Wir beschreiben ein Protokoll für die Präparation, Fixierung und Immunfärbung von steroidogenen Organen in Drosophila - Larven und erwachsenen Frauen Steroidhormon - Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus zu studieren. Neben steroidogenen Organe visualisieren wir die Innervation steroidogenen Organe sowie steroidogenen Zielzellen wie Keimbahn-Stammzellen.
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Methodenartikel
Protokolle für die Visualisierung Steroidogenic Organe und deren Interactive Organe mit Immunostaining in der Fruchtfliege
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In mehrzelligen Organismen wird eine kleine Gruppe von Zellen mit einer spezialisierten Funktion in ihrer biogenen Aktivität ausgestattet ist, um eine systemische Reaktion auf Wachstum und Vermehrung zu induzieren. Bei den Insekten, die Larven Prothoraxdrüse (PG) und die erwachsenen weiblichen Ovar wesentliche Rollen spielen in die Biosynthese der Hauptsteroidhormone genannt ecdysteroids. Diese ecdysteroidogenic Organe werden aus dem Nervensystem innerviert, durch welche der Zeitpunkt der Biosynthese durch Umweltreize beeinflusst wird. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung ecdysteroidogenic Organe und deren interaktive Organe in Larven und Erwachsene der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, die für das Studium Steroidhormon - Biosynthese und ihrer Regulationsmechanismus ein geeignetes Modellsystem zur Verfügung stellt. Geschickte Dissektion ermöglicht es uns, die Positionen der ecdysteroidogenic Organe und deren interaktive Organe einschließlich des Gehirns, der Bauchmark und andere Gewebe zu halten. Immunostaining mit einemntibodies gegen ecdysteroidogenic Enzyme, zusammen mit transgenen Fluoreszenzproteine durch gewebespezifische Promotoren angetrieben wird, stehen zur Verfügung ecdysteroidogenic Zellen zu markieren. Darüber hinaus kann die Innervation der ecdysteroidogenic Organe auch durch spezifische Antikörper oder eine Sammlung von GAL4-Treiber in verschiedenen Arten von Neuronen markiert werden. Daher können die ecdysteroidogenic Organe und die neuronale Verbindungen gleichzeitig durch Immunfärbung und transgene Techniken sichtbar gemacht werden. Schließlich beschreiben wir, wie Keimbahn-Stammzellen zu visualisieren, Proliferation und Wartung dessen werden durch ecdysteroids gesteuert. Dieses Verfahren trägt zum umfassenden Verständnis von Steroidhormon-Biosynthese und ihrem neuronalen Regulationsmechanismus.
Einleitung
In mehrzelligen Organismen wird eine Gruppe von Zellen mit einer spezialisierten Funktion in ihrer biogenen Aktivität ausgestattet ist, die für den ganzen Körper wesentlich ist. Um ihre Aufgaben zu erfüllen, jedes Gewebe oder Organ zum Ausdruck bringt eine Reihe von Genen, die Funktionen im Zusammenhang und kommuniziert mit anderen Geweben, ihre Aktivitäten im Zusammenhang mit der Entwicklung orchestrieren. Um solche spezialisierten Zellfunktionen und Interorgan Wechselwirkungen zu charakterisieren, müssen wir zusammen mit anderen Arten von Zellen, die eine Gruppe von Zellen angeben, wobei in der vielzelligen Architektur intakt gehalten.
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Protokoll
HINWEIS: Die allgemeine Systematik der Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Die Dissektion der Larval Ring Gland (RG)
HINWEIS: In D. melanogaster, die cyclorrhaphous Diptera gehört, wird die PG in einem zusammengesetztes endokrinen Organe der Ring Drüse (RG, 2D) genannt. Da es nicht durchführbar ist, dass die PG chirurgisch aus anderen Arten von Zellen (später diskutiert) getrennt ist, ist ein praktisches Ziel eine intakte, unbeschädigte RG durch Dissektion zu isolieren.
- Herstellung von Larven an den entsp....
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Ergebnisse
Wir haben die oben genannten Protokolle zu steroidogenen Organe und deren interaktive Organe in D. melanogaster Larven und erwachsenen Frauen sichtbar zu machen. Das Gesamtschema der Protokolle ist in Abbildung 1 dargestellt.
