwstelsel (CNS) 17, 18, 19, 20. Zo accurate anatomische analyse, de ecdysteroidogenic organen komen intact naast het centraal zenuwstelsel en andere organen, de neuronenverbindingen niet te verstoren gehouden.

Hier bieden we protocollen voor de dissectie en visualisatie van steroidogenic organen in D. melanogaster. Het leren van de dissectie techniek is het belangrijk uitgangspunt voor deze experimenten. Daarnaast kan men met succes het etiket van de steroidogenic organen evenals hun interactieve organen met een aantal antilichamen en GAL4 driver lijnen. Door gebruik te maken van deze technieken, materialen en genetica, kan men de uitgebreide mechanismen van steroïde hormoon biosynthese bestuderen.

Protocol

OPMERKING: De opzet van protocollen is getoond in figuur 1. 1. Dissectie van de larvale ringwartel (RG) NB: In D. melanogaster, die behoort tot cyclorrhaphous Diptera, de PG in een samengesteld endocrien orgaan genaamd de ring pakkingbus (RG, Figuur 2D). Aangezien het niet haalbaar dat de PG operatief wordt gescheiden van andere typen cellen (later besproken), een praktisch doel om een ?…

Representative Results

We gebruikten de bovenstaande protocollen om steroidogenic organen en hun interactieve organen in D. melanogaster larven en volwassen vrouwen te visualiseren. De opzet van protocollen is getoond in figuur 1. RG, inclusief PG (figuur 2D), kleiner en transparanter dan de hersenen en bevindt zich aan de voorste-dorsale zijde van de hersenen (Figuur 2A-C en 3A-E). De PG cellen te merken, hebben verschillende groepen verschillende typen antilichamen tegen ecdyst…

Discussion

We bestudeerden ecdysteroid biosynthese en haar reguleringsmechanisme in D. melanogaster, en bedacht een protocol voor dissectie en immunokleuring. De timing van ecdysteroïdrespons biosynthese wordt beïnvloed door omgevingsfactoren tot neuronale ingangen 33, dus is het essentieel om de innervatie van de organen ecdysteroidogenic houden met de hersenen, VNC en andere weefsels tijdens dissectie.

Zoals hierboven is beschreven, de D. melanogaster PG co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Reiko Kise en Tomotsune Ameku voor hun technische ondersteuning voor dit werk. We zijn ook dankbaar voor Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, de Bloomington Drosophila Stock Center, KYOTO Stock Center (DGRC) en de Developmental Studies Hybridoma Bank voor aandelen en reagentia. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan YSN van JSPS KAKENHI Grant Number 16K20945, The Naito Foundation, en Inoue Science Research Award; en door een subsidie ​​aan RN uit MEXT KAKENHI Grant Number 16H04792.

Materials

egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02  for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food  the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)  TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
Terumo syringe, 1ml TERUMO SS-01T
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  MB-50-10
fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system Carl Zeiss inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN Carl Zeiss It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

References

  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O’Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O’Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O’Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).

Play Video

Cite This Article
Imura, E., Yoshinari, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (122), e55519, doi:10.3791/55519 (2017).

View Video