Die RG, einschließlich des PG (Figur 2D), ist kleiner und transparenter als das Gehirn und wird an der anterior-dorsalen Seite des Gehirns (2A-C und 3A-E) angeordnet sind . Um die PG - Zellen haben mehrere Gruppen erzeugen verschiedene.......
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Diskussion
Wir studierten ecdysteroid Biosynthese und ihren Regulationsmechanismus in D. melanogaster, und ein Protokoll für die Präparation und Immunfärbung entwickelt. Der Zeitpunkt der Ecdysteroid - Biosynthese wird durch Umweltreize durch neuronale Eingänge 33, beeinflußt , so ist es wesentlich , die Innervation der ecdysteroidogenic Organe zusammen mit dem Gehirn, VNC und anderen Geweben während der Präparation zu erhalten.
Wie oben beschrieben, bildet die D. m.......
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Offenlegungen
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken Reiko Kise und Tomotsune Ameku für ihre technische Unterstützung für diese Arbeit. Wir sind auch dankbar, dass Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stock Center, KYOTO Stock Center (DGRC) und der Entwicklungsstudien Hybridoma Bank für Aktien und Reagenzien. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse zu YSN von JSPS KAKENHI Grantnummer 16K20945, The Naito-Stiftung und Inoue Wissenschaft Forschungspreis unterstützt; und durch einen Zuschuss zu RN von MEXT KAKENHI Grantnummer 16H04792.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Eizellentnahme | |||
| Gewebekulturschale (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | für Traubensaft-Agar-Platten |
| Auffangbecher | HIKARI KAGAKU | ||
| Hefepaste | Orientalische Trockenhefe, Tokyo | ||
| 100% Traubensaft | Welch Food Inc. | ||
| aufziehende Larven | |||
| kleine Fläschchen (12ml, 40-fach; 23,5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| Einwegschlaufe | AS ONE | 6-488-01 | |
| Standard Fliegenfutter | die recepi uns auf der Website des Blooington Stock Centers. | ||
| dissektion | |||
| Präpariermikroskop | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Präpariermikroskop | Leica | S8 AP0 | |
| Gewebekulturschale (35 x 10 mm, unbehandelt) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | Coarting Silikon in Schalen | |
| Terumo Nadel (27G, 0,40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | Ein "Messer" zum Schneiden der |
| Gewebezange, Inox, #5 | Dumont, Schweiz | ||
| Insektenstift (0,18 mm Durchmesser) | Shiga Marke | für Filatdissektion | |
| Mikroschere | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixierend | |||
| Reinstwasser | Merck Millipore | ||
| phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | |||
| Formaldehyd | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyd | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Mikroröhrchen (1,5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Inkubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (Rocker) | As one | TM-300 | Rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (Meerschweinchen), 1:1000 | |||
| anti-GFP (Kaninchen), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa und Niwa, 2014 |
| anti-GFP (Maus mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (Kaninchen), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-HTS 1B1 (Maus) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| Anti-DE-Cadherin (Ratte), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| Anti-nc82 (Maus), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| Sekundärantikörper | |||
| Goat Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat | Life Technologies | A-11008 | |
| Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488-Konjugat | Life Technologies | A-11001 | |
| Ziegen-Anti-Ratten-IgG (H+L) Sekundär-Antikörper, Alexa Fluor 546-Konjugat | Life Technologies | A-11081 | |
| Ziegen-Anti-Meerschweinchen-IgG (H+L) Sekundär-Antikörper, Alexa Fluor 555-Konjugat | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 Farbstoff-konjugiertes Phalloidin | Life Technologien | A-22283 | |
| Einbettreagenzien | |||
| Mikro-Objektträgerglas | Matsunami Glass Ind., Ltd. | SS7213 | |
| Quadratisches Mikroskop-Deckglas | Matsunami Glass Ind., Ltd. | ||
| FluorSave Reagenz (Eindeckreagenz) | Calbiochem | 345789 | |
| Transferpipette 1 ml (Einwegpipette) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| Carl Zeiss | invertierter Axio Observer. Z1 SP left | ||
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | Es handelt sich um eine spezielle Benutzeroberfläche, die auf dem 64-Bit-Betriebssystem Microsoft Windows7 basiert | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#46260) | ||
| UAS– GFP; UAS– mCD8::GFP | Geschenke von K. Ito, Universität Tokio. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | siehe in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | aus dem Bloomington Drosophila Stock Center. Elektronikartikel (#51941) |
Referenzen
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell.....
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Nachdrucke und Genehmigungen